朱麗穎 鄭月萍 徐雪珍 段芊芊 韓妮莎

摘要：CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一項(xiàng)基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，但對特定CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的編輯效率進(jìn)行有效評估的方法仍十分匱乏，本研究的目的是建立一種準(zhǔn)確、簡便測定CRISPR/Cas9基因編輯效率的方法。在我們的方法中，將與種子專一表達(dá)啟動子（2S3）連接的mCherry熒光蛋白報告基因作為選擇基因，并以編碼脂肪酸脫氫酶FAD2的基因?yàn)榘行蛄?然后對經(jīng)CRISPR/Cas9編輯的擬南芥種子進(jìn)行脂肪酸組分分析，根據(jù)其組分變化計算該方法的編輯效率。結(jié)果顯示，利用mCherry熒光蛋白報告基因的種子專一表達(dá)特性，可簡便快速地篩選陽性的初級轉(zhuǎn)化子和后代的無轉(zhuǎn)基因突變子;而種子油脂分析法能快速、準(zhǔn)確地鑒定CRISPR/Cas9編輯的突變體，可以精確地檢測出核酸長度小至單個堿基對的突變，用該方法獲得的CRISPR/Cas9基因編輯效率（54.5%～74.1%）遠(yuǎn)高于基于聚丙烯酰氨凝膠電泳法獲得的編輯效率（3.7%～15.4%）。說明，該方法檢測CRISPR/Cas9基因編輯效率的高效性與可行性。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9;基因編輯;突變體篩選;脂肪酸組分分析

中圖分類號：Q784文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0299-07

Abstract： In recent years， CRISPR/Cas9 gene editing technology is a fast-growing gene targeted editing technology， but there are few effective methods the evaluate its editing efficiency. The purpose of this study was to establish an accurate and convenient method for determining the gene editing efficiency. In our assay， the mCherry fluorescent protein reporter gene under the control of a seed-specific promoter （2S3） was employed as a selection gene， and a gene encoding the fatty acid desaturase FAD2 was used as the target sequence for editing. The editing efficiency of the CRISPR/Cas9 method was subsequently determined through monitoring the alteration in the seed fatty acid composition of Arabidopsis plants subjected to the gene editing. The results showed that the seed-specific expression of the mCherry fluorescent protein reporter gene allowed us to quickly and easily screen for the positive primary transformants and the transgene-free progeny. Moreover， seed oil analysis enabled us to quickly and accurately identify the mutants edited by CRISPR/Cas9， including those with a single-base insertion or deletion. The efficiency of CRISPR/Cas9 based gene editing measured based on seed oil analysis （54.5%-74.1%） was much higher than that measured based on polyacrylamide gel electrophoresis analysis （3.7%-15.4%）. The above results demonstrate the effectiveness and feasibility of the present method for determining the efficiency of CRISPR/Cas9 gene editing.

Key words：CRISPR/Cas9;gene editing;mutant screening;fatty acid composition analysis

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究創(chuàng)建新材料方面是一個非常有價值的工具。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)需要Cas9蛋白，與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的導(dǎo)向RNA（gRNA）以及在目標(biāo)序列中存在NGG原間隔子相鄰基序（PAM）位點(diǎn)[1-2]。簡而言之，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯利用20 bp gRNA，通過堿基配對將Cas9核酸酶導(dǎo)向靶位點(diǎn)，Cas9切割目標(biāo)位點(diǎn)以產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB），然后在DNA修復(fù)過程中引入突變。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)首先應(yīng)用在人類與動物細(xì)胞系中，隨后被改造應(yīng)用于植物（如擬南芥、煙草、高粱、水稻、小麥、玉米等）基因組的定向編輯研究中，已經(jīng)開發(fā)了幾種CRISPR載體用于植物基因組編輯[2-9]。已有研究結(jié)果表明，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可以成功地在植物物種中產(chǎn)生各種遺傳突變并獲得了較高的誘導(dǎo)率和可穩(wěn)定遺傳的基因編輯植株[10-11]。

然而隨著基因編輯模型數(shù)量的增加，如何快速、高效地獲得大量具有預(yù)期突變的陽性植株并對基因突變進(jìn)行檢測，特別是進(jìn)行高通量的篩選，制約了基因編輯技術(shù)的發(fā)展。同時，在商業(yè)化應(yīng)用之前，對某一特定的編輯載體進(jìn)行評估有利于該載體的廣泛推廣。此外，在發(fā)掘新的Cas9蛋白的過程中也急需一種評估其切割效率的方法。因此，開發(fā)一種快速、高效且經(jīng)濟(jì)的檢測方法顯得尤為重要[12]。

