夏勝應(yīng) 劉志雄

摘 要： 為深入研究春蘭 （Cymbidium goeringii） 與春蘭奇花品種花器官發(fā)育調(diào)控的分子機制，該研究采用同源克隆的方法，分別從普通的春蘭與春蘭奇花品種‘天彭牡丹的花芽中克隆得到1個cDNA長849 bp D類MADS-box基因CygoSTK（Genbank 登錄號為MH917912.1）。結(jié)果表明：該基因序列在兩種春蘭中高度一致，包含1個長705 bp的完整ORF，編碼1個由234個氨基酸殘基組成的STK進化系MADS-box轉(zhuǎn)錄因子;結(jié)構(gòu)分析表明，CygoSTK轉(zhuǎn)錄因子包含1個高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域（MADS domain）（1～57）和1個次級保守的K結(jié)構(gòu)域（91～172），其C末端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)含有兩個高度保守的基序，即AGI基序和AGⅡ基序;進一步用qPCR檢測CygoSTK基因在普通的春蘭與春蘭奇花品種‘天彭牡丹不同花器官中的相對表達量發(fā)現(xiàn)，CygoSTK基因在普通的春蘭和春蘭‘天彭牡丹子房中的表達量最高，顯著高于該基因在相應(yīng)品種其他花器官中的表達量（LSD，P<0.05）。以上結(jié)果說明CygoSTK基因在功能上有很強的保守性，主要參與春蘭子房的發(fā)育。

關(guān)鍵詞： 春蘭， CygoSTK基因， MADS-box， 花發(fā)育， 實時熒光定量

中圖分類號： Q943.2 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）04-0518-08

Abstract： In order to uncover the molecular mechanism of flower organ development regulation of Cymbidium goeringii and varieties with abnormal flower， a cDNA was cloned from the flower buds of the common C. goeringii and C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan by homologous cloning method. The 849 bp D-class MADS-box gene CygoSTK （Genbank accession number is MH917912.1）， which was high identity in C. goeringii and C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan， contained a 705 bp complete ORF， encoding 234 amino acid residues; Protein alignment and a phylogenetic tree grouped CygoSTK into the STK lineage. Structural analysis showed that CygoSTK transcription factor contained a highly conserved MADS domain （1-57） and a secondary conserved K domain （91-172）; In addition， the C-terminal transcriptional activation region of CygoSTK contained two highly conserved motifs： AGI motif and AGⅡ motif. Furthermore， the relative expression of CygoSTK gene in different floral organs of C. goeringii and C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan was detected by qPCR. Our data suggested that CygoSTK expression was the highest in the ovary of common C. goeringii and C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan， which was significantly higher than that of the other floral organs （LSD，P<0.05）. Our results indicate that the function of CygoSTK gene is highly conserved and CygoSTK is mainly involved in regulating the ovary development of C. goeringii.

Key words： Cymbidium goeringii， CygoSTK gene， MADS-box， ploral development， real-time quantitative PCR

春蘭（Cymbidium goeringii）是蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）地生蘭類植物，又名朵蘭、撲地蘭、幽蘭、朵朵香、草蘭，在我國有兩千多年的栽培歷史，因其資源稀有和花型獨特而成為人們最為喜歡的國蘭種類之一，是春蘭育種的重要方向（Xiang et al.， 2018）。普通（野生）春蘭主要分布在我國的長江流域及西南地區(qū)，日本和朝鮮半島也均有分布（陳君梅等，2016）。春蘭葉片飄逸、花姿高雅、花色素淡、香氣清幽，具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值，深受東南亞人們的喜愛（Zuo et al.， 2017 ; Han et al.， 2018）。我國春蘭栽培歷史悠久，自然變異類型豐富，積累了許多以花色、瓣型、花型、葉藝等形色各異的名貴種質(zhì)資源，形成了深厚的養(yǎng)蘭、賞蘭文化。開發(fā)和選育觀賞價值高的春蘭新品種，對于豐富我國春蘭種質(zhì)資源，弘揚和傳播國蘭文化等具有重要的科學意義和經(jīng)濟價值。

