尹文露，崔東遙，李瑩瑩，孫景賢，李雯琪，常亞青，湛垚垚

(大連海洋大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)是生物體糖酵解途徑(Glycolytic pathway)中一個重要的限速調(diào)節(jié)別構(gòu)酶，負責將磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate)上的高能磷酸基團轉(zhuǎn)移至二磷酸腺苷(ADP)生成三磷酸腺苷(ATP)，同時生成丙酮酸(Pyruvate acid)，其中，ATP是機體生命活動的能量“貨幣”，而丙酮酸既是糖酵解途徑的終產(chǎn)物，也是機體糖代謝及多種物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化的重要中間體[1]。丙酮酸激酶有PKL、PKR、PKM1和PKM2 4種同工酶，按照編碼基因不同可將其分為PKL、PKR和PKM1、PKM2兩大亞類，亞類同工酶的分類按照基因轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生的mRNA不同而進行區(qū)分[2]。有研究顯示，與健康人類相比，腫瘤患者血液中PKM2含量會明顯升高[3]，而且PKM2的檢測靈敏度要明顯高于傳統(tǒng)的癌癥標記物——癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)[4]，因此，可將PKM2作為一種癌癥標記物輔助提高人類癌癥早期的篩查效率[3]。

目前，對水產(chǎn)動物PK的研究較少。有研究表明，水產(chǎn)動物PK的酶活性易受到外源環(huán)境因子或環(huán)境脅迫影響：高濃度亞硝酸氮會嚴重抑制刺參Apostichopusjaponicus體腔液、體壁和肌肉中的PK活性，影響刺參體內(nèi)的糖代謝過程[5]；淡水或較高鹽度會導致半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis肝臟內(nèi)的PK活性降低，從而降低其肝臟內(nèi)糖酵解的速度，影響其能量代謝過程[6]。

海水酸化(seawater acidification)是因海洋富集并溶解了過量的二氧化碳氣體(CO2)而導致的海水pH降低的一種環(huán)境問題[7]。大量研究證實，海水酸化不僅可通過影響藻類[8-9]、珊瑚[10]、貝類[11]和棘皮類[12-14]等海洋生物的生物礦化作用破壞海洋碳循環(huán)，還可影響海洋生物的繁殖、生長、發(fā)育和免疫防御等生理生化過程[15-17]，進而降低海洋生物多樣性，導致整個海洋生態(tài)系統(tǒng)的失衡[18]。海膽是典型的海洋淺海代表生物之一，也是研究海水酸化對海洋系統(tǒng)影響的重要模式生物。研究證實，海水酸化不僅能影響成體海膽的耗氧率和排氨率[19]，也會造成海膽早期胚胎分裂延遲、囊胚孵化率降低，以及四腕浮游幼體存活率降低、鈣化骨針外露和對稱性缺失等問題[20-21]。

中間球海膽Strongylocentrotusintermedius俗稱蝦夷馬糞海膽，具有棘刺短、性腺品質(zhì)良好和生長發(fā)育快的特點，目前已成為中國海水增養(yǎng)殖業(yè)重要的經(jīng)濟品種。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與自然海水條件相比，不同海水酸化條件下，成體中間球海膽多個組織中的乳糖脫氫酶(LDH)基因的相對表達量及其總酶活力均發(fā)生明顯變化[22]。由于LDH的催化底物丙酮酸的產(chǎn)生速度可由PK直接調(diào)控，因此，猜測中間球海膽的丙酮酸激酶面對海水酸化的脅迫也有響應(yīng)。本研究中，利用分子生物學技術(shù)克隆獲得了中間球海膽PK基因(SiPK)的cDNA全長序列，并利用生物信息學手段對其序列結(jié)構(gòu)和進化特點進行分析，比較了不同海水酸化條件下，成體中間球海膽不同組織中PK基因的相對表達量及總PK酶活性的變化情況，旨在探明中間球海膽PK基因的序列信息、結(jié)構(gòu)特點、進化地位和總PK酶活性，以及對海水酸化的響應(yīng)方式。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用中間球海膽購自遼寧省大連市旅順龍王塘養(yǎng)殖場。正式試驗前將海膽于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室暫養(yǎng)兩周，將海膽置于1000 L循環(huán)海水槽中，持續(xù)通氣以保持水體溶氧充足，并投喂新鮮海帶Saccharinajaponica，每兩天全部換水一次。試驗海水來自大連市黑石礁海區(qū)(經(jīng)過濾處理)，暫養(yǎng)期間水溫為(20±2)℃，鹽度為31.26±0.09，pH為8.10±0.03。

