鄢黎，何鄉(xiāng)，馬澤康，李沛波，蘇薇薇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275)

近年來，人口老齡化日趨嚴(yán)重，與衰老密切相關(guān)的疾病如神經(jīng)退行性疾病已進(jìn)入高發(fā)期[1]。這類疾病嚴(yán)重的影響人們的身心健康，也給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，已然是目前亟待解決的關(guān)鍵問題。神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)理錯綜復(fù)雜，其中衰老引發(fā)的氧化應(yīng)激和自由基損傷是重要因素[2]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量增加，導(dǎo)致自由基失衡而引發(fā)細(xì)胞整體功能的退化和喪失[3]。自由基會對神經(jīng)細(xì)胞造成脂質(zhì)過氧化、生物膜損傷、核酸斷裂交聯(lián)損傷、蛋白質(zhì)損傷等一系列影響，誘發(fā)細(xì)胞損傷及凋亡[4]。因此，尋找具有抗氧化應(yīng)激作用的藥物對于延緩衰老及相關(guān)疾病的防治具有重要的臨床意義。

大量研究表明天然藥物中存在多種具有抗氧化活性的物質(zhì)，包括二萜類、多酚類、維生素類等小分子化合物。這類化合物具有來源廣泛，療效顯著，毒副作用低，生物利用度高等諸多優(yōu)點[5]。本課題組前期從具有益智和神經(jīng)保護(hù)作用的傳統(tǒng)中藥柏子仁中分離出二萜類活性單體櫻柏酸(communic acid, COM)，研究發(fā)現(xiàn)其對TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，但作用機(jī)制不明[6]。本研究將系統(tǒng)研究櫻柏酸抗氧化應(yīng)激的作用及機(jī)制，以期為櫻柏酸治療神經(jīng)退行性疾病提供相應(yīng)的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人神經(jīng)瘤細(xì)胞母細(xì)胞SH-SY5Y(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)研究所)；叔丁基過氧化氫(SIGMA-ALDRICH)；櫻柏酸(上海遠(yuǎn)慕)；MTS試劑盒(Promega)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)(碧云天，P0009)；乳酸脫氫酶檢測試劑盒(南京建成，A020-2)；超氧化物歧化酶測試盒(南京建成，A001-3)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒(南京建成，A005)；活性氧(ROS)測試盒(南京建成，E004)；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天，C0602)；人8-OHdG酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢華美)。

1.2 實驗方法

1.2.1 SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng) 人神經(jīng)瘤細(xì)胞母細(xì)胞株SH-SY5Y培養(yǎng)w=10%胎牛血清和w=1%雙抗(青/鏈霉素)的DMEM/High Glucose培養(yǎng)基，37 ℃、含φ=5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立 用含有不同濃度TBHP的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，TBHP終濃度分別為20、40、80和160 μmol/L；MTS法檢測：SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)各濃度TBHP處理24 h后，每孔加入20 μL Celltiter 96?AQueous 工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，之后用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度(A490)；計算SH-SY5Y細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

式中，As：實驗孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基，TBHP)；Ac：對照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基，不含TBHP)；Ab：空白孔(不含細(xì)胞和TBHP的培養(yǎng)基)。選擇細(xì)胞存活率約50%時濃度的TBHP處理SH-SY5Y細(xì)胞24h構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型。

1.2.3 染色檢測β-半乳糖苷酶 6孔板接種分組處理后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，PBS緩沖液洗滌1次，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min，吸出固定液并用PBS緩沖液洗滌3次、每次3 min，吸去PBS緩沖液，每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃避光封閉過夜，顯微鏡下計數(shù)β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞比例。

1.2.4 LDH釋放檢測 6孔板接種分組處理后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心15 min，取上清待測；LDH試劑盒檢測：設(shè)定空白孔，加入25 μL雙蒸水；設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔，加入5 μL雙蒸水和20 μL標(biāo)準(zhǔn)液；設(shè)定測定孔加入20 μL待測樣本和5 μL輔酶I；設(shè)定對照孔，加入5 μL雙蒸水和20 μL待測樣本。每孔加入25 μL基質(zhì)緩沖液，混勻后37 ℃溫育15 min，加入2,4-二硝基苯肼25 μL，混勻后37 ℃溫育15 min，加入250 μL 0.4 mol/L的 NaOH溶液，混勻后室溫放置5 min，用酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度。