目前已經(jīng)報道了許多用于鑒定CRISPR/Cas9基因編輯突變體的方法，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）/限制酶（RE）檢測法[13]，T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ（T7EⅠ）檢測法，Surveyor核酸酶檢測法[14]，基于高分辨率熔解（HRM）分析檢測法[15-17]。但這些方法在實(shí)踐中往往存在耗時多、昂貴或誤報率高的問題。目前，廣泛采用的是基于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）的基因分型檢測法，該方法不依賴于異源雙鏈體的形成，并且能可靠地檢測靶位點(diǎn)處的突變[18]，既可用于鑒定新突變，還可用作常規(guī)基因分型。但是，該方法對于檢測堿基替換或者單個堿基對突變的靈敏度有限。因此，本研究提出了一種高效評估CRISPR/Cas9編輯載體編輯效率的方法，該方法能在高效檢測突變體的情況下，對堿基替換和單個堿基的突變有著更好的檢測效果，并且在操作復(fù)雜度，準(zhǔn)確度，性價比方面均較現(xiàn)有方法有所提升。

1材料與方法

1.1CRISPR/Cas9 載體的構(gòu)建

在Wang等[19]報道的新型的CRISPR/Cas9編輯載體的基礎(chǔ)上，我們對其進(jìn)行了改造，主要是靶基因的選擇和克隆，以及熒光蛋白報告基因的插入。此過程中涉及的引物序列信息如表1所示。

1.1.1克隆報告基因至 CRISPR/Cas9 載體以擬南芥基因組 DNA 為模板，以ZYP11-FP和ZYP11-RP為引物擴(kuò)增種子特異性表達(dá)的At2S3基因啟動子，用來驅(qū)動mCherry熒光蛋白基因。利用引物ZYP12-FP和ZYP12-RP將酶切位點(diǎn)BamH I和EcoR I克隆到At2S3片段兩端，得到的PCR產(chǎn)物為BamH I-EcoR I-At2S3-BamH I。用BamH I分別酶切pFGC-35S-mCherry-NOS和BamH I-EcoR I-At2S3-BamH I，連接2個酶切后片段獲得表達(dá)載體 pFGC-At2S3-mCherry-NOS。再用EcoR I分別酶切pHEE401和pFGC-At2S3-mCherry-NOS，連接酶切后得到的pHEE401和At2S3-mCherry-NOS片段，獲得pHEE401-At2S3-mCherry-NOS質(zhì)粒載體。

1.1.2sgRNA 靶位點(diǎn)選擇及引物設(shè)計本研究以脂肪酸去飽和酶基因FAD2為基礎(chǔ)設(shè)計靶序列，運(yùn)用CRISPR在線設(shè)計工具（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html）篩選目標(biāo)基因的靶序列。并對選擇的靶序列作脫靶情況的分析（http：//www.rgenome.net/cas-offinder/），最終從擬南芥FAD2基因中選取了G+C含量較高、基因特異性較強(qiáng)的2個關(guān)鍵片段FAD2-1（Target1：5′-TCGCACGGCACACGCTTTG -3′）、FAD2-2（Target2：5′-GTTTGTCCTCGGGTGGCCC -3′）作為靶序列。

1.1.3sgRNA表達(dá)盒的獲取以pCBC-DT1T2載體為模板進(jìn)行四引物擴(kuò)增，ZYP7用來克隆FAD2靶序列[12]，在sgRNA片段兩端分別克隆一個靶序列和Bsa I酶切位點(diǎn)序列，從而得到具有2個 FAD2 靶序列的sgRNA表達(dá)盒，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測并割膠回收目的片段。

1.1.4重組載體的構(gòu)建將sgRNA的PCR產(chǎn)物和pHEE401- At2S3-mCherry-NOS載體分別用Bsa I酶切后進(jìn)行連接，成功構(gòu)建重組載體，構(gòu)建好的載體具有2個sgRNA表達(dá)盒和1個Cas9蛋白基因，篩選標(biāo)記為潮霉素抗性基因和熒光蛋白基因mCherry（圖1）。

RB、LB：T-DNA左右邊界;EC1.2p：EC1.2基因的啟動子;rbcS-E9t：rbcS E9基因的終止子;2-sgRs：2個sgRNA組成的表達(dá)組件;zCas9：玉米密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白基因;U6-26p和U6-29p：2個擬南芥U6基因的啟動子;U6-26t：U6-26基因的終止子;At2S3p：擬南芥2S3基因的啟動子;mCherry：mCherry熒光蛋白基因;NOSt：NOS基因的終止子;Hyg：潮霉素抗性基因。

1.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥

以野生型擬南芥WT（Col-0）為T0代植株，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法將構(gòu)建好的編輯基因載體轉(zhuǎn)化至擬南芥[20]。

