蔡張杰 崔麗娟 李晶 李偉 雷茵茹

摘要：為了解冬季低溫條件下人工濕地沉積物的氨氧化潛力及其影響因素，以北京市漢石橋濕地自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的人工濕地為研究對(duì)象，測(cè)定了不同濕地單元沉積物的硝化潛勢(shì)（PNR）及其相關(guān)功能基因的豐度。結(jié)果表明，沉積物的PNR較高，說(shuō)明冬季人工濕地具有較高的硝化潛力。PNR從入水段到出水段呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。通過(guò)建立硝化活性與功能微生物豐度的線性回歸模型發(fā)現(xiàn)，氨氧化古菌（AOA，以AOA的 amoA基因豐度表征）是影響硝化潛勢(shì)的主要功能微生物。進(jìn)一步構(gòu)建硝化微生物豐度與環(huán)境因子的回歸方程，發(fā)現(xiàn)影響AOA ?amoA基因豐度的主要環(huán)境因子是碳氮比（C/N），影響氨氧化細(xì)菌（AOB，以AOB的 amoA基因豐度表征）豐度的主要環(huán)境因子是全氮（TN）含量。高通量測(cè)序測(cè)定人工濕地沉積物AOA和AOB的群落組成，各濕地單元檢測(cè)到的AOB群落優(yōu)勢(shì)門為Proteobacteria，主要是β-Proteobacteria綱，AOA主要屬于Crenarchaeota和Thaumarchaeota 2個(gè)門類。濕地4單元和5單元，1單元和6單元在AOB菌群群落組成上較為接近;濕地6單元、7單元、8單元在AOA菌群群落組成上較為接近。

關(guān)鍵詞：人工濕地;硝化潛勢(shì);功能基因豐度;群落結(jié)構(gòu);環(huán)境因子

中圖分類號(hào)：X171.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）02-0373-11

Abstract：To understand the potential nitrification rate of the constructed wetland sediments under low temperature conditions in winter and its influencing factors， the constructed wetland in the Hanshiqiao Wetland Nature Reserve in Beijing was selected as the research area， and the potential nitrification rate （PNR） and the abundance of their related functional genes were investigated. The results showed that the PNR of the sediment was higher， indicating that the constructed wetland had higher nitrification potential in winter. The PNR increased first and then decreased from the inlet section to the outlet section. By establishing a linear regression model of nitrification activity and functional microbial abundance， we found that ammonia-oxidizing archaea （AOA， characterized by the abundance of amoA gene in AOA） was the main functional microorganism affecting the nitrification potential. By further constructing the regression equation of microbial abundance and environmental factors， it was found that the main environmental factor affecting the abundance of AOA amoA gene was carbon-nitrogen ratio （C/N）， and the main environmental factor affecting the abundance of ammonia-oxidizing bacteria （AOB， characterized by abundance of amoA gene in AOB） was total nitrogen （TN） content. High-throughput sequencing was used to determine the community composition of AOA and AOB in constructed wetland sediments. The dominant phylum of AOB community in each wetland unit was Proteobacteria， which was mainly composed of β-subdivision of Proteobacteria， and AOA mainly belonged to Crenarchaeota and Thaumarchaeota. In terms of community composition， for AOB， wetland units 4 and 5， 1 and 6 were relatively similar in flora composition， for AOA， wetland units 6， 7， 8 were relatively close.

Key words：constructed wetland;potential nitrification rate;functional genes′ abundance;community structure;environmental factor

人工濕地能夠有效處理氮素污染，其主要的除氮機(jī)制為植物和微生物的作用[1-2]。微生物以其主導(dǎo)的硝化-反硝化作用等過(guò)程可去除60%～90%的氮[3-5]。氨氧化作用是硝化作用的限速步驟，是氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。在中國(guó)北方，冬季低溫條件下，植物衰老死亡后其吸收的氮素分解回歸濕地環(huán)境，微生物代謝緩慢，有機(jī)質(zhì)在基質(zhì)中積累[6]，導(dǎo)致人工濕地生態(tài)系統(tǒng)在冬季低溫時(shí)運(yùn)行效率較低[7-8]，進(jìn)而影響人工濕地的推廣普及。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展了對(duì)人工濕地冬季低溫條件下運(yùn)行狀況的研究。這些研究多用水體氮形態(tài)變化表征除氮效果，較少涉及沉積物的硝化作用，也較少?gòu)墓δ芪⑸锏慕嵌仍u(píng)價(jià)除氮效果。

