周小華 周澤儀 李昆志

摘 要： 為探討外源抗壞血酸對鋁脅迫下水稻氧化損傷的影響，該文以峰1A（不育系，秈稻）和滇優(yōu)35號（雜交，粳稻）兩個水稻品種為材料，采用溶液培養(yǎng)法研究外源抗壞血酸（AsA） 對50 μmol·L-1 Al3+脅迫下水稻根尖H2O2和內(nèi)源AsA含量以及抗氧化酶活性的影響。結果表明：鋁脅迫24 h時，水稻根尖內(nèi)源AsA含量為對照的0.90倍，與對照相比，根尖H2O2增加了0.55倍至1.3倍，SOD、POD、CAT及APX活性分別增加了0.83倍至1.6倍、1.0倍至1.3倍、0.85倍至1.2倍、1.0倍至1.8倍;外源AsA處理鋁脅迫水稻24 h，水稻根尖內(nèi)源AsA含量為對照的1.2倍，SOD、POD、CAT及APX活性分別增加了1.2倍至2.2倍、1.5倍至1.6倍、1.3倍至1.7倍、1.2倍至2.6倍，根尖H2O2含量增加了0.1倍至0.6倍。這些研究結果說明鋁脅迫加劇了細胞膜的過氧化程度，并誘導抗氧化酶活性以清除活性氧，外源AsA通過提高抗氧化酶活性和內(nèi)源AsA含量以緩解水稻Al3+脅迫引起的氧化損傷，降低細胞膜系統(tǒng)傷害，促進水稻生長，為外源AsA提高水稻適應鋁脅迫能力提供了理論依據(jù)。

關鍵詞： 水稻， 鋁脅迫， 抗壞血酸， 活性氧， 抗氧化酶， 生理生化

中圖分類號： Q945.78 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）04-0526-10

Abstract： The aim of the experment was to study the effects of exogenous ascorbic acid（AsA） on oxidative damage of rice under aluminum（A13+） stress. A hydroponic experiment was conducted with the Peak 1A（sterile line， Indica） and Dian Superior 35 （Hybrid， Japonica） to study the effects of exogenous AsA on the contents of H2O2 and endogenous AsA and the activities of antioxidant enzyme in roots of the two rice varieties under 50 μmol·L-1 A13+ stress. The results showed that the content of endogenous AsA was 0.90-fold of the control， and the content of H2O2 was 0.55-fold to 1.3-fold， the activities of SOD， POD， CAT and APX were 0.83-fold to 1.6-fold， 1.0-fold to 1.3-fold， 0.85-fold to 1.2-fold， 1.0-fold to 1.8-fold higher than that of the control in roots of the two rice varieties under A13+ stress for 24 h， respectively. Under exogenous AsA treatment for 24 h， the content of endogenous AsA was 1.2-fold of the control， and the activities of SOD， POD， CAT and APX were 1.2-fold to 2.2-fold， 1.5-fold to 1.6-fold， 1.3-fold to 1.7-fold，1.2-fold to 2.6-fold higher than that of the control， respectively， while the content of H2O2 was only 0.1-fold to 0.6-fold higher than that of the control in rice roots. There results indicate that Al3+ stress can increase the degree of membrane peroxidation， and induced antioxidant enzyme activities to enhance the ability of scavenging ROS. While application of exogenous AsA not only could alleviate the oxidative damage induced by Al3+ stress， but also had a significant effect on reducing the damage of cell membrane system by enhancing antioxidant enzyme activities and AsA content， thereby promoting the rice growth， which provided theoretical information for exogenous AsA to improve the ability of rice to adapt to Al3+ stress.

