王燚凡 楊俊卿 呂耀 徐智敏 李取生

摘要：通過土培盆栽試驗，研究了葉面接種褐球固氮菌（Ac63）在全紅莧菜（Amaranthus tricolor L.）和小白菜（Brassica campestris L.）葉際的定殖與促生效果，評估了在貧/富氮土培養(yǎng)且不/噴施接種Ac63處理下作物地上部生物量、葉綠素a和b含量及葉片總氮含量的變化，設(shè)計了Ac63的nifD基因特異性引物并通過qPCR分析其在葉際的豐度。結(jié)果表明，接種Ac63明顯促進了貧氮土培養(yǎng)的全紅莧菜地上部生物量、葉綠素a、b含量及葉片總氮含量增加（P<0.05），但對富氮土培養(yǎng)的全紅莧菜僅促進葉綠素a含量增加（P<0.05）;接種Ac63對貧/富氮土培養(yǎng)的小白菜均無明顯作用（P>0.05）。qPCR結(jié)果顯示Ac63能定殖于全紅莧菜葉際而不能定殖于小白菜葉際;此外土壤速效氮可能通過增加葉片氮含量在一定程度上抑制了Ac63在全紅莧菜的定殖數(shù)量及促生作用。說明固氮菌Ac63的葉際定殖具有作物選擇性，對于能夠定殖的作物具有良好固氮效果。

關(guān)鍵詞：褐球固氮菌;葉際;定殖;qPCR

中圖分類號：S182，X172文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0336-07

Abstract：The colonization of nitrogen-fixing bacteria （Ac63） in the phyllosphere of Amaranthus tricolor L. and Brassica campestris L. and growth-promoting effects were studied. A pot experiment was carried out to evaluate the changes of aboveground biomass， chlorophyll a and b contents， and total nitrogen content in leaves under different treatments nitrogen-poor and nitrogen-rich soil culture with and without spraying Ac63. The nifD-specific primers of Ac63 were designed， and their abundance in leaves was analyzed by qPCR. Results showed that inoculation with Ac63 could significantly promote the aboveground biomass， chlorophyll a and b contents， and total nitrogen content of A. tricolor L. cultured in nitrogen-poor soil （P<0.05）. However， it only increased the chlorophyll a content of A. tricolor L. cultured in nitrogen-rich soil （P<0.05）. Inoculation with Ac63 had no significant effect on B. campestris L. cultured in nitrogen-poor and nitrogen-rich soil （P>0.05）. The qPCR results revealed that Ac63 could colonize in the phyllosphere of A. tricolor L. but not in the phyllosphere of B. campestris L. In addition， the soil available nitrogen could inhibit the colonization and growth of Ac63 in A. tricolor L. by increasing the nitrogen content of leaves to some extent. It is indicated that the phyllosphere colonization of nitrogen-fixing bacteria Ac63 has crop selectivity， and it has a good nitrogen fixation effect on the crop that can be colonized.

Key words：Azotobacter chroococcum;phyllosphere;colonization;qPCR

氮素在作物產(chǎn)量和品質(zhì)形成中起著重要作用，但過度施氮會造成農(nóng)田土壤板結(jié)、水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題[1-2]。生物固氮能為陸地生態(tài)系統(tǒng)提供每年195 Tg的氮輸入，其中約32 Tg進入農(nóng)業(yè)系統(tǒng)[3]。微生物肥料是代替化學氮肥的有效手段，非共生固氮菌是微生物肥料的重要組成部分，這類固氮菌能定殖在小麥和玉米等非豆科作物根際，從而促進作物的生長[4]。其主要接種方式為根際灌施，但復雜的土壤環(huán)境及菌株間競爭可能影響非共生固氮菌的根際定殖效果，在一定程度上制約了非共生固氮菌菌劑的推廣應用[5]。