本研究以北京市漢石橋濕地自然保護(hù)區(qū)的人工濕地為對(duì)象，采集冬季冰封期不同處理單元的沉積物，測(cè)定其硝化潛勢(shì)，并測(cè)定氨氧化功能基因（amoA）的豐度以及環(huán)境因子，揭示冬季低溫條件下人工濕地的硝化潛勢(shì)及其生物和非生物影響因子，以期為提高濕地冬季運(yùn)行效率提供理論參考。此外本研究采用Miseq高通量測(cè)序的方法分析不同處理單元的反硝化細(xì)菌群落，利用冗余分析方法探究其與環(huán)境因子的關(guān)系，以期為人工濕地氨氧化細(xì)菌、氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)的空間分布以及細(xì)菌環(huán)境影響因子的研究提供依據(jù)，為人工濕地微生物除氮機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1研究區(qū)概況及樣品采集

北京市漢石橋人工濕地建于2015年，共有8個(gè)處理單元（圖1）。1單元的水源是游船區(qū)的湖水，2單元的水源是附近餐廳和廁所的污水。人工濕地總面積約為3 400 m2，種植的植物為香蒲、菖蒲、水蔥、蘆葦?shù)?。各單元底部均鋪有砂石或礫石防滲，單元之間通過(guò)下方管道實(shí)現(xiàn)水流的連通。濕地內(nèi)的水經(jīng)多級(jí)處理，達(dá)到Ⅱ類水的標(biāo)準(zhǔn)后，通過(guò)地下管道從8單元排入附近河道。人工濕地在每年3月中旬蓄水，11月底入冬后排干。于2018年3月1日濕地?zé)o水期，在人工濕地8個(gè)處理單元各采集0～20 cm深的3個(gè)沉積物樣品，共24個(gè)樣品。

1.2沉積物理化性質(zhì)和活性指標(biāo)的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[9]的方法，測(cè)定沉積物的pH值以及有機(jī)質(zhì)（OM）、全碳（TC）、全氮（TN）、銨態(tài)氮（NH+4-N）、硝態(tài)氮（NO-3-N）含量。用電位法（土水比1.0∶2.5，質(zhì)量比）測(cè)定pH值，用Cytation 5多功能酶標(biāo)儀（BioteK，USA）測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量，用Vario Ⅱ元素分析儀（Elementar，German）測(cè)定TC和TN含量，用SmartChem200全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀（WestCo，USA）測(cè)定NH+4-N和NO-3-N含量。硝化潛勢(shì)（PNR）的測(cè)定（以NO-2-N計(jì)）采用氯酸鹽抑制法[10]。

1.3DNA的提取和PCR擴(kuò)增

利用Power Soil土壤DNA提取試劑盒（German，QIAGEN）提取基因組DNA。氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）的amoA基因定量PCR分析均在Light Cycler 480Ⅱ（Roche，Switzerland）上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為25.0 μl，包含12.5 μl TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa公司產(chǎn)品），正、反向引物各1.0 μl，DNA模板1.0 μl，其余用ddH2O（Takara，Japan）補(bǔ)足至25.0 μl。定量PCR所用引物及反應(yīng)條件見表1。全部樣品使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司產(chǎn)品）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將純化產(chǎn)物通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法進(jìn)行高通量測(cè)序（由美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司完成測(cè)序）。

1.4序列處理

應(yīng)用Usearch軟件將所有優(yōu)化序列Map至OUT代表序列，選出與OUT代表序列相似性在97%以上的序列，生成OUT表格。使用Qimme平臺(tái)與RDP Classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OUT代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，對(duì)比SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。若分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)一些分類學(xué)譜系中的中間等級(jí)沒(méi)有科學(xué)名稱，以norank作為標(biāo)記。分類學(xué)對(duì)比后根據(jù)置信度閾值進(jìn)行篩選，如果某些分類譜系在某一分級(jí)別分值較低，在統(tǒng)計(jì)時(shí)以Unclassified標(biāo)記。

