龔本華 李先文 唐興貴 羅占云 李江 胡錦 賀化祥 黃鶯 高煥曄

摘要：為了防止植煙土壤養(yǎng)分流失，探索煙草農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本試驗設(shè)置稻草草苫覆蓋、稻草草段覆蓋、地膜覆蓋、露地栽培共4個處理，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，研究了秸稈覆蓋對植煙土壤酸堿度及養(yǎng)分狀況的影響。研究結(jié)果表明：機(jī)編稻草草苫覆蓋可以使pH值偏低的酸性土壤，逐步改良至適宜植煙的微酸性土壤，且保持大田生育期內(nèi)的土壤pH值相對穩(wěn)定。秸稈覆蓋能極顯著地提高植煙季大田中后期的土壤有機(jī)質(zhì)的含量。機(jī)編草苫覆蓋能提高土壤耕作層中的全氮和堿解氮的含量，機(jī)編草苫覆蓋對土壤全氮的增加較為顯著，尤其在移栽后90 d增加最多，但到了移栽后120 d，則以草段覆蓋最高。覆蓋栽培條件下的土壤有效磷的含量總體低于露地栽培處理。稻草秸稈覆蓋能提高大田中后期土壤中速效鉀含量?？傮w來看，稻草草苫覆蓋和草段覆蓋可以作為煙區(qū)替代常規(guī)地膜覆蓋的優(yōu)先選項之一。本研究結(jié)果為煙區(qū)植煙土壤保育技術(shù)提供了參考。

關(guān)鍵詞：秸稈覆蓋方式;植煙土壤;酸堿度;養(yǎng)分狀況

中圖分類號：S1582;S572

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）06-0028-09國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.005

Effects of Straw Mulching on pH and Nutrient Status of Tobacco Growing Soil

GONG Ben-hua1，LI Xian-wen2，TANG Xing-gui2，LUO Zhan-yun2，LI Jiang2，HU Jin1，HE Hua-xiang1，HUANG Ying1，GAO Huan-ye1*

（1College of Tobacco Science of Guizhou University，Guizhou Key Laboratory for Tobacco Quality，Guiyang，Guizhou 550025，China;2Tobacco companies of Guizhou province Qiannan Corporation，Duyun，Guizhou 558000，China）

Abstract：Due to years of cultivation and long-term application of inorganic chemical fertilizers， some tobacco fields gradually lose their nutrient balance. In order to improve the soil nutrients of tobacco planting and explore the sustainable development of tobacco agriculture， a randomized block design was used in this experimen with a total of four treatments： straw mulching， straw segment mulching， plastic film mulching and open-land cultivation treatment. The effects of straw mulching on soil pH and nutrient status were studied. The results showed that? acidic soil with low pH value treated by straw mulching can be gradually improved to slightly acidic soil， which was suitable for tobacco planting， and keep relatively stable pH value in the soil during the growing period. Straw mulching can significantly increase the content of soil organic matter in the middle and later stages of tobacco growing period. Machine-woven straw mulching not only can increase the content of total nitrogen and alkali-hydrolyzed nitrogen in soil tillage layer， but also can significantly increase the content of total nitrogen in soil， especially in 90 days after transplanting. while， that treated with straw mulching is the highest in 120 days after transplanting. The content of available phosphorus in soils under mulch cultivation was lower than that under open-land cultivation. Straw mulch can improve the content of available potassium in soils in the middle and late stages of tobacco growing period. Overall， straw mulching and straw segment mulching can be used as one of the preferred alternatives to conventional plastic film mulching in tobacco growing areas in southern Guizhou， and the results of this study provide a reference for soil conservation technology of tobacco planting in this area.