在春蘭傳統(tǒng)銘品中，春蘭‘天彭牡丹作為牡丹型奇花的代表，其唇瓣增多，合蕊柱無藥帽，由于其開花后酷似牡丹而備受國人青睞。前人對蘭科（Orchidaceae）植物意大利紅門蘭（Orchis italica）的研究發(fā)現(xiàn)，其SEEDSTICK（STK）同源基因OitaSTK對維持合蕊柱、胚珠和唇瓣形態(tài)的正常發(fā)育有重要作用（Salemme et al.， 2013）。在擬南芥中，STK是參與調(diào)控胚珠和種子正常發(fā)育的D類MADS-box基因，主要在胚珠和種子中表達（Hundertmark et al.， 2008）。研究春蘭花器官發(fā)育的STK基因的表達模式和功能，一方面有助于解析春蘭花器官形態(tài)建成分子基礎(chǔ)，為春蘭的花型改良和分子育種積累基因資源;另一方面為研究蘭科植物的花型演變積累資料。本研究以普通（野生）春蘭（Cymbidium goeringii）與春蘭奇花品種‘天彭牡丹（C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan）為材料，在克隆其D類MADS-box基因CygoSTK的基礎(chǔ)上，通過比較該基因在兩個春蘭品種花器官中表達模式的差異，分析該基因的表達差異與花型變異的相互關(guān)系，以期解析CygoSTK基因參與春蘭花發(fā)育調(diào)控的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

普通（野生）春蘭（Cymbidium goeringii）與春蘭奇花品種‘天彭牡丹（C. goeringii ‘Tian Peng Mu Dan）引種后種植于湖北荊州長江大學園藝園林學院人工氣候室。于2018年1月份分別取其當天開花的花朵，分別剝?nèi)〈禾m的花萼、花瓣、唇瓣、花粉塊、合蕊柱和子房和‘天彭牡丹的花萼、花瓣、唇瓣、合蕊柱和子房。將其按組織分開，取樣后迅速放于液氮中速凍，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 春蘭RNA的分離和第一鏈cDNA合成 采用EASY spin Plus多糖多酚復雜植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）分別提取春蘭與春蘭‘天彭牡丹花芽的總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）合成第一鏈cDNA，反應(yīng)體系和操作按照說明書進行。

1.2.2 春蘭CygoSTK基因的克隆 根據(jù)Genbank中已公布的蘭科植物STK同源基因的5′非翻譯區(qū)（5′ untranslation region， 5′UTR）和3′UTR的保守序列設(shè)計春蘭STK同源基因引物（表1），進行春蘭STK同源基因的全長擴增，擴增程序和陽性克隆的鑒定參考劉志雄和于先泥（2012）的方法。引物合成和測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.3 CygoSTK基因序列結(jié)構(gòu)分析 將分離得到的春蘭CygoSTK基因完整開放閱讀框（Open Reading Frame， ORF）編碼的蛋白在NCBI網(wǎng)頁上執(zhí)行BlastP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源搜索比對，選取來自不同被子植物的20個STK同源蛋白（表2），采用MEGA5.0軟件的鄰接法（NJ）構(gòu)建蛋白序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹。同時，選取擬南芥（Arabidopsis thaliana）的STK、矮牽牛（Petunia×hybrida）的FBP7、FBP11和球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）等8個物種的9個STK同源蛋白（表3），用BioEdit 7.2軟件中的ClustalW程序進行序列比對，進一步分析CygoSTK蛋白的結(jié)構(gòu)域。

1.2.4 CygoSTK基因的表達分析 在CygoSTK基因的非保守區(qū)域中設(shè)計引物，并以春蘭的CygoActin（GU181354.1）為內(nèi)參基因，設(shè)計內(nèi)參基因引物，檢測引物的特異性后，用實時熒光定量PCR技術(shù)（quantitative real time PCR，qPCR）檢測CygoSTK基因在春蘭不同花器官中表達的組織特異性，引物序列見表1。qPCR在CFX96（BIO-RAD，美國）熒光定量PCR儀上進行，反應(yīng)體系20 μL：ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL;上、下游引物各0.4 μL;cDNA模板0.4 μL;ddH2O 8.6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 15 s;40個循環(huán)。實時熒光定量采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒（購置于南京諾維贊生物科技有限公司），基因的相對表達量按照2-△△Ct法計算。用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種春蘭花結(jié)構(gòu)的分析