相比于土壤環(huán)境，葉際生理環(huán)境及菌群結(jié)構(gòu)相對簡單。有研究者發(fā)現(xiàn)葉際微生物能為宿主植物提供10%～25%的氮[6]。在葉面接種固氮菌Azosprillum brasilense能顯著增加油菜、玉米和小麥的產(chǎn)量[7-8]。在葉面接種固氮菌Klebsiella variicola W12能增加玉米莖葉的氮含量[9]。在葉面噴施接種非共生固氮菌并實現(xiàn)葉際定殖可能是微生物肥料推廣應用的新思路。非共生固氮菌Azotobacter chroococcum具有較強的固氮和分泌植物生長激素的能力，其廣泛分布于水稻、小麥和棉花等作物的葉際[10]。另外南方常見的高營養(yǎng)價值蔬菜莧菜（Amaranthus tricolor L.）和小白菜（Brassica campestris L.）需要通過大量施用氮肥實現(xiàn)高產(chǎn)，但過量的氮肥會使這2種作物的成品率下降及硝酸鹽累積[11-13]，目前還沒有在這2種作物的葉際接種固氮菌的定殖研究。

目前測定葉際定殖菌株數(shù)量的方法主要為平板涂布法[9，14]，操作過程繁瑣且費時，若葉際原生菌株與目標菌株形態(tài)相近則可能會造成計數(shù)準確度較低。而實時熒光定量（qPCR）法具有反應快速、特異性強和靈敏度高的優(yōu)點，被廣泛應用于細菌定殖數(shù)量的檢測[15]。建立葉際細菌qPCR測定方法有望能快速、穩(wěn)定地評估其在葉際的定殖情況。

本研究選擇菌株Azotobacter chroococcum CICC 22663（Ac63）作為研究對象，建立使用qPCR測定Ac63在作物葉際中定殖數(shù)量的方法，通過盆栽試驗評估葉面接種Ac63對貧氮土或富氮土栽培下莧菜和小白菜的促生效果，以期能夠為農(nóng)作物的氮肥施用減量化提供理論指導。

1材料與方法

1.1供試材料

褐球固氮菌A. chroococcum 22663（Ac63）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），可用作固氮菌肥，菌株保存于4 ℃冰箱中備用。用于Ac63培養(yǎng)的固氮培養(yǎng)基（液體）成分包括：酵母提取物0.50 g、甘露醇20.00 g、KH2PO4 0.20 g、K2HPO4 0.80 g、MgSO4·7H2O 0.20 g、CaSO4·2H2O 0.10 g、FeCl3 0.02 g、Na2MoO4·2H2O 0.02 g、去離子水1 L。選取全紅莧菜（Amaranthus tricolor L.）及小白菜（Brassica campestris L.）為供試作物，種子購于江蘇歡樂谷種業(yè)。

1.2Ac63在作物葉際定殖數(shù)量測定方法的建立

1.2.1引物設(shè)計采用qPCR方法測定Ac63在葉際的定殖。Ac63通過固氮酶將N2轉(zhuǎn)化為銨，nifD基因編碼Ac63的固氮酶鉬鐵蛋白的α鏈[16]，因此基因的特異性序列可作為PCR擴增的靶標，通過qPCR特異性地評估Ac63在葉際的定殖數(shù)量。在NCBI中下載A. chroococcum的nifD基因的序列及與該序列相似度高但屬于不同菌株的20組nifD基因的序列，利用MEGA7進行序列同源性比對，使用Oligo7軟件根據(jù)比對得到的特異性序列設(shè)計特異性引物。

1.2.2引物特異性的驗證為確保所設(shè)計的引物僅能評估作物葉際Ac63定殖數(shù)量，在GenBank進行引物primer-BLAST驗證以確保引物特異性。對Ac63進行PCR驗證：按照基因組提取試劑盒說明書提取Ac63基因組DNA，然后使用Ac63 nifD基因的特異引物對基因組進行PCR擴增。PCR體系（25 μl）：12.5 μl PrimeSTAR Max Premix 2×（TAKARA，JAPAN），1.0 μl 正向引物（10 μmol/L），1.0 μl反向引物（10 μmol/L），1.0 μl DNA模板，9.5 μl DEPC水。PCR擴增條件：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，共35個循環(huán)。通過瓊脂糖凝膠電泳確認擴增條帶與預計產(chǎn)物大小相符，送上海生工公司進行測序及BLAST比對，確認特異性引物擴增的片段序列與設(shè)計序列相符。

1.2.3引物擴增效率的驗證采用Ac63的nifD基因特異引物對含有Ac63 nifD基因片段的標準質(zhì)粒（通過對Ac63的基因組進行PCR并克隆得到）進行qPCR以檢測引物的擴增效率。qPCR體系（20 μl）：10 μl SYBR Green PCR Mix（208054，QIAGEN），1 μl 正向引物（10 μmol/L），1 μl 反向引物（10 μmol/L），DNA（50 ng） 1 μl，DEPC水8 μl。qPCR程序：95 ℃預變性2 min;95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸5 s，40個循環(huán)，隨后以0.1 ℃/s的速度從65 ℃升至95 ℃。通過繪制熔解曲線和擴增曲線評估引物的擴增效率及特異性，將滿足條件的引物作為測定Ac63葉際定殖數(shù)量的qPCR引物。