1.2.5 櫻柏酸對TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響 用含櫻柏酸和80 μmol/L的TBHP培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞24 h，櫻柏酸濃度分別為4、8、16 μmol/L，每組設(shè)6個復(fù)孔；每孔加入20 μL Celltiter 96?AQueous 工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，之后用酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度，計算SH-SY5Y細(xì)胞存活率。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化離心后用培養(yǎng)基重懸，顯微鏡下計數(shù)，以1×105/孔接種于6孔板，實驗分為6組：空白對照組、模型組(80 μmol/L TBHP)、低劑量組(4 μmol/L櫻柏酸+80 μmol/L TBHP)、中劑量組(8 μmol/L櫻柏酸+80 μmol/L TBHP)、高劑量組(16 μmol/L櫻柏酸+80 μmol/L TBHP)、陽性對照組(8 μmol/L白藜蘆醇+80 μmol/L TBHP)；細(xì)胞過夜貼壁后，進(jìn)行相關(guān)處理，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞：吸去上清液，用胰酶消化并收集貼壁細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞一次，重懸計數(shù)10萬細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min；染色：加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，混勻，室溫下避光孵育15 min；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測：通過FITC通道(FL1)檢測Annexin V-FITC的綠色熒光，F(xiàn)L3通道檢測PI的紅色熒光。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平 6孔板接種分組處理后，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞：吸去上清液，用胰酶消化并收集貼壁細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞一次并重懸細(xì)胞；染色：每孔加入1 μL DCFH-DA，混勻，于37 ℃下避光孵育30 min；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.8 ELISA法檢測DNA損傷程度 分組處理后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心15 min，取上清待測；ELISA法檢測：室溫平衡試劑30 min，并用去離子水按1∶20比例稀釋濃洗滌液，設(shè)定空白對照孔不做處理；設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔加50 μL標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度設(shè)立2孔；設(shè)定檢測孔加入50 μL待測樣品。除空白對照孔外，每孔加入酶結(jié)合底物50 μL，不干膠封片，于37 ℃孵育1 h，手工洗板3次，每孔加入50 μL顯色液A和50 μL顯色液B，混勻后避光顯色15 min。每孔加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度。

1.2.9 細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力檢測 6孔板接種分組處理后，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心收集上清，用BCA法測定蛋白濃度。設(shè)定對照孔、空白對照孔、測定孔和測定空白孔，加入200 μL底物應(yīng)用液，混勻后37 ℃孵育20 min，用酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度。

1.2.10 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px酶活力檢測 6孔板接種分組處理后，冰浴下用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，離心收集上清，用BCA法測定蛋白濃度。設(shè)定對照管和測定管，加入試劑進(jìn)行酶促反應(yīng)，混勻后，3 500 r/min離心10 min，取1 mL上清液設(shè)定空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對照管和測定管作顯色反應(yīng)，混勻后室溫靜置15 min，用酶標(biāo)儀檢測412 nm吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.M)表示，采用SPSS16.0 分析軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計處理，用單因素方差分析(one-way ANOVA)做多組比較及組間兩兩比較。經(jīng)方差齊性檢驗后，方差齊同采用Bonferroni 法，方差不齊用Tamhane’s 法，以檢驗各組間差異的顯著性。P<0.05 則認(rèn)為存在顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型

用40、80和160 μmol/L的TBHP作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖1所示：與空白組相比，40、80、160 μmol/L TBHP均降低SH-SY5Y細(xì)胞存活率，且呈劑量依賴性，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其中80 μmol/L組損傷率約為50%，因此后續(xù)實驗以80 μmol/L的TBHP作用SH-SY5Y細(xì)胞24 h，作為構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的條件。

圖1 TBHP對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響Fig.1 The influence of TBHP on cell viability of SH-SY5Y cells 與空白組相比:##P<0. 01 ## P<0.01 compared with control group, values represent means±S.E.M, n=4

2.2 櫻柏酸對TBHP損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

MTS法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖2所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)；與模型組相比，中高劑量組櫻柏酸能提高TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。

圖2 櫻柏酸對TBHP所誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用Fig.2 Protective effect of communic acid on oxidative stress injury of SH-SY5Y cell induced by TBHP 與空白組相比:##P<0. 01;與模型組相比：*P<0.05 ##P<0.01 compared with control group; *P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=4

2.3 櫻柏酸改善TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型細(xì)胞衰老

染色檢測細(xì)胞衰老，結(jié)果如圖3所示：與空白對照組相比，模型組衰老細(xì)胞比例和程度增加；和模型組相比，中高劑量組櫻柏酸能降低TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型衰老細(xì)胞比例和衰老程度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。

2.4 櫻柏酸減輕TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型細(xì)胞膜的損傷

檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH含量，結(jié)果如圖4所示：與空白對照組相比，模型組LDH含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)；與模型組相比，櫻柏酸能減少TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型細(xì)胞LDH釋放，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。