Key words： rice， aluminum（Al3+）stress， ascorbic acid（AsA）， ROS， antioxidant enzyme， physiology and biochemistry

鋁是土殼中含量最豐富的金屬元素，在pH值高于5.5的土壤中，對植物無毒害作用，在pH值低于5.5的土壤中，鋁溶出量與土壤酸化程度成正相關關系，一般酸性土壤鋁濃度為10～400 μmol·L-1，微摩爾級的鋁會嚴重抑制植物根系的生長以及吸收氮、磷等營養(yǎng)物質的效率（Liu et al.，2014;Zhou et al.，2016），從而影響植物的生長和作物的產(chǎn)量。我國約有13%的水稻分布在酸性土壤上，鋁脅迫已成為酸性土壤中影響糧食作物生長和產(chǎn)量的主要脅迫因子（Guo et al.，2010;Kochian et al.，2015）。Matsumoto et al.（2013）指出，在無脅迫因子環(huán)境中生長的植物雖會產(chǎn)生少量活性氧（ROS），但不會對植物造成傷害。鋁脅迫下植物體內(nèi)大量積累ROS，對植物細胞造成氧化損傷，導致質膜結構破壞，同時誘導植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)參與響應鋁脅迫應答的調(diào)控機制，通過提高抗氧化酶活性清除過多的ROS，以維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡，修復鋁脅迫下植物細胞質膜結構，恢復細胞的正常生理功能。鋁脅迫下耐鋁型黑大豆的抗氧化酶活性高于鋁敏感型黑大豆，其膜脂受氧化損傷程度相對較輕，從而表現(xiàn)出更強的抗鋁性能（武孔煥等，2012）。鋁脅迫下柑橘通過增加SOD、CAT活性來增強ROS 的清除能力，緩解柑橘因鋁脅迫而導致的質膜過氧化程度，從而增強抗鋁脅迫能力（Li et al.，2016）。

通過外源物質調(diào)節(jié)鋁脅迫下水稻的生長已有相關報道，外源NO（吳坤等，2014）、外源草酸（劉擁海等，2008）、脫落酸和Ca2+（廖星昊，2005）能顯著降低水稻根尖H2O2等ROS含量和細胞電解質滲透率，有效降低了鋁對水稻根尖質膜的氧化損傷，維持穩(wěn)定的細胞膜結構。抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）是植物重要的非酶抗氧化劑，通過對外界刺激的識別、信號傳遞、基因表達和代謝調(diào)節(jié)等過程激發(fā)植物的防御機制，能清理植物體內(nèi)產(chǎn)生的ROS （Venkatesh et al.，2014），緩解環(huán)境脅迫對植物的毒害作用并促進植物生長發(fā)育和增產(chǎn) （Gul et al.，2015）。外源AsA可以增加大麥幼苗對鹽脅迫的抗性 （Agami， 2014），改善鉛脅迫秋葵的氧化防御能力（Hussain et al.，2017），提高鹽脅迫小麥的光合特性參數(shù)（Ashraf et al.，2008），顯著增強高溫脅迫水稻葉片（Shah et al.，2011）、干旱脅迫玉米（Dolatabadian et al.，2009）的抗氧化酶活性，表明外源AsA可以增強植物對逆境的適應能力，能參與植物適應逆境脅迫的調(diào)控過程。但是，有關外源AsA增強水稻抗鋁性能的生理響應機制還不完全清楚。本研究以耐鋁性不同的兩個水稻品種為材料，研究外源AsA對鋁脅迫水稻的氧化防御能力的影響，以闡明外源AsA緩解鋁脅迫水稻氧化損傷的作用方式，為科學評價外源AsA對鋁脅迫下農(nóng)作物生長提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

供試水稻（Oryza sativa）為峰1A（不育系，秈稻）和滇優(yōu)35號（雜交，粳稻）（云南農(nóng)業(yè)大學水稻研究所提供）。種子經(jīng)消毒、浸泡、催芽，將露白的種子轉移至0.5 mmol·L-1CaCl2溶液培養(yǎng)。待幼苗1葉齡時，用pH4.5的1/4濃度水稻營養(yǎng)液（IRRI，國際水稻所）培養(yǎng)1周，再轉移至pH4.5的水稻全營養(yǎng)液（周小華等，2016）培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)液。待水稻長至4葉1心時進行實驗，分別置于pH4.5含50 μmol·L-1 AlCl3的水稻營養(yǎng)液以及含50 μmol·L-1 AlCl3和2 mmol·L-1AsA（周小華等，2015）的水稻營養(yǎng)液處理不同時間。葉綠素及內(nèi)源AsA測定以無鋁無AsA處理組為對照;其他指標以有鋁無AsA處理0 h為對照。每個處理時間點做3個重復，取根尖（0～20 mm），液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 理生化指標測定