1.3土培盆栽試驗

1.3.1供試土壤的采集與前處理用于盆栽試驗的土壤采自廣州市番禺區(qū)暨南大學南校區(qū)校內(nèi)0～25 cm表層土。土壤的理化性質(zhì)如下：pH 5.52，氨氮1.98 mg/kg、硝態(tài)氮1.26 mg/kg，速效磷2.54 mg/kg，速效鉀66.10 mg/kg。新鮮土壤在陰涼處自然風干7 d，隨后挑除大塊石和植物殘體，將土壤過2.0 mm（10目）篩備用。

1.3.2試驗條件及處理試驗設(shè)置的處理包括：每1 kg供試土壤以水溶液的形式施入KCl 95.4 mg（相當于鉀50 mg）同時摻加過磷酸鈣（含磷12%）833.3 mg（相當于磷100 mg）并混勻，該處理條件下的土壤稱為貧氮土;每1 kg貧氮土再以水溶液的形式施入NH4NO3 57.1 mg（相當于氮20 mg），該處理條件下的土壤稱為富氮土。選取全紅莧菜（簡稱A）和小白菜（簡稱X）作為供試作物。每種作物分別設(shè)置4種處理：貧氮土培養(yǎng)，不接種Ac63（簡稱C）和噴施接種Ac63（簡稱P）;富氮土培養(yǎng)，不接種Ac63（簡稱N）或噴施接種Ac63（簡稱NP）。各處理表示方式以作物簡稱+肥料處理簡稱命名，如AP代表全紅莧菜在貧氮土培養(yǎng)并噴施接種Ac63。每種處理均設(shè)置3個花盆作為重復（共2×4×3=24盆）。

種子消毒及育苗：作物的種子在70%乙醇中表面消毒30 s，再在2%次氯酸鈉中消毒3 min，然后用無菌水洗滌4次。消毒后的種子播種在含有未滅菌貧氮土的育苗板中，放置在白光16 h/d和（28±2 ） ℃的培養(yǎng)箱中育苗14 d，每天適當補水保濕。將長勢相近的幼苗移栽至裝有1.5 kg未滅菌的貧/富氮土的塑料花盆（直徑20 cm）內(nèi)，每盆移栽8株。

盆栽試驗于2018年5月至7月在廣州市番禺區(qū)暨南大學南校區(qū)的溫室內(nèi)進行（日均氣溫為27～33 ℃）。在移栽后每天進行澆水保濕，第5 d、10 d、15 d和30 d使用5 ml霧化噴壺對每組需要接種Ac63的處理組（P和NP處理組）的作物葉面噴施Ac63葉面接種劑5 ml（每盆接種約1.6 ml），不接種的處理組（C和N處理組）用5 ml無菌水代替。接種時土壤表面用鋁箔覆蓋，以避免接種劑進入土壤。Ac63葉面接種劑（>109CFU/ml）通過如下方式制備：Ac63接種固氮培養(yǎng)基（液體）后以28 ℃，180 r/min培養(yǎng)16 h，經(jīng)6 000 r/min離心5 min后重懸于等體積無菌水中制成。

1.3.3作物收獲與理化性質(zhì)測定作物土培45 d后收獲，分別剪取作物的根、莖和葉，稱量同一盆內(nèi)8株作物的莖葉總質(zhì)量作為地上部鮮質(zhì)量。采用Arnon光度法測定作物葉片中葉綠素a和葉綠素b含量[17]。采用國標LYT1269—1999的方法測定葉片總氮含量。需要進行Ac63定殖數(shù)量測定的葉片用液氮速凍并迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4作物葉際菌株Ac63定殖數(shù)量的評估將葉片從-80 ℃冰箱中取出并在液氮中研磨成粉末狀，采用植物總DNA提取試劑盒（69104，QIAGEN） 提取葉片總DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA完整性，采用超微量分光光度計（Nanodrop One C，Thermo Fisher Scientific）測定DNA濃度，并使用DEPC水將DNA稀釋至50 ng/μl。將方法1.2.3中確定的引物用于葉際DNA的qPCR擴增，擴增體系及程序同方法1.2.3。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)平均值、標準差及方差分析計算;采用 SPSS Statistics 22.0 進行單因素方差分析（Turkey分析），P<0.05被認為組間有顯著差異;采用Thonar等[18]的公式計算標準質(zhì)粒的拷貝數(shù)，使用CFX manager 3.1軟件進行qPCR計算并換算成每1 g葉片中nifD基因的拷貝數(shù)，確保引物或擴增條件達到絕對定量的標準（0.90.97）。