1.3突變體篩選

1.3.1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法在靶序列兩端設(shè)計引物，使PCR產(chǎn)物為包括靶序列在內(nèi)約200 bp的片段，提取T1代陽性轉(zhuǎn)基因植株葉片的DNA為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 25個循環(huán);72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保溫10 min。取1.5 μl PCR產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=29∶1，質(zhì)量比）檢測[21]，用200 V電壓電泳1.5 h，0.1%硝酸銀溶液染色，最后用掃描儀記錄結(jié)果。

1.3.2擬南芥種子油脂分析法稱取5 mg擬南芥種子放入2 ml離心管中用組織研磨儀進(jìn)行2次破碎（60 Hz，60 s）。離心10 s后加入400 μl 1 mg/ml的十七烷酸甘油三酯（正己烷做溶劑），上下?lián)u勻后再進(jìn)行破碎（60 Hz，60 s），室溫靜置1 h后12 000 g離心10 min。吸取200 μl上清液轉(zhuǎn)移到12 ml玻璃管中，氮吹濃縮至50～100 μl。加入2 ml含有1%濃硫酸的甲醇溶液，于80 ℃恒溫干式金屬浴上反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，立即將玻璃管置于冰中冷卻，加入2 ml 0.9% NaCl（質(zhì)量體積比）溶液和2 ml正己烷，擰緊管蓋后渦旋混勻，3 000 g離心6～10 min。吸取上清液，轉(zhuǎn)移到新的12 ml玻璃管中。在原玻璃管中繼續(xù)加入2 ml正己烷再次萃取，合并2次獲得的上清液。氮吹濃縮上清液體積至300 μl左右后，轉(zhuǎn)移到安捷倫頂空進(jìn)樣瓶的內(nèi)插管中，繼續(xù)氮吹至50 μl。然后用氣相色譜儀進(jìn)行檢測[22]。

2結(jié)果與分析

2.1擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性后代的篩選

將編輯基因載體轉(zhuǎn)化到擬南芥獲得T1代種子后，使用體式熒光顯微鏡篩選轉(zhuǎn)基因陽性種子，篩選結(jié)果如圖2所示。在藍(lán)色激發(fā)光下顯示紅色熒光的種子表示有mCherry熒光蛋白報告基因轉(zhuǎn)入，即為陽性植株。

2.2CRISPR/Cas9基因編輯效率檢測

2.2.1聚丙烯酰胺凝膠電泳法利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對熒光篩選獲得的轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行突變與否的鑒定。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果（圖3）顯示，不具有野生型對照條帶的為純合突變植株，既有突變條帶又有野生型對照條帶的為雜合突變植株，只有野生型對照條帶的則為未突變植株。

泳道1、2、3、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、28為未突變株系;泳道4、24、29為檢測到的基因組突變株系。M：DNA分子標(biāo)記;WT：野生型對照。

對鑒定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計從而確定CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率。如表2所示，4次試驗(yàn)的編輯效率分別為15.4%、9.1%、3.7%、4.0%。

2.2.2脂肪酸組分分析將T1代對應(yīng)的T2代種子分別進(jìn)行脂肪酸組分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAD2被編輯后其中一個株系（圖4B）與野生型（圖4A）相比油酸（C18∶1）的相對含量明顯增加，亞油酸（C18∶2）與亞麻酸（C18∶3）的相對含量都明顯減少，其中C18∶2的相對含量降低了26%。一般野生型擬南芥種子中C18∶1含量大約17%，當(dāng)C18∶1含量≥30%時判定FDA2位點(diǎn)突變。我們對脂肪酸組分變化達(dá)到判定突變標(biāo)準(zhǔn)的株系提取DNA后進(jìn)行了測序，測序結(jié)果表明這些株系確實(shí)存在突變。

統(tǒng)計分析得出CRISPR/Cas9基因編輯效率如表3所示，4次試驗(yàn)的編輯效率分別為57.7%、54.5%、74.1%、72.0%。

2.2.3聚丙烯酰胺凝膠電泳法與脂肪酸組分分析法統(tǒng)計結(jié)果比較通過對T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行分子鑒定，統(tǒng)計分析后得到CRISPR/Cas9基因編輯效率為3.7%～15.4%，但對T2代種子的脂肪酸組分進(jìn)行分析，通過脂肪酸組分的變化得到的CRISPR/Cas9編輯效率為54.5%～74.1%。并且，以其中一個株系為例，對其T1代植株進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測并未檢測出突變（圖5A），通過對其T2代種子的脂肪酸組分進(jìn)行測定后分析發(fā)現(xiàn)，C18∶1的含量由16%上升為40%，與野生型相比增加了24個百分點(diǎn)。對該株系的后代分離群體進(jìn)行測序，測序結(jié)果也表明該株系的FAD2基因確實(shí)存在突變，且該突變?yōu)橐粋€堿基的插入（圖5B）。比較2種檢測方法所得的結(jié)果，我們可以得知通過分析脂肪酸組分變化來檢測CRISPR/Cas9基因編輯突變體的方法漏檢率更低，結(jié)果更準(zhǔn)確，方法更具優(yōu)越性。該方法有效地克服了分子鑒定存在的缺陷，從而能高效地檢測CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的編輯效率。