采用乙醇提取法測定葉綠素含量（陳建勛和王曉峰，2006）;采用硫代巴比妥法測定MDA含量（Chen et al.，2011）;采用分光光度法測定H2O2含量（Gay & Gebicki，2003）;采用鄰苯二酚紫（PCV）方法測定根尖鋁含量（Zheng et al.，2005）;采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量（張志良和瞿偉菁，2003）;采用氮藍四唑（NBT）還原法測定SOD活性（Giannopolitis & Ries，1977）;采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性（Chance & Mehley，1955）;參照Aebi（1984）的方法測定CAT活性;參照Nakano & Asada（1981）的方法測定APX活性;參照 Law et al.（1983）的方法測定內(nèi)源AsA含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel進行處理，數(shù)據(jù)差異性用Duncans法檢驗，P<0.05表示顯著差異。

2 結果與分析

2.1 AsA對鋁脅迫水稻根尖Al3+含量的影響

由圖1可知，兩種水稻根尖Al3+含量隨鋁脅迫時間的延長而逐漸增加，同條件下滇優(yōu)35號根尖鋁含量低于峰1A。外源AsA處理后，兩種水稻根尖Al3+含量都減少，與單一鋁脅迫組均有明顯差異。其中，處理24 h時效果最明顯，峰1A（圖1：A）根尖Al3+含量只有單一鋁脅迫組的0.58倍，滇優(yōu)35號（圖1：B）根尖Al3+含量只有單一鋁脅迫組的0.49倍。這表明外源AsA可以顯著降低鋁在水稻根尖的積累。

2.2 AsA對鋁脅迫水稻葉片葉綠素含量的影響

從表1可以看出，鋁脅迫峰1A水稻葉綠素a、b及葉綠素總量分別較對照減少了20.8%、14.9%和18.9%，葉綠素a/b減少了5.5%;使用AsA處理，葉綠素a、b及葉綠素總量分別較對照增加了23.7%、20.9%和22.8%，葉綠素a/b值基本與對照相同。鋁脅迫的滇優(yōu)35號水稻葉綠素a、b及葉綠素總量分別較對照減少了13.1%、10.4%和3.5%，葉綠素a/b減少了3.9%;使用AsA處理，葉綠素a、b及葉綠素總量分別比對照增加了22.3%、16.7%和21.1%，葉綠素a/b值增加4.7%。說明外源AsA可緩解鋁脅迫對水稻葉綠素的分解，且滇優(yōu)35號葉綠素a/b值增幅大于峰1A。由此可見，滇優(yōu)35號捕獲、轉化光能的能力比峰1A強，更有利于水稻光合作用。

2.3 AsA對鋁脅迫水稻根尖MDA及H2O2含量的影響

由表2可知，隨著鋁脅迫時間的延長，兩種水稻根中MDA和H2O2含量均呈增加趨勢。當脅迫處理96 h時，峰1A根尖的MDA和H2O2含量分別約為對照的3.8倍和4.0倍;滇優(yōu)35號根尖的MDA和H2O2含量分別約為對照組的3.7倍和2.0倍。AsA處理后，峰1A根尖中的MDA、H2O2含量分別降低到對照組的2.1倍和3.0倍;滇優(yōu)35號根尖中的 MDA、H2O2含量分別降低到對照組的2.7倍和1.7倍。這表明鋁脅迫時，兩種水稻的根尖MDA、H2O2含量增加，過氧化程度加劇。AsA處理水稻根尖MDA、H2O2含量在處理12 h后均有顯著降低，表明外源AsA可降低水稻鋁誘導產(chǎn)生的ROS，顯著降低膜脂過氧化程度，植株受到的鋁脅迫傷害得到有效緩解。不同小寫字母表示同品種水稻不同處理之間顯著差異（P<0.05）。下同。