2.5 櫻柏酸抑制TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

通過Annexin V-FITC/PI染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖5所示：與空白對照組相比，模型組晚期細(xì)胞凋亡率增高(P﹤0.01)；與模型組相比，中高劑量組櫻柏酸能降低TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞晚期細(xì)胞凋亡率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。

圖3 櫻柏酸改善TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞衰老Fig.3 Communic acid improves cell senescence in SH-SY5Y cells induced by TBHP(A)空白組；(B)模型組(80 μmol/L TBHP刺激)；(C)低劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+4 μmol/L櫻柏酸)；(D)中劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L櫻柏酸)；(E)高劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+16 μmol/L櫻柏酸)；(F)陽性藥組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L白藜蘆醇)；與空白組相比:##P<0. 01; 與模型組相比：*P<0.05(A) control group; (B) model group(treated by 80 μmol/L TBHP); (C) low concentration group (treated by 80 μmol/L TBHP+4 μmol/L COM); (D) medium concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L COM); (E) high concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+16 μmol/L COM); (F):positive group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L RES),##P<0.01 compared with control group;*P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=4

圖4 LDH法檢測櫻柏酸對TBHP 誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活性影響Fig.4 The effect of communic acid on TBHP-treated SH-SY5Y cells by LDH assay 與空白組相比:#P<0. 05; 與模型組相比：*P<0.05 #P<0.05 compared with control group; *P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=4

2.6 櫻柏酸減少TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型細(xì)胞內(nèi)ROS水平

用DCFH-DA 染料處理細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果如圖6所示：與空白對照組相比，模型組細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增；與模型組相比，4 μmol/L櫻柏酸能降低TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P﹤0.05)，中高劑量組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著性降低(P﹤0.01)。

2.7 櫻柏酸減輕TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型細(xì)胞DNA損傷

檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中8-OHdG含量，結(jié)果如圖6所示：與空白對照組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中8-OHdG含量增加；與模型組相比，櫻柏酸能降低TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型細(xì)胞培養(yǎng)上清液中8-OHdG的含量，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)。

圖5 櫻柏酸抑制TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡Fig.5 Communic acid against apoptosis of SH-SY5Y cells induced by TBHP(A)空白組；(B)模型組(80 μmol/L TBHP刺激)；(C)低劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+4 μmol/L櫻柏酸)；(D)中劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L櫻柏酸)；(E)高劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+16 μmol/L櫻柏酸)；(F)陽性藥組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L白藜蘆醇)；與空白組相比:#P<0. 05; 與模型組相比：*P<0.05(A) control group; (B) model group(treated by 80 μmol/L TBHP); (C) low concentration group (treated by 80 μmol/L TBHP+4 μmol/L COM); (D) medium concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L COM); (E) high concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+16 μmol/L COM); (F) positive group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L RES),##P<0.01 compared with control group;*P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=3

圖6 櫻柏酸降低TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS水平Fig.6 Communic acid decreases the intracellular ROS level on TBHP-induced ROS accumulation in SH-SY5Y cells(A)空白組；(B)模型組(80 μmol/L TBHP刺激)；(C)低劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+4 μmol/L櫻柏酸)；(D)中劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L櫻柏酸)；(E)高劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+16 μmol/L櫻柏酸)；(F)陽性藥組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L白藜蘆醇)；與空白組相比: #P<0.05; 與模型組相比：*P<0.05,**P<0.01(A) control group; (B) model group(treated by 80 μmol/L TBHP); (C) low concentration group (treated by 80 μmol/L TBHP+4 μmol/L COM); (D) medium concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L COM); (E) high concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+16 μmol/L COM); (F) positive group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L RES), ##P<0.01 compared with control group;*P<0.05,**P<0.01 compared with model; group values represent means±S.E.M,n=3

2.8 櫻柏酸提高TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)能力

檢測細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px酶活力，結(jié)果如圖8所示：與空白對照組相比，模型組SOD和GSH-Px酶活力降低；與模型組相比，中高劑量組櫻柏酸能提高TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激模型細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px酶活力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。

3 討 論

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS所介導(dǎo)的生物分子損傷會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及衰老，是誘發(fā)衰老及神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵因素[7]。因此，使用抗氧化劑抑制ROS的產(chǎn)生是延緩衰老及治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的有效途徑。叔丁基過氧化氫(TBHP)是一種常見的過氧化物，產(chǎn)生的羥自由基可引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，刺激大量ROS生成，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，目前被廣泛用于氧化應(yīng)激損傷模型的建立[8]。

圖7 櫻柏酸減輕TBHP誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞DNA損傷Fig.7 Communic acid inhibits 8-OHdG generate of SH-SY5Y cells induced by TBHP 與空白組相比:##P<0. 01; 與模型組相比：**P<0.01 ##P<0.01 compared with control group;**P<0.01 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=3