1.5數(shù)據(jù)處理和分析

使用Microsoft Excel2013軟件（Microsoft，USA）進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)初步處理，使用SPSS22.0軟件（Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在OriginPro2018軟件（OriginLab，USA）上完成制圖。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的Duncans法（P<0.05）檢驗(yàn)多組樣本之間的差異性，采用成對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)分析AOA與AOB amoA豐度的差異性。采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析兩組變量之間的相關(guān)性，并用線性回歸進(jìn)一步確定變量之間的關(guān)系。使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-Sanger云平臺(tái)進(jìn)行微生物的多樣性分析和分類學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1人工濕地沉積物主要理化性質(zhì)與硝化活性

測(cè)定結(jié)果（表2）表明，人工濕地沉積物pH值介于7.97與8.34之間，呈弱堿性，在1單元和2單元之間pH值有顯著差異，其他單元之間均無(wú)顯著差異，1單元和6單元pH值最大，分別為8.25和8.34。OM、TC、TN含量從2單元至出水單元（8單元）均顯著降低（P<0.05）。C/N在1～5單元和6～8單元間存在顯著差異（P<0.05），其變化范圍為8.59～14.11。NH+4-N含量在1、4單元間存在顯著差異，其他單元之間不存在顯著差異，但存在一定的先增加后減少的趨勢(shì)。NO-3-N含量在4、5單元和其他單元之間存在顯著差異，該濕地各單元NH+4-N和NO-3-N含量均處于較高水平。

圖2顯示，3單元的硝化潛勢(shì)（PNR）最高[（0.30±0.02） μg/（g·h）]，6單元最低[（0.01±0） μg/（g·h）]。從3單元到8單元沉積物的PNR呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)（P<0.05）。

2.2人工濕地氨氧化微生物功能基因豐度

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)各濕地單元沉積物樣品的氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）的amoA基因進(jìn)行分析（圖3）。成對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)結(jié)果表明，在所有濕地單元中，AOA amoA基因豐度均顯著高于AOB amoA基因豐度（t=6.678，P<0.01），二者的比值為1.44～31.35。在所有濕地單元中，AOA和AOB的amoA基因豐度分別為1 g 1.55×107～2.65×108拷貝、8.12×106～1.58×107拷貝。單因素方差分析結(jié)果表明，人工濕地3單元和4單元AOA amoA基因豐度與其他單元存在顯著差異（F=168.506，P<0.01）。人工濕地入水單元（1單元、2單元）AOB amoA基因豐度與其他單元存在顯著差異（F=9.471，P<0.01）。

分析PNR與相關(guān)功能基因的關(guān)系，結(jié)果表明PNR與沉積物中AOA amoA基因豐度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)為0.693**，P<0.01），AOA amoA基因豐度越高，PNR越大。說(shuō)明該人工濕地在低溫條件下，AOA在硝化過(guò)程中作用較為重要。進(jìn)一步分析氨氧化功能基因豐度與環(huán)境因子的關(guān)系，結(jié)果（表3）表明人工濕地冬季沉積物AOA amoA基因豐度與沉積物C/N呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。AOB amoA基因豐度與OM、TC、TN含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。

進(jìn)一步對(duì)各功能基因與環(huán)境因子進(jìn)行多元逐步回歸。結(jié)果（表4）表明，沉積物C/N比對(duì)人工濕地AOA amoA基因豐度影響最大，回歸方程決定系數(shù)R2為0.225;沉積物TN含量對(duì)AOB amoA基因豐度影響最大，回歸方程R2為0.332。

2.3人工濕地氨氧化微生物的α-多樣性

α-多樣性指標(biāo)（OUT水平）可以在一定程度上表示樣點(diǎn)的群落特征。本研究中計(jì)算的α-多樣性指標(biāo)有：豐富度指數(shù)（Chao1、ACE），表示一個(gè)群落中物種的復(fù)雜程度，值越高表明群落內(nèi)物種的數(shù)目越多;優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（Simpson指數(shù)），表示一個(gè)群落中優(yōu)勢(shì)菌群的地位和貢獻(xiàn)，值越高表明群落內(nèi)物種數(shù)量差異越大，優(yōu)勢(shì)菌群的主導(dǎo)地位越突出;多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)），是物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，也是對(duì)Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)綜合的一個(gè)指數(shù)[12]。為了保證樣品的序列數(shù)一致，在計(jì)算各指標(biāo)之前，對(duì)樣本OUT數(shù)目進(jìn)行隨機(jī)抽平。計(jì)算結(jié)果（表5）顯示，氨氧化細(xì)菌Chao1指數(shù)最高的是3單元（58.00），最低的是5單元（31.00）; Simpson指數(shù)最高的為1單元（0.27），最低的為8單元（0.13）;Shannon指數(shù)最高的為8單元（2.47），最低的是1單元（1.58）。氨氧化古菌Chao1指數(shù)最高的是3單元（68.00），最低的是2單元（36.50）; Simpson指數(shù)最高的為5單元（0.34），最低的為8單元（0.10）;Shannon指數(shù)最高的為8單元（2.88），最低的是2單元（1.53）。