2.4 AsA對鋁脅迫水稻根尖脯氨酸含量的影響

由圖2可知，鋁脅迫水稻根尖游離脯氨酸含量呈遞增趨勢。與單一鋁脅迫相比，AsA處理的根尖游離脯氨酸含量增加。峰1A（圖2：A）在處理12～48 h時有顯著增加，分別增加了0.3～0.5倍;滇優(yōu)35號（圖2：B）在處理6～96 h時有顯著差異，分別增加了0.2～0.4倍，兩種水稻在處理48 h時均達到最大值。峰1A在處理48 h后呈緩慢下降趨勢，而滇優(yōu)35號在處理48 h后基本保持不變，表明AsA能提高游離脯氨酸含量，能清除鋁脅迫產(chǎn)生的ROS，從而增強植物適應鋁脅迫能力。

2.5 AsA對鋁脅迫水稻根尖SOD、POD、CAT和APX活性的影響

SOD是清除自由基的細胞保護酶系統(tǒng)的中心，其活性的高低是機體抗逆能力的標志。兩種水稻根尖的SOD活性在處理48 h時達到最大，鋁脅迫峰1A（圖3：A）根尖的SOD活性是對照的2.8倍，AsA處理組的SOD活性為對照組的3.6倍;鋁脅迫滇優(yōu)35號（圖3：B）SOD活性為對照的1.9倍，AsA處理組的 SOD活性為對照的2.3倍。與單一鋁脅迫相比，AsA處理的兩種水稻根尖SOD活性在12～96 h時有顯著增加，表明AsA處理后，根尖SOD活性都有增加，植物清除ROS能力得到增強。

POD作為植物抗逆境過程中的一種適應性酶，在防御植物細胞膜過氧化以及降低細胞受傷害程度中發(fā)揮重要作用。峰1A（圖3：C）在鋁脅迫24 h時POD活性達到最大值，為對照的2.0倍，AsA處理組的POD活性為對照的2.5倍，與單一鋁脅迫相比，AsA處理的根尖SOD活性在12～96 h時有顯著增加;滇優(yōu)35號（圖3：D）在鋁脅迫48 h時POD活性達到最大值，為對照的2.3倍，AsA處理組的POD活性為對照組的2.6倍，與單一鋁脅迫相比，AsA處理的根尖SOD活性在24～48 h時有顯著增加。表明鋁脅迫處理能夠增加根中POD活性，而AsA處理能使這種增強作用更為明顯，表明POD可能參與AsA調(diào)控鋁脅迫的應答過程。

CAT在植物抗逆境脅迫中具有非常重要的作用。在鋁脅迫時，峰1A（圖3：E）根尖CAT活性呈現(xiàn)先升后緩慢下降的趨勢，根尖CAT活性在鋁脅迫24 h時達到最大值，為對照的2.2倍，AsA處理組的CAT活性為對照的2.7倍，與單一鋁脅迫相比，AsA處理3～96 h的根尖CAT活性有顯著差異;滇優(yōu)35號（圖3：F）根尖CAT活性呈現(xiàn)先增加后基本穩(wěn)定的趨勢，根尖CAT活性在鋁脅迫24 h時為對照的1.8倍，AsA處理組的CAT活性為對照的2.2倍，與單一鋁脅迫相比，AsA處理12～24 h時根尖CAT活性呈顯著差異。表明鋁脅迫能夠增強水稻根尖CAT活性，AsA處理能夠進一步增強根尖CAT活性。

APX是以AsA為電子供體的一種過氧化物酶，是清除過氧化氫的主要酶類。鋁脅迫的峰1A（圖3：G）根尖APX活性呈現(xiàn)先升后緩慢下降的趨勢，在鋁脅迫48 h時根尖APX活性達到最大值，為對照的2.8倍，AsA處理組的APX活性為對照的3.6倍，與單一鋁脅迫相比，AsA處理12～96 h的根尖APX活性顯著增加;滇優(yōu)35號（圖3：H）則呈現(xiàn)增加趨勢，在鋁脅迫48 h時根尖APX活性為對照的2.0倍，AsA處理組的APX活性為對照的2.2倍，與單一鋁脅迫相比，AsA處理3～24 h時根尖APX活性顯著增加。表明外源AsA處理的兩種水稻根尖APX活性都呈增加趨勢，能進一步清除過氧化物。