2結(jié)果與分析

2.1Ac63在葉際定殖數(shù)量測定方法的建立

為實現(xiàn)對作物葉際Ac63定殖數(shù)量的測定，根據(jù)A. chroococcum nifD基因的特異序列設(shè)計了2對特異性引物，引物對的序列分別為nifD 1F：5′-TTACCCTGAGAAAGCCCGT-3′、nifD 1R： 5′-CCCTTGGAACCGGCGTAAG-3′及nifD 2F：5′-CCCTGAGAAAGCCCGTAAA-3′、nifD 2R： 5′-CCCTTGGAACCGGCGTAA-3′。BLAST比對結(jié)果顯示，2對引物均只能擴增出A. chroococcum的nifD基因的片段。使用2對特異性引物對Ac63的基因組進行PCR擴增，電泳條帶的大小均與設(shè)計大小一致，約為150 bp（圖1）。測序結(jié)果驗證了2對引物均能擴增出Ac63的nifD基因片段，但僅有nifD 1F/nifD 1R引物對的擴增效率（R2=0.99，E=98%）達到了絕對定量的標準。這表明引物對nifD 1F/nifD 1R及方法1.2.3的擴增條件可用于測定Ac63在葉際的定殖數(shù)量。

2.2葉面噴施接種Ac63對全紅莧菜和小白菜生物量、葉綠素含量和葉片總氮含量的影響

如圖2、圖3、圖4所示，在貧氮土中，噴施接種Ac63（AP處理）相比于不接種（AC處理）能顯著增加全紅莧菜的地上部鮮質(zhì)量、葉綠素a、b含量和葉片總氮含量（P<0.05）;在富氮土中，噴施接種Ac63（ANP處理）相比于不接種（AN處理）能顯著增加全紅莧菜葉綠素a含量（P<0.05），而對地上部鮮質(zhì)量、葉綠素b含量及葉片總氮含量無顯著影響（P>0.05）。這說明Ac63對全紅莧菜有促生作用，但土壤速效氮的增加會降低Ac63對全紅莧菜的促生效果。

無論在貧氮土或富氮土中，噴施接種Ac63（XP、XNP處理）相比于不接種（XC、XN處理）對小白菜的地上部鮮質(zhì)量、葉綠素a、b含量和葉片的總氮含量的影響均無顯著差異（P>0.05）。這說明Ac63對小白菜無明顯促生作用。

貧氮和富氮土中，相比于不接種處理，噴施接種Ac63后全紅莧菜地上部鮮質(zhì)量、葉綠素a、b含量和葉片總氮含量的增長率均比小白菜高。這進一步說明接種Ac63對全紅莧菜的促生作用較小白菜強。

2.3Ac63在全紅莧菜和小白菜葉際的定殖情況

由于引物對nifD1F/nifD1R對Ac63的nifD基因具有較好的特異性，故葉際中nifD基因的豐度代表了Ac63的定殖數(shù)量。如圖5所示，使用引物對nifD1F/nifD1R進行qPCR擴增的結(jié)果說明：貧氮土及富氮土中，全紅莧菜葉面噴施接種Ac63后葉際nifD基因豐度分別達到1 g 7.27×105拷貝和6.34×105 拷貝，而小白菜葉面噴施接種Ac63后葉際nifD基因在貧/富氮土中均低于檢出限。說明固氮菌Ac63能在全紅莧菜的葉際定殖，而不能在小白菜的葉際定殖，Ac63在不同作物葉際定殖存在差異;另外在富氮土栽培條件下Ac63在全紅莧菜葉際的定殖數(shù)量比貧氮土栽培條件下低，這可能是由于全紅莧菜通過吸收土壤速效氮使得葉片中氮含量增加，進而抑制了Ac63的定殖。