2.4人工濕地氨氧化微生物的β-多樣性

β-多樣性（OUT水平）可以用來(lái)比較各樣點(diǎn)間群落的差異，基于Bray-Curtis差異度指數(shù)計(jì)算樣點(diǎn)間的差異，進(jìn)而對(duì)微生物群落排序，選取解釋度最大的兩軸做PCA圖（圖4）。對(duì)于AOB，兩軸對(duì)排序結(jié)果的解釋度分別為60.96%和19.57%。1單元和6單元，4單元和5單元的距離較近，說(shuō)明這兩組的氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更相似。1單元和7單元距離最遠(yuǎn)，說(shuō)明這2個(gè)單元的氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。對(duì)于AOA，兩軸對(duì)排序結(jié)果的解釋度分別為61.95%和22.46%。1～5單元距離很近，說(shuō)明這5個(gè)單元的氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)更相似;6單元和7單元距離最遠(yuǎn)，說(shuō)明這2個(gè)單元的氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。這個(gè)結(jié)果與人工濕地沉積物氨氧化微生物的聚類結(jié)果（OUT水平）類似（圖5）。

2.5人工濕地氨氧化微生物的群落組成

對(duì)人工濕地沉積物樣品氨氧化細(xì)菌的所有序列進(jìn)行聚類，共得到109個(gè)OTU，通過(guò)分類學(xué)統(tǒng)計(jì)得到門、屬2個(gè)水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。分別統(tǒng)計(jì)其門、屬類別的構(gòu)成，形成柱狀圖（圖6），同時(shí)分析其在各個(gè)水平上的菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示檢測(cè)所得OUT主要屬于3個(gè)門類，分別是Proteobacteria（77.52%）、Unclassified_k_norank_d_Bacteria（21.68%）、Ammonia_oxidising_bacteria_ensemble（0.69%）。在屬水平上，所得OUT主要屬于9個(gè)屬，分別為Unclassified_o_Nitrosomonadales（30.28%）、Unclassified_k_norank_d_Bacteria（21.68%）、Nitrosospira（19.64%）、Norank_f_environmentl_samples（15.88%）、Norank_o_environmental_sample_c_Betaprotebacteria（0.05%）、Nitrosomonas（0.05%）、Environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae（0.009%）、Nitrosovibrio（0.008%）、Norank_p_ammonia_oxidising_ensemble（0.007%）。

對(duì)沉積物樣品氨氧化古菌的測(cè)序序列進(jìn)行聚類后，共得到74個(gè)OTU，通過(guò)分類學(xué)統(tǒng)計(jì)得到在門和屬上的群落結(jié)構(gòu)組成（圖7）。檢測(cè)所得OUT主要屬于4個(gè)門類，分別是Unclassified_k_norank_d_Archaea（66.09%）、Crenarchaeota（24.02%）、Environmental_sample_k_norank_d_Archaea（7.48%）、Thaumarchaeota（2.32%）。在屬水平上，所得OUT主要屬于4個(gè)屬，分別是Unclassified_k_norank_d_Archaea（66.09%）、Norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota（24.02%）、Norank_p_environmental_sample_k_norank（7.48%）、Nitrososphaera（2.26%）。

為比較不同單元氨氧化微生物群落組成的差異，應(yīng)用Bray-Curtis距離算法和Complete聚類方法，將高豐度和低豐度的物種分塊聚類，通過(guò)顏色梯度及相似程度反應(yīng)多個(gè)樣本在各分類水平上群落組成（屬水平）的相似性和差異性（圖8）。結(jié)果表明，氨氧化細(xì)菌群落相似度最高為86.6%，相似度較高，4單元與5單元，1單元與6單元菌群群落組成較為相近。氨氧化古菌群落相似度最高為87.2%，相似度較高，6單元、7單元、8單元與3單元、5單元、4單元、1單元、2單元群落組成相差較大，其中1單元與2單元，7單元與8單元菌群群落組成較為相似。