普通春蘭的花由3枚花萼、2枚花瓣、1枚特化的唇瓣、2個花藥構(gòu)成的花粉塊、1個合蕊柱和1個由3心皮合生的子房組成，其中花粉塊著生于合蕊柱上（圖1：A）。春蘭‘天彭牡丹的花結(jié)構(gòu)包括4個花萼、花瓣2至多數(shù)、唇瓣2至多數(shù)、合蕊柱頂端無花粉塊，子房外觀形態(tài)正常（圖1：B）。

2.2 春蘭CygoSTK基因全長cDNA序列的克隆

春蘭CygoSTK基因cDNA序列全長849 bp，包含1個長111 bp的5′UTR，1個長705 bp的ORF，編碼1個含234個氨基酸殘基的STK-like轉(zhuǎn)錄因子和1個終止密碼子，同時該序列還包含1個長33 bp的3′非翻譯區(qū)。命名為CygoSTK（Genbank登錄號為MH917912.1）。序列結(jié)構(gòu)分析表明，兩個品種中克隆得到的CygoSTK基因堿基序列完全一致。

2.3 蛋白同源序列比對與分子系統(tǒng)發(fā)生分析

分子系統(tǒng)發(fā)生分析與進化樹重建結(jié)果（圖2）表明，CygoSTK轉(zhuǎn)錄因子與9個被子植物共10個STK同源蛋白共聚于STK進化系， 是擬南芥STK直系同源蛋白，其與擬南芥的STK轉(zhuǎn)錄因子的序列相似性為57.87%，該轉(zhuǎn)錄因子與單子葉植物的STK同源蛋白聚于1個小的進化分支，其與蘭科植物球花石斛STK同源蛋白DthyrAG2的親緣關(guān)系最近，序列相似性高達88.46%，物種間的演化關(guān)系在進化樹上得到了很好支持。

蛋白同源序列比對結(jié)果（圖3）顯示，CygoSTK轉(zhuǎn)錄因子具有1個高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域（MADS domain）（1～57），1個次級保守的K結(jié)構(gòu)域（91～172），1個保守性較低的I區(qū)（58～90）。其M區(qū)有57個氨基酸，I區(qū)有33個氨基酸，K區(qū)有82個氨基酸，C區(qū)有62個氨基酸，其C末端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)含有兩個高度保守的基序，即AGI基序和AGⅡ基序，且在該蛋白的最末端發(fā)現(xiàn)了單子葉植物D類蛋白特有的MD基序（圖3）。這進一步證實CygoSTK蛋白屬于MADS-box基因家族中的D類蛋白。

2.4 春蘭CygoSTK基因在花器官中表達的組織特異性分析

qPCR檢測分析結(jié)果（圖4）顯示，在春蘭中CygoSTK基因主要在花瓣、唇瓣、花粉團、合蕊柱和 A. 春蘭; B. 春蘭‘天彭牡丹。

子房中表達，在花萼中僅能檢測到微弱的轉(zhuǎn)錄信號;其在子房中的表達量最高，均顯著高于其在其他花器官中的表達（LSD，P<0.05），在合蕊柱中的表達量其次，但均顯著高于其在花瓣、唇瓣和花粉團中的表達量（LSD， P<0.05）;同時，CygoSTK基因在唇瓣中的表達量顯著高于花瓣和花粉團（LSD，P<0.05），但其在花粉團中的表達與花瓣中的表達量卻無顯著差異。在春蘭‘天彭牡丹中CygoSTK基因主要在花萼、唇瓣、合蕊柱和子房中表達，在花瓣中僅能檢測到微弱的轉(zhuǎn)錄信號;與普通春蘭類似，CygoSTK基因在春蘭‘天彭牡丹子房中的表達量最高，均顯著高于其他花器官（LSD，P<0.05），在合蕊柱中的表達量次之，顯著高于花萼和唇瓣（LSD，P<0.05），同時在花萼中的表達量也顯著高于唇瓣（LSD，P<0.05）。從CygoSTK基因在兩種春蘭同類花器官表達的差異來看，CygoSTK基因在春蘭‘天彭牡丹的花萼中有明顯表達，而在普通春蘭花萼中僅能檢測到微弱的轉(zhuǎn)錄信號;在普通春蘭的花瓣中有明顯表達，而在春蘭‘天彭牡丹花瓣中僅能檢測到微弱的轉(zhuǎn)錄信號;但CygoSTK基因在普通春蘭唇瓣中的表達量卻顯著高于春蘭‘天彭牡丹（LSD，P<0.05）。從CygoSTK基因在普通春蘭和春蘭‘天彭牡丹合蕊柱與子房中的表達量來看，CygoSTK基因在普通春蘭子房中的表達量顯著高于‘天彭牡丹（LSD，P<0.05），但在兩個品種合蕊柱中的表達量卻無顯著性差異。