3討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種高效的基因編輯技術(shù)，為基因功能研究和作物改良提供了突變體[23-25]。本研究對CRISPR/Cas9基因編輯效率的檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化。將mCherry熒光蛋白報告基因作為選擇基因。根據(jù)脂肪酸脫氫酶FAD2在擬南芥油脂合成中的作用，選擇FAD2基因?yàn)榘行蛄?。將?gòu)建的載體使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，用熒光篩選獲得T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株，對陽性植株分別采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法和T2代的脂肪酸組分分析法對編輯效率進(jìn)行檢測，結(jié)果表明通過脂肪酸組分分析的方法可以快速、高效地對基因突變進(jìn)行檢測，特別是高通量的篩選。同時該方法可以對編輯載體進(jìn)行評估，為載體的商業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。此外，該方法也可以為評估新的Cas9蛋白提供一個有效的工具。

Wang等[19]報道了一種新型的CRISPR/Cas9編輯載體，該載體中的Cas9蛋白基因由卵細(xì)胞特異性表達(dá)的EC1.2基因的啟動子驅(qū)動，以此可以有效地避免組成型過表達(dá)啟動子常產(chǎn)生的嵌合型T1代突變體[26]。另外，該載體中2個串聯(lián)的sgRNA取代了傳統(tǒng)的單個sgRNA，從而可以同時對2個甚至多個基因進(jìn)行編輯，避免了傳統(tǒng)的雜交方法獲得多突變體過程中的基因連鎖和基因滲透現(xiàn)象。

本研究對該編輯載體進(jìn)行了設(shè)計和改造，在標(biāo)記基因的選擇上，用報告基因替代了常用的選擇基因，將種子特異性表達(dá)的At2S3基因啟動子驅(qū)動的mCherry熒光蛋白基因插入在Cas9蛋白基因之后，可以高效篩選T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株以及最終獲得非轉(zhuǎn)基因的突變后代。熒光蛋白報告基因的插入相比于傳統(tǒng)的篩選方法如抗生素篩選具有更高的優(yōu)越性，它可以克服抗生素篩選不足，比如基因編輯后造成的植株致死或由于抗性較差而不能篩選到陽性植株。而且基于熒光信號篩選，突變體可以從大群體中分離出來，這有助于節(jié)省時間和勞動力。最后，前人常使用組成型表達(dá)的35 S啟動子來驅(qū)動熒光蛋白的表達(dá)，但是往往由此造成熒光蛋白在植物體內(nèi)廣泛表達(dá)而影響植物的生長發(fā)育，因此，我們在本研究中選用了在種子中專一性表達(dá)的At2S3基因啟動子來驅(qū)動mCherry熒光基因。在靶序列的選擇上，將以脂肪酸脫氫酶基因FAD2為基礎(chǔ)設(shè)計的靶序列插入載體。在擬南芥，脂肪酸脫氫酶fad2是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的油酸（C18∶1）去飽和酶，負(fù)責(zé)在油酸中引入第二個雙鍵形成亞油酸（C18∶2）[27]。因此，突變體fad2中C18不飽和脂肪酸的組成均較野生型有極大的區(qū)別[28]。最后只要通過檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株中C18不飽和脂肪酸的組成，快速簡便地篩選出被編輯的植株，從而確定特定的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的編輯效率。

我們對T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行分子鑒定，鑒定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析后得到的CRISPR/Cas9基因編輯效率為3.7%～15.4%。但對T2代種子的脂肪酸組分進(jìn)行分析，通過脂肪酸組分的變化得到的CRISPR/Cas9基因編輯效率為54.5%～74.1%。由此我們發(fā)現(xiàn)，通過分析脂肪酸組分變化來檢測CRISPR/Cas9基因編輯突變體的方法漏檢率更低，結(jié)果更準(zhǔn)確，方法更具優(yōu)越性。該方法有效地克服了分子鑒定存在的缺陷，從而能高效地檢測CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的編輯效率。

本研究對鑒定CRISPR/Cas9基因編輯突變體的方法進(jìn)行了改進(jìn)，與其他方法相比，該方法既不受可用的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制，也不需要大量的人力物力就可以進(jìn)行高通量的篩選;而且該方法有效地克服了分子鑒定存在的缺陷，能夠有效地篩選出被CRISPR/Cas9基因編輯后1個或2個堿基的缺失、插入或者替換的突變體，從而快速、準(zhǔn)確、高效地對CRISPR/Cas9基因編輯效率進(jìn)行檢測并快速篩選突變體。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）