Keywords：Sogatella furcifera; ABC transporter; sublethal; insecticide; expression analysis

白背飛虱Sogatella furcifera （Horváth）為典型的r￣對策昆蟲，是一種危害嚴(yán)重的遠(yuǎn)距離遷飛性水稻害蟲[1]。它以成蟲、若蟲直接刺吸稻株韌皮部或在葉鞘內(nèi)產(chǎn)卵，破壞水稻韌皮部，影響植物光合速率，從而使水稻生長遲緩，癟粒增加;為害嚴(yán)重時則造成稻株枯死，呈現(xiàn)“虱燒”狀態(tài)[2];同時，白背飛虱還是南方水稻黑條矮縮?。╯outhern rice black￣streaked dwarf virus，SRBSDV）的主要傳播媒介[2]，給水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。長期以來，化學(xué)防治一直都是防治白背飛虱的主要手段[3]，但是容易產(chǎn)生一些負(fù)面影響[4]。據(jù)報道，白背飛虱已對多種殺蟲劑產(chǎn)生明顯抗藥性，導(dǎo)致害蟲再猖獗[5]，這與近年來白背飛虱的暴發(fā)頻率大大增加有著密切的關(guān)系。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP￣binding cassette transporter，

ABC transporter）廣泛分布于各種生物體中，能對生物體內(nèi)各種生物分子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[6]。有學(xué)者對ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子在分子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，以及殺蟲劑抗性、代謝和昆蟲的發(fā)育過程中都起著重要的作用[7]。越來越多的研究表明，昆蟲體內(nèi)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接參與殺蟲劑的抗性，例如，ABCB、ABCC和ABCG等是最為常見的參與殺蟲劑轉(zhuǎn)運(yùn)與抗性形成的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族基因[8]。在桃蚜Myzus persicae 的抗蚜威（pirimicarb）抗性品系中，ABCG 和ABCH亞家族基因表達(dá)水平顯著高于敏感品系[9];小菜蛾P(guān)lutella xylostella ABCA、ABCC、ABCG、ABCH和ABCF亞家族的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在毒死蜱抗性菌株中過表達(dá)[10];灰飛虱Laodelphax striatellus ABCB、ABCC、ABCD和ABCG亞家族中的8個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能參與了灰飛虱對一些殺蟲劑的抗性[11]。對白背飛虱的研究中也發(fā)現(xiàn)，ABCG亞家族基因參與了白背飛虱對殺蟲劑脅迫的適應(yīng)[12，13]。更多研究表明，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)與昆蟲抗性的產(chǎn)生關(guān)系密切。然而，白背飛虱中關(guān)于ABCG亞家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之外的基因還未見報道。

本研究通過RT￣PCR技術(shù)克隆了白背飛虱的ABCB2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并通過qPCR技術(shù)測定了防治白背飛虱的常用藥劑噻蟲嗪、噻嗪酮和阿維菌素LC10、LC25、LC50和LC90脅迫48 h后ABCB2基因的相對表達(dá)量，旨在了解ABCB2基因在白背飛虱響應(yīng)殺蟲劑脅迫中的作用，為研究白背飛虱對殺蟲劑的適應(yīng)及抗藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

11供試?yán)ハx

白背飛虱于2013年采自貴陽市花溪區(qū)水稻田，在室內(nèi)不接觸任何農(nóng)藥飼養(yǎng)至今。飼養(yǎng)條件為：溫度（25±1） ℃，相對濕度70%±10%，光照L∶D=16∶8。以3齡若蟲為供試?yán)ハx。

12供試試劑

試劑名稱及其生產(chǎn)廠家如表1所示。

13蟲源準(zhǔn)備

基于本實驗室前期對白背飛虱毒力測定結(jié)果[14]，隨機(jī)挑選300頭3齡若蟲，采用稻莖浸漬法[15]，用噻蟲嗪、噻嗪酮和阿維菌素的4個濃度（LC10、LC25、LC50、LC90）分別進(jìn)行脅迫處理。將處理后的白背飛虱置于人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)48 h后取樣，每個樣品取15頭存活若蟲，每個處理重復(fù)3次，放置在￣80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

14總RNA提取及cDNA合成

將上述所取樣品置于研缽中用液氮充分研磨后，通過Trizol試劑提取白背飛虱總RNA，具體按照Trizol試劑說明書進(jìn)行操作[16]。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA質(zhì)量，最后按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書合成cDNA第一鏈[16]，以此作為PCR擴(kuò)增模板。