3討論

葉面接種Ac63顯著提高了貧氮土培養(yǎng)的全紅莧菜葉片總氮含量。有報道稱固氮菌A. chroococcum利用固氮酶將空氣中的N2固定為銨[19]，在滿足菌體自身氮需求后將多余的銨通過glnK-amtB操縱子分泌到胞外[20]。Ac63可能是通過固氮并分泌銨的方式使得全紅莧菜葉片總氮含量增加。

噴施接種Ac63相比于不接種對全紅莧菜有較顯著的促生作用，而對小白菜無顯著的促生作用。全紅莧菜葉綠素含量及生物量上升的原因可能是葉片氮的增加促進了葉綠素的合成，同時葉綠素又是參與植物光合作用的一種主要色素[21]，從而提高了作物的生物量。qPCR測定結(jié)果也顯示Ac63能夠在全紅莧菜的葉際定殖，而不能在小白菜的葉際定殖。有報道稱菌株與宿主植物的匹配度可能影響葉面接種固氮菌的定殖和促生效果[22]。最近的研究結(jié)果也表明Azosprillum brasilense葉面接種劑對不同作物的促生效果及定殖效果存在較大差異[7-8， 23]。這說明相比于在小白菜葉際，Ac63在全紅莧菜葉際具有更強的環(huán)境適應力及微生物競爭力。

值得注意的是Ac63為何只在全紅莧菜而不在小白菜的葉際定殖。葉際包括葉片表面及內(nèi)部，葉際細菌首先通過形成生物膜定殖在葉面，隨后部分細菌能從傷口或氣孔侵入葉內(nèi)實現(xiàn)更穩(wěn)定的定殖[24]。細菌形成生物膜是葉際定殖的關(guān)鍵，如固氮菌P. stutzeri通過形成生物膜定殖在葉面[25]。部分關(guān)鍵的化學物質(zhì)誘導了生物膜的形成，如沙拉葉片的滲出物中轉(zhuǎn)鐵蛋白能增強病原菌Salmonella enterica的鐵載體合成，并促進菌株生物膜形成從而實現(xiàn)在沙拉葉面的定殖[26]。推測全紅莧菜的葉面可能存在促進Ac63生物膜形成的物質(zhì)，而小白菜葉面不存在。

目前仍不清楚Ac63是否侵入了葉內(nèi)。有研究者發(fā)現(xiàn)使用綠色熒光表達質(zhì)粒pHC60標記非共生固氮菌A. chroococcum（Azb19）后，菌株只能定殖在高粱的根表面而不能侵入根內(nèi)[27]。申紅妙等發(fā)現(xiàn)促生菌JL4-gfp在葡萄葉面及葉內(nèi)均能定殖[14]。Peredo等通過原位熒光雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)植物促生菌Methylobacterium侵入了擬南芥的葉內(nèi)并定殖在氣孔的內(nèi)壁[28]。A. chroococcum能否侵入葉內(nèi)未見報道。

另外Ac63在貧氮土栽培的全紅莧菜葉際定殖數(shù)量及Ac63對植物的促生效果顯著高于富氮土栽培的，這可能由于土壤速效氮被作物吸收使得葉片氮含量增加，進而抑制了Ac63的促生效果及其在葉際的定殖能力。有研究者稱施氮會降低甘蔗葉際內(nèi)生固氮菌nifH基因的表達量[29]。Fuentes-Ramirez等也發(fā)現(xiàn)外源施加土壤速效氮會降低內(nèi)生固氮菌G. diazotrophicus在甘蔗的定殖數(shù)量，并推測這是由于植物的生理狀態(tài)改變造成的[30]。但目前還沒有氮肥對固氮菌葉際定殖調(diào)控機制的報道。我們推測莧菜從土壤中吸收了更多的速效氮導致減少了對Ac63的定殖依賴。外源施加速效氮可能會影響固氮菌在葉際的定殖和促生能力，應考慮氮肥與固氮菌接種劑的配比。

綜上所述，Ac63在全紅莧菜和小白菜葉際的定殖能力存在較大差異，Ac63能夠定殖于全紅莧菜葉際并顯著促進其生長，同時土壤速效氮含量在一定程度上會影響Ac63對作物的促生效果。研究結(jié)果為減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化學氮肥施用量提供了可能性，也為發(fā)掘固氮菌Ac63在葉際定殖的機制奠定了基礎(chǔ)。

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（責任編輯：張震林）