2.6 AsA對鋁脅迫水稻內(nèi)源AsA含量的影響

鋁脅迫96 h時的峰1A（圖4：A）根尖AsA含量為對照的0.35倍，添加外源AsA的根尖AsA含量為對照的0.56倍，為單一鋁脅迫組的1.6倍;鋁脅迫24 h的根尖AsA含量為對照的0.86倍，添加外源AsA的根尖AsA含量為對照的1.2倍， 為單一鋁脅迫組的1.3倍。鋁脅迫96 h時的滇優(yōu)35號（圖4：B）根尖AsA含量為對照根尖的0.79倍，AsA處理的根尖AsA含量為對照的0.94倍，為單一鋁脅迫組的1.2倍，鋁脅迫24 h時的根尖AsA含量為對照處理根尖的0.93倍，添加外源AsA的根尖AsA含量為對照的1.2倍，為單一鋁脅迫組的1.3倍。說明鋁脅迫降低了水稻根尖內(nèi)源AsA含量，外源AsA可提高兩個水稻根尖的內(nèi)源AsA含量，同條件下滇優(yōu)35號根尖AsA含量均高于峰1A。

3 討論

外源AsA有效地緩解了鋁脅迫對水稻幼苗光合作用的抑制作用。光合色素是植物光合作用過程中利用光能效率的一個重要參數(shù)，是表征光合作用優(yōu)劣的主要指標之一，其含量多少能夠反映植株光合能力的強弱。本研究中，峰1A葉片葉綠素含量低于滇優(yōu)35號，鋁脅迫降低了水稻葉片葉綠素a、b以及葉綠素總量，且葉綠素a下降幅度比葉綠素b大，從而使a/b值下降，降低了類囊體的垛疊程度，使水稻葉片捕獲、轉化光能的能力下降，光抑制作用增加，不利于光合作用的正常進行，與郭書奎和趙可夫（2001）的研究結果相似。外源AsA處理鋁脅迫的水稻24h，葉綠素a、b及葉綠素總量均有所增加，a/b比值也有所增加，主要原因可能是Al3+與合成葉綠素的膽色素原脫氨酶等結合（Asgharipour et al.，2011），使酶活性降低，葉綠素合成受到抑制，從而破壞葉綠體結構。鋁脅迫水稻總葉綠素含量降低的過程中，葉綠素a濃度降低更快，表明葉綠素a比葉綠素b對鋁脅迫的反應更為敏感。而外源AsA能在一定程度上降低葉綠素的分解，減輕鋁脅迫對葉綠體膜造成的傷害，提高葉綠素合成酶活性，增強水稻葉片捕獲、轉化光能的能力。

外源AsA可以降低鋁脅迫水稻下根尖的ROS含量。雖然少量的ROS對植物生長有一定的積極作用，可以抵御病原體侵入細胞和調(diào)控抗病相關基因的表達，但是ROS的積累量超過了抗氧化系統(tǒng)的清除能力時，就會對植物造成氧化損傷而影響植物生長，H2O2是植物氧化損傷的主要指標，MDA是質膜過氧化的產(chǎn)物，H2O2、MDA常作為反映植物質膜的氧化脅迫水平的重要生理指標，其含量多少與細胞膜的氧化損傷呈正相關系（Yamamoto，2019）。鋁脅迫導致植物根尖ROS含量增加，產(chǎn)生的氧化脅迫加劇了膜脂的過氧化程度（Huang et al.，2018;Fan et al.，2019;Muhammad et al.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫24 h的兩種水稻根尖MDA和H2O2含量顯著上升，峰1A根尖H2O2、MDA的含量分別比對照增加了3.0倍和2.8倍，滇優(yōu)35號根尖H2O2、MDA的含量分別比對照增長了1.0倍和2.7倍，峰1A根尖H2O2、MDA的含量高于滇優(yōu)35號，水稻根尖積累了更多的ROS，導致質膜過氧化水平提高，這與Kuo & Kao（2003）及Guo et al.（2013）報道的鋁脅迫下水稻植株MDA和H2O2含量上升的結論一致。外源AsA處理的峰1A根尖H2O2、MDA的含量只比對照增長了的2.0倍和1.1倍，滇優(yōu)35號根尖H2O2、MDA的含量只比對照增長了0.7倍和1.7倍，AsA可顯著降低根尖MDA和H2O2的積累，緩解了鋁脅迫對水稻造成的氧化脅迫的危害，提高水稻的耐鋁能力，表明外源AsA對水稻耐鋁的調(diào)節(jié)機制作用與ROS相關。