2.6人工濕地氨氧化微生物與沉積物理化性質(zhì)的相關(guān)性

對(duì)沉積物理化環(huán)境因子與氨氧化微生物主要菌落（屬）所占比重進(jìn)行中心標(biāo)準(zhǔn)化，并進(jìn)行校正（蒙特卡洛置換檢驗(yàn)），提取第一與第二坐標(biāo)軸信息，進(jìn)行冗余分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)于氨氧化細(xì)菌，第一和第二坐標(biāo)軸對(duì)方差總解釋率為83.10%。在所測(cè)樣品中，Nitrosomonas、Norank_o_environmental_samples_c_Bataproteobacteria、Norank_f_environmental_samples與沉積物中TC含量、TN含量、OM含量、C/N比呈正相關(guān)關(guān)系，與pH、NO-3-N含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。而Environmental_samples-f_Nitrosomonadaceae、Unclassified_o_Nitrosomonadales與pH、NO-3-N含量呈正相關(guān)關(guān)系，與TC含量、TN含量、OM含量、C/N比呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。對(duì)于氨氧化古菌，Nitrososphaera、Unclassified_k_norank_d_Bacteria、Norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota與pH、C/N比呈正相關(guān)關(guān)系，與TC含量、TN含量、OM含量、NH+4-N含量、NO-3-N含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

進(jìn)一步進(jìn)行環(huán)境因子與物種的相關(guān)分析（圖9）。對(duì)于氨氧化細(xì)菌，pH值與Nitrosovibrio、Unclassified_o_Nitrosomonadales呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.810，P<0.05;r=0.714，P<0.05）與Norank_o_environmental_sample_c_Betaprotebacteria呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.738，P<0.05），Environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae與NO-3-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.756，P<0.05）。對(duì)于氨氧化古菌，OM含量與Norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.785，P<0.05）。

3討論

本研究探討了低溫條件下人工濕地沉積物硝化潛勢(shì)，并應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，針對(duì)氨氧化微生物的功能基因amoA進(jìn)行擴(kuò)增，較全面地考察了人工濕地冬季低溫時(shí)期沉積物中氨氧化微生物的群落組成，從α-多樣性、β多樣性、群落組成及其與環(huán)境因子的關(guān)系等方面進(jìn)行分析。硝化潛勢(shì)是短期人為添加外源氮條件下的硝化強(qiáng)度，反映的是硝化作用的第一步——氨氧化作用的潛力，其產(chǎn)物NO-2是一些厭氧過(guò)程底物的重要來(lái)源，硝化作用是濕地環(huán)境有氧無(wú)氧界面的一個(gè)重要過(guò)程[10]。本研究中，冬季人工濕地沉積物PNR最大值為0.30 μg /（g·h），高于國(guó)內(nèi)農(nóng)田和森林生態(tài)系統(tǒng)PNR的平均水平，低于草地生態(tài)系統(tǒng)PNR[13]。

土壤微生物是土壤生化過(guò)程的驅(qū)動(dòng)者，其生物量、群落結(jié)構(gòu)、活性等特性都會(huì)直接影響到土壤硝化潛勢(shì)[5，14]。在本研究中，沉積物AOA amoA基因豐度顯著高于AOB amoA基因豐度。相關(guān)分析結(jié)果也表明，硝化潛勢(shì)和AOA amoA基因豐度呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系，AOA在本研究的人工濕地硝化作用中發(fā)揮著重要的作用，這與杭州灣濱海濕地沉積物及中國(guó)南方酸性土壤中AOA占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)的結(jié)論相一致[15-16]。AOA和AOB有生態(tài)位分異的特征[16]。本研究中，人工濕地沉積物AOA amoA基因豐度與C/N比值呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，AOB amoA基因豐度與OM、TC、TN含量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，這與章芳等[17]的研究結(jié)果相似。多元回歸分析結(jié)果表明，C/N比值是影響AOA amoA豐度的主要環(huán)境因子，C/N比值影響有機(jī)質(zhì)的礦化，C/N比值越低，有機(jī)質(zhì)分解速率越快[17]。TN含量是影響AOB amoA的主要環(huán)境因子。