3 討論

在本研究中，獲得了春蘭與春蘭奇花品種‘天彭牡丹花器官發(fā)育相關(guān)的1個MADS-box基因CygoSTK。氨基酸序列比對、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，CygoSTK蛋白均含有典型的MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域，是高度保守的D類MADS-box蛋白。

在被子植物中，MADS-box基因表達模式的變化大多會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生重要影響（Kramer et al.， 2004）。在模式植物擬南芥中，STK基因主要在子房中表達，參與調(diào)控胚珠和種子的發(fā)育（Hundertmark et al.， 2008）。在石蒜科（Amaryllidaceae）植物中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）中，STK-like基因NtSTK主要在雌蕊中表達（吳菁華等，2015）。在薔薇科（Rosaceae）植物重瓣櫻花‘普賢像中，STK同源基因PrseSTK在花萼、雄蕊和雌蕊中表達，其在花萼中異位表達導致重瓣櫻花萼筒上著生異位子房，進而參與調(diào)控櫻花單瓣與重瓣花的形態(tài)差異（劉志雄和李鳳蘭，2015）。在棕櫚科植物油棕（Elaeis guineensis）中，其STK同源基因SHELL除參與調(diào)控果實形狀發(fā)育外，還參與種子油脂的合成（Singh et al.， 2013）。在蘭科植物中，文心蘭（Erycina pusilla）的STK同源基因EpMADS23在合蕊柱中的表達量顯著高于其他花器官組織（Dirks-Mulder et al.， 2017）。在小嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）中，STK-like基因PeMADS7僅在合蕊柱中表達，且表達時間相對較晚，PeMADS7轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出早花、葉片向上彎曲以及種子不育增加等現(xiàn)象（You et al.， 2012）。木石斛（Dendrobium crumenatum）的STK同源基因DcOAG2在合蕊柱、子房和花粉團中檢測到有表達，主要調(diào)控石斛蘭子房的發(fā)育（Xu et al.， 2010）。蝴蝶蘭（Dendrobium thyrsiflorum ）的STK同源基因PhalAG2在唇瓣、蕊柱、子房中均有表達，該基因與C類基因共同調(diào)控著蝴蝶蘭子房的發(fā)育（Song et al.， 2006）。石斛蘭的STK同源基因DthyrAG2在唇瓣、蕊柱和子房中均有表達，且在胚珠晚期的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用（Skipper et al.， 2006）。

在本研究中，CygoSTK基因主要在春蘭的唇瓣、花粉團、合蕊柱和子房中表達，其中在子房中的表達量顯著地高于其他花器官，表明CygoSTK基因?qū)Υ禾m子房的形成起著重要的調(diào)控作用。在春蘭奇花品種‘天彭牡丹中，CygoSTK基因主要在花萼、合蕊柱和子房中表達，CygoSTK基因在春蘭‘天彭牡丹花萼中表達量高可能與其花萼增多與形態(tài)變異相關(guān)，但具體的調(diào)控方式還有待于進一步研究。從CygoSTK基因在兩個春蘭品種花器官的表達模式來看，其主要在合蕊柱和子房中表達，但在子房中的表達量顯著高于其他花器官，在春蘭花發(fā)育過程中可能主要參與調(diào)控子房的發(fā)育。

綜上所述，CygoSTK基因的表達在功能上具有很強的保守性，主要參與春蘭子房的發(fā)育，同時對該基因的進一步研究對于春蘭花器官形態(tài)改造及定向的培育具有重要參考價值。

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（責任編輯 蔣巧媛）