15白背飛虱ABCB2基因的克隆

通過本實驗室前期實驗轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中找到白背飛虱ABCB2基因的部分片段[17]，再以此片段為模板在白背飛虱全基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行搜索[18]，找到相對應(yīng)的基因，并通過NCBI 進(jìn)行Blast比對，初步確定該基因為ABCB2基因。利用Primer Premier 60軟件設(shè)計基因特異性引物（表2），進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1～3 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測合格后，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到載體上做克隆，將克隆后的產(chǎn)物繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)送往測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果利用Blastx 進(jìn)行相似性比對。

16白背飛虱ABCB2基因序列分析

基于已獲得的白背飛虱ABCB2基因的cDNA全長序列，利用NCBI（http：//wwwncbinih gov/ BLAST/）的BLAST程序進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的相似性搜索比對;利用DNAMAN軟件（version 60、Lynnon Biosoft、Quebec、Canada）分析推斷得氨基酸序列;利用ORF Finder軟件（http：//wwwncbinlmnih

gov/gorf/gorfhtml）鑒定白背飛虱ABCB2基因的ORF;利用SWISS￣PROT（ExPASy server）工具的“Compute pI / Mw”（http：//auexpasyorg/tools/pi_toolhtml）計算ABCB2的分子量和理論等電點;使用PFAM軟件（http：//pfamxfamorg/）預(yù)測ABCB2的保守結(jié)構(gòu)域;采用MEGA 70 軟件[19]中的鄰接法（neighbor￣joining，NJ） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)運(yùn)行1 000次。

17殺蟲劑脅迫下白背飛虱ABCB2基因的表達(dá)分析

根據(jù)白背飛虱ABCB2基因cDNA全長序列設(shè)計熒光定量引物，從白背飛虱RPL9基因（Genebank：KM885285）作為內(nèi)參基因[20]，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，依據(jù)表2中所設(shè)計的引物進(jìn)行熒光定量 PCR。檢測不同種殺蟲劑和不同濃度殺蟲劑脅迫后的白背飛虱ABCB2基因的表達(dá)量，每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系和條件參照 2 x iIaqTM SYBR Green supermix試劑盒說明書，具體反應(yīng)體系和條件如下（見表3）：

反應(yīng)條件：

95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s，50 ℃退火并延伸30 s，40個循環(huán);接著 60～95 ℃ 的溶解曲線。

18數(shù)據(jù)分析

熒光定量所得表達(dá)數(shù)據(jù)用SPSS 170 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析（One￣way ANOVA）和LSD多重比較，并利用2-△△CT法來計算白背飛虱ABCB2基因在不同殺蟲劑及不同濃度處理后的相對表達(dá)量，最后采用Sigma Plot 125軟件進(jìn)行圖形繪制。

2結(jié)果與分析

21白背飛虱ABCB2基因克隆和序列分析

以白背飛虱的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，得到1個ABCB亞家族基因;并采用RT￣PCR技術(shù)對其進(jìn)行驗證，得到長度為2 412 bp的基因片段;通過NCBI比對，得到了白背飛虱ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族基因，命名為ABCB2（MN475970）。分析顯示，ABCB2 cDNA全長序列包含完整的2 265 bp，編碼754個氨基酸的開放閱讀框（ORF）（圖1）。其分子量約為83855 kDa，預(yù)測理論等電點為929。

22白背飛虱ABCB2系統(tǒng)發(fā)育及結(jié)構(gòu)域分析

使用PFAM軟件對ABCB2的保守結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明：白背飛虱ABCB2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含有1個核苷酸結(jié)合域（Nucleotide binding domain，NBD）和1個跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane domain，TMD），屬于半分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（圖2）。為分析獲得的白背飛虱ABCB2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與其他物種ABCB亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員的進(jìn)化關(guān)系，將白背飛虱ABCB2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與所選取物種的ABCB亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：在發(fā)育樹中，ABCB2與褐飛虱、灰飛虱兩種飛虱距離較近，尤其以灰飛虱的距離最近，說明白背飛虱與灰飛虱和褐飛虱具有較近的親緣關(guān)系，而與其他昆蟲的ABCB亞族成員親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