外源AsA能提高鋁脅迫水稻根尖的抗氧化酶活性。在環(huán)境脅迫條件下，植株為了抵御ROS引發(fā)的氧化脅迫，會啟動體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，如SOD、POD、CAT和APX等。抗氧化酶協(xié)同作用，清除體內(nèi)過多的ROS，從而保護植物免受氧化脅迫的傷害（Apel & Hirt， 2004），SOD在抗氧化酶系統(tǒng)中處于核心地位，是清除ROS的第一道防線，SOD可將O2- · 催化為較穩(wěn)定的H2O2和O2，在CAT、POD和APX等作用下，將H2O2分解為H2O和O2，從而維持植物體內(nèi)較低濃度的H2O2，減輕或解除質膜過氧化作用對細胞膜的損傷。本研究結果顯示，鋁脅迫導致兩個品種水稻根尖抗氧化酶活性增加，表明鋁脅迫在誘導氧化脅迫的同時，也誘導了抗氧化酶基因的表達，使抗氧化酶活性增加，研究結果與Guo et al.（2018）報道的鋁脅迫下柑橘中抗氧化酶活性增加一致，外源AsA可進一步提高兩種水稻根尖抗氧化酶活性，以清除更多的ROS，有助于維持細胞質膜的完整性和化學成分的穩(wěn)定性，進而提高水稻的抗氧化能力以緩解其氧化損傷，使水稻能更好地適應酸性鋁脅迫環(huán)境，滇優(yōu)35號根尖SOD、POD、CAT和APX的活性高于峰1A，可以誘導更多的抗氧化酶以清除ROS，從而增強其耐鋁性能，表明外源AsA通過調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)的抗氧化酶活性來調(diào)控水稻對鋁脅迫的應答反應。

外源AsA可提高鋁脅迫水稻根尖的內(nèi)源AsA含量。AsA是植物體內(nèi)的重要的抗氧化劑，可以直接或者間接的清理體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，參與植物對環(huán)境脅迫的改善，促進植物生長發(fā)育和增產(chǎn)（Venkatesh et al.，2014;Gul et al.，2015）。本研究結果表明，鋁脅迫處理96 h時，峰1A與滇優(yōu)35號根尖AsA含量分別為對照的0.35倍和0.79倍，峰1A根尖AsA含量下降幅度大于滇優(yōu)35號，而外源AsA處理可顯著增加兩種水稻根尖內(nèi)源AsA的含量，峰1A與滇優(yōu)35號根尖AsA含量分別為對照的1.61倍和1.19倍，但滇優(yōu)35號根尖內(nèi)源AsA的含量高于峰1A，外源AsA可提高水稻根尖內(nèi)源AsA含量，與Wang & Kao（2007）及 Ashraf（2008）等研究結論相似，表明外源AsA通過誘導更多的內(nèi)源AsA以平衡鋁誘導的ROS迸發(fā)，降低水稻根中ROS的含量，在鋁脅迫的應答過程中起重要的作用。

4 結論

綜上所述，滇優(yōu)35號水稻的耐鋁性能優(yōu)于峰1A;鋁脅迫誘導水稻體內(nèi)ROS的同時，也誘導抗氧化酶基因的表達，使抗氧化酶活性增加，清除更多的ROS，以增強水稻的抗鋁能力;外源AsA能進一步提高水稻根尖抗氧化酶活性和內(nèi)源AsA含量，清除ROS的能力得到進一步增強，從而提高植株的光合作用，有助于提高水稻的抗鋁性能。因此，外源AsA通過調(diào)控抗氧化酶活性和內(nèi)源AsA含量參與水稻應答鋁脅迫反應。

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（責任編輯 周翠鳴）