圖8 櫻柏酸提高TBHP誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力Fig.8 Communic acid increases intracellular antioxidant enzyme activity in SH-SY5Y cells induced by TBHP(A) 櫻柏酸對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)SOD活性的影響;(B) 櫻柏酸對SH-SY5Y細(xì)胞GSH-Px活性的影響；與空白組相比:##P<0. 01; 與模型組相比：*P<0.05(A)Effect of Communic acid on intracellular SOD activity in SH-SY5Y cells; (B) Effect of Communic acid on intracellular GSH-Px activity in SH-SY5Y cells.## P<0.01 compared with control group;* P<0.05 compared with model group; values represent means±S.E.M, n=3

櫻柏酸是廣泛存在于松柏類植物的活性單體。文獻(xiàn)報道，櫻柏酸能通過抑制MMP-1的表達(dá)來防止膠原蛋白降解，具有抗皮膚光老化作用[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)櫻柏酸對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，故本實驗選用80 μmol/L TBHP 作用SH-SY5Y細(xì)胞24 h建立氧化應(yīng)激損傷模型，來研究櫻柏酸抗氧化應(yīng)激損傷的作用及機(jī)制，并使用天然抗氧化劑白藜蘆醇作為陽性對照藥[10-11]。β-半乳糖苷酶是評價衰老的重要指標(biāo)，通過染色檢測其染色率和染色程度研究櫻柏酸對TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型細(xì)胞衰老比例和細(xì)胞衰老程度的影響，結(jié)果表明，櫻柏酸能延緩TBHP誘導(dǎo)SH-SY5Y氧化應(yīng)激損傷模型細(xì)胞衰老。因此，櫻柏酸具有潛在抗氧化應(yīng)激損傷延緩細(xì)胞衰老的作用。本研究通過MTS法檢測細(xì)胞活性，結(jié)果顯示櫻柏酸能提高細(xì)胞的活性。為了進(jìn)一步研究櫻柏酸的抗氧化應(yīng)激損傷作用，本實驗通過檢測細(xì)胞外乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量，來考察細(xì)胞膜的完整性，結(jié)果再次證實櫻柏酸能明顯提高氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞的活性。氧化應(yīng)激造成的損傷最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]，因此本實驗檢測了細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果表明，櫻柏酸可以抑制TBHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由此可見，櫻柏酸對TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

ROS是導(dǎo)致細(xì)胞活性下降和細(xì)胞膜損傷的關(guān)鍵因素[13]，本研究發(fā)現(xiàn)櫻柏酸能降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。ROS引起的DNA過氧化會導(dǎo)致基因突變，影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和微管的穩(wěn)定性。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是指示DNA堿基對的改變的特異性物質(zhì)[14]。本實驗通過測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中8-OHdG的含量，來考察細(xì)胞DNA氧化應(yīng)激損傷的程度。結(jié)果表明，櫻柏酸能減輕氧化應(yīng)激所致的SH-SY5Y細(xì)胞DNA損傷。同時，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的失衡也會導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)是人體代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性抗氧化劑，在生理水平下能抑制ROS的產(chǎn)生，維持人體代謝平衡，延緩衰老及預(yù)防各種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[15]。而隨著機(jī)體的衰老，體內(nèi)SOD和GSH-Px的含量大幅下降，最終導(dǎo)致各類慢性病的產(chǎn)生，如能及時補(bǔ)充外源性的抗氧化劑，抑制體內(nèi)SOD和GSH-Px含量的減少，能有效抑制ROS氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而減緩機(jī)體衰老進(jìn)程及預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[16]。本實驗對細(xì)胞內(nèi) SOD 和 GSH-Px 的活力檢測結(jié)果顯示，櫻柏酸能提高體內(nèi)抗氧化酶 SOD 和GSH-Px 的含量。說明櫻柏酸能通過增強(qiáng)細(xì)胞自身對氧化應(yīng)激的防御能力，來起到保護(hù)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)櫻柏酸減輕TBHP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及延緩細(xì)胞衰老進(jìn)程，其作用機(jī)制可能通過減少ROS對細(xì)胞膜和DNA等氧化應(yīng)激損傷、同時提高體內(nèi)源性氧化劑SOD和GSH-Px活力起效。本研究有助于闡明櫻柏酸作為天然抗氧化劑抗細(xì)胞損傷延緩衰老的作用機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病和抗衰老藥物等臨床藥物的提供了相關(guān)理論及實驗依據(jù)，具有重要的社會和經(jīng)濟(jì)價值。