23殺蟲劑脅迫下白背飛虱ABCB2基因表達(dá)分析

通過噻蟲嗪、噻嗪酮和阿維菌素的4個濃度（LC10、LC25、LC50、LC90）分別處理白背飛虱3齡若蟲48 h后，測定在殺蟲劑脅迫下白背飛虱ABCB2基因的相對表達(dá)量。在白背飛虱ABCB2基因表達(dá)量分析中發(fā)現(xiàn)（圖3）：與對照組（CK）相比，噻蟲嗪LC10濃度脅迫后的ABCB2基因表達(dá)量被顯著誘導(dǎo)（P<005），但LC25、LC50 和LC90 處理組與對照組相比，ABCB2基因表達(dá)量并無顯著性變化（P>005），且隨著噻蟲嗪濃度升高，白背飛虱ABCB2基因的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢。在噻嗪酮LC25處理下的ABCB2基因相對表達(dá)量顯著低于對照組，而在噻嗪酮LC10濃度處理下顯著誘導(dǎo)表達(dá)（P<005），但LC50 和LC90 處理組與對照組相比差異不顯著。與之相反的是，阿維菌素脅迫白背飛虱3齡若蟲48 h后，ABCB2基因的表達(dá)量僅在LC90濃度處理下顯著誘導(dǎo)，而在LC10和LC25濃度處理下ABCB2基因相對表達(dá)量均顯著低于對照組（P<005），且隨著濃度升高其表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢。

3結(jié)論與討論

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類重要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在生物體內(nèi)以全分子或半分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白形式存在。全分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含2個NBD和2個TMD，半分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括1個NBD和1個TMD[21]。在本研究中，我們依托白背飛虱的轉(zhuǎn)錄組和全基因組數(shù)據(jù)，結(jié)合RT￣PCR法，成功獲得了一個ABCB亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，命名為ABCB2。ABCB2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含有1個NBD和1個TMD，屬于半分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這一結(jié)果，與對灰飛虱的研究結(jié)果一致[11]。另外，我們對其他昆蟲的相似基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)該基因均含有1個NBD和1個TMD，屬于半分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（圖2），表明該基因在昆蟲中是高度保守的。

害蟲抗性的產(chǎn)生機(jī)制主要歸因于酶活性的增強(qiáng)，因為酶活性的增強(qiáng)可以快速代謝部分殺蟲劑物質(zhì)[22]，而解毒過程可分為3個階段同，即Ⅰ期、Ⅱ期代謝酶解毒過程和Ⅲ期轉(zhuǎn)運(yùn)體體外轉(zhuǎn)運(yùn)[23]。參與Ⅰ期和Ⅱ期解毒過程的主要酶有：P450單加氧酶、谷胱甘肽S￣轉(zhuǎn)移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarEs）等[23]，而ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則是Ⅲ期轉(zhuǎn)運(yùn)體的主要組成部分[24]。越來越多的研究表明，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)與昆蟲抗性的產(chǎn)生關(guān)系密切。白背飛虱在高劑量（LC85）的環(huán)氧蟲啶處理下，一個ABCG基因和一個ABCC基因的表達(dá)被上調(diào)，并且在低劑量（LC15）的環(huán)氧蟲啶處理下兩個ABCG基因被上調(diào)[12];阿拉伯按蚊Anopheles arabiensis DDT 抗性品系中，ABCG亞家族基因表達(dá)量均增加[25]。另有研究表明，ABCB6和多藥耐藥蛋白ABCG2是細(xì)胞內(nèi)卟啉類化合物平衡調(diào)節(jié)的兩個主要成員[26]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，噻嗪酮和噻嗪酮LC10濃度處理能夠顯著誘導(dǎo)白背飛虱ABCB2基因的表達(dá)水平;另外，阿維菌素脅迫后，ABCB2基因的表達(dá)量在LC90濃度處理下被顯著誘導(dǎo)。這些結(jié)果表明：白背飛虱ABCB2基因能夠響應(yīng)殺蟲劑的脅迫，但對不同殺蟲劑及其同一種殺蟲劑的不同濃度，其作用不同。本研究結(jié)果，可為進(jìn)一步了解ABCB2基因在白背飛虱抗藥性的產(chǎn)生及其對殺蟲劑脅迫的適應(yīng)性中的作用打下基礎(chǔ)。

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