在計(jì)算氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）的α-多樣性時(shí)，由于各指數(shù)計(jì)算方法的不同，不同指標(biāo)給出的結(jié)果略有差異。本研究中Chao1指數(shù)（豐富度指數(shù)）最高單元的Shannon指數(shù)（多樣性指數(shù)）并不是最高，同樣，Shannon指數(shù)最高單元的Chao1指數(shù)也并不是最高。例如3單元AOB的Chao1指數(shù)最高，但其Shannon指數(shù)僅為1.88，其最大值為2.47;3單元AOA的Chao1指數(shù)最高，但其Shannon指數(shù)僅為2.15，最高為2.88。8單元AOB的Shannon指數(shù)最高，但其Chao1指數(shù)為57.43，最高為58.00;8單元AOA的Shannon指數(shù)最高，但其Chao1指數(shù)為61.00，最高為68.00。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是，3單元中氨氧化微生物的群落組成最復(fù)雜，但群落內(nèi)個(gè)體數(shù)目的分布不均勻，而8單元群落組成不是最復(fù)雜，但其群落組成分布均勻。而Simpson指數(shù)（優(yōu)勢(shì)度指數(shù)）較高單元的Chao1指數(shù)（豐富度指數(shù)）往往較低，Simpson指數(shù)較低單元的Chao1指數(shù)往往較高。

氨氧化微生物在氮素循環(huán)中占有重要的地位，是土壤中較敏感的功能性微生物類群[18]。在群落組成上，氨氧化細(xì)菌的群落多樣性高于氨氧化古菌。本研究中，各濕地單元檢測(cè)到的氨氧化細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)門為Proteobacteria，主要是由β-Proteobacteria（77.51%）組成。β-Proteobacteria作為優(yōu)勢(shì)門的優(yōu)勢(shì)綱，常見于淡水環(huán)境中[19]，海洋中較少發(fā)現(xiàn)。人工濕地中β-Proteobacteria絕大多數(shù)屬于Nitrosomonadales目Nitrosomonadaceae科。Nitrosomonadaceae科主要包含Nitrosospira和Nitrosomonas 2個(gè)屬[20]。Nitrosomonas在硝化作用第一階段起主導(dǎo)作用，可以促進(jìn)NH+4氧化成NO-2;Nitrosospira是陸地生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)種，可作為硝化細(xì)菌，將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽[21]。本研究中人工濕地氨氧化細(xì)菌最多的屬為Unclassified_o_Nitrosomonadales，即在科水平上未分類的Nitrosomonadales目細(xì)菌。本研究中Nitrosospira豐度高于于Nitrosomonas，表明Nitrosospira在硝化作用中的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)。Nitrosomonas青睞于低氨態(tài)氮環(huán)境，而Nitrosospira更適應(yīng)高氨態(tài)氮的污染環(huán)境[22]。不同菌屬的分布不同，Nitrosomonas屬在7、8單元的豐度高于1～6單元，而Nitrosospira屬在7、8單元的豐度低于1～6單元。

氨氧化古菌在淡水濕地生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過(guò)程中占有重要地位，但人們對(duì)其在氨氧化過(guò)程中的貢獻(xiàn)的了解還不夠充分[23]。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，氨氧化古菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氨氧化細(xì)菌的數(shù)量，但是氨氧化古菌是酸性土壤硝化作用的主導(dǎo)者[24]。泉古菌門（Crenarchaeota）和奇古菌門（Thaumarchaeota）是古菌的2種門類， Crenarchaeota是氨氧化古菌的主要類群[25]，但在洞庭湖岸邊沉積物中，發(fā)現(xiàn)的AOA主要是屬于Thaumarchaeota[26]。本研究的人工濕地中，AOA主要屬于Crenarchaeota和Thaumarchaeota 2個(gè)門類，且以Crenarchaeota豐度占優(yōu)。本研究中，不同濕地單元的AOB與AOA存在一定的群落差異性，4單元和5單元、1單元和6單元在AOB菌群組成上較為接近，而6、7、8單元與其他單元之間AOA菌群組成存在較大差異。

氨氧化微生物的多樣性受沉積物多種環(huán)境因子的影響。AOB中豐度較大的Unclassified_o_Nitrosomonadales與pH值和NO-3-N含量呈正相關(guān)關(guān)系，其中與pH值的關(guān)系達(dá)到顯著水平。本研究中，人工濕地沉積物pH值為7.97～8.34，為堿性。AOA中Nitrososphaera與pH值、C/N比值呈正相關(guān)關(guān)系，與TC、TN、OM、NH+4-N、NO-3-N含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

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