1.2 方法

1.2.1 海水酸化脅迫試驗 根據(jù)政府間氣候變化專門委員會預測結(jié)果[23]，本試驗中設(shè)置自然海水(對照組)、ΔpH=-0.3(SA1)、ΔpH=-0.4(SA2)、ΔpH=-0.5(SA3)4組(ΔpH表示與自然海水pH的差值)，每組設(shè)3個平行。試驗選取120只健康且規(guī)格均一的成體中間球海膽，其殼徑為(4.80±0.10)cm，體質(zhì)量為(55.27±3.56)g，隨機分配至各試驗組(每個平行10只)，進行為期60 d的海水酸化脅迫試驗。

酸化海水制備按照李瑩瑩等[24]描述的方法進行。試驗所用合成氣體均購自大連大特氣體有限公司。試驗期間，每天投喂海帶一次，每天換水量為總水量的1/2，每2 d全量換水一次，其中，酸化組所換海水需經(jīng)相應(yīng)的酸化處理，以保持各試驗組海水pH的相對穩(wěn)定，換水時及時清除殘餌及糞便。為避免海水pH的劇烈波動，換水前后需進行海水參數(shù)檢測，以確保各試驗組海水參數(shù)的穩(wěn)定。

試驗期間，使用pH計(HI 9124，HANNA，意大利)和水質(zhì)儀(YSI6920，美國)實時監(jiān)測各試驗組海水的pH、溫度和鹽度，測得各組水溫為(20±2)℃、鹽度為31.26±0.09；依據(jù)Mehrbach等[25]描述的pH滴定法測定總堿度(TA)；利用SWCO2軟件(http://neon.otago.ac.nzresearch/mfc/ people/keith_hunter/software/software.hm)計算各組二氧化碳的濃度ρ(CO2)(表1)。

表1 海水酸化期間各試驗組的海水參數(shù)

Tab.1 Seawater parameters during the acidification experiment

組別group酸堿度pH總堿度/(μmol·kg-1)total alkalinity二氧化碳濃度/μatmρ(CO2)control8.10±0.032367.63±10.18526.22±21.41SA17.82±0.032362.58±20.041058.92±72.42SA27.68±0.032366.42±18.371566.05±62.70SA37.55±0.042372.33±19.512125.14±94.44

1.2.2 樣品的收集

(1)SiPK基因的克隆、組織表達和總PK酶活性檢測樣品的收集。從對照組選擇健康、活力好的中間球海膽3只，置于冰上分別取其體腔液、管足、性腺和腸組織，一部分樣品立即用液氮冷凍后存放于冰箱(-80 ℃)中，用于PK基因的克隆和組織表達規(guī)律檢測；另一部分樣品直接凍存于冰箱(-80 ℃)中，用于總PK酶活性測定。

(2) 海水酸化脅迫試驗樣品的收集。酸化試驗結(jié)束后，將各組海膽禁食48 h后，從每個組隨機挑選5只海膽進行樣品收集。收集方法同上。

1.2.3SiPKcDNA全長序列克隆

(1)總RNA的提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄及5′/3′末端模板合成。用動物組織總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取中間球海膽管足、腸、性腺和體腔液4種組織的總RNA，使用核酸蛋白檢測儀(SimpliNano)測定RNA的濃度和純度，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。對檢測合格的總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)[寶生物工程(大連)有限公司]進行反轉(zhuǎn)錄獲得第一條鏈cDNA模板；使用SMARTer RACE 5′/3′試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]將中間球海膽體腔液中的總RNA合成5′/3′末端RACE cDNA模板；將得到的第一條鏈cDNA模板和5′/3′末端RACE cDNA模板保存于-20 ℃冰箱，備用。

所謂職業(yè)道德，是指某個行業(yè)內(nèi)的職業(yè)規(guī)范與普遍認同的道德原則。對于醫(yī)藥行業(yè)而言，職業(yè)道德要求從業(yè)人員要有救死扶傷的責任意識、無私奉獻的偉大精神[15]，目前醫(yī)藥行業(yè)存在下列問題。

(2)SiPK核心片段的克隆。根據(jù)中間球海膽轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出的PK片段，設(shè)計5對特異性引物用于SiPK核心片段的克隆(表2)，設(shè)計引物完成后將引物序列送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物合成。基因克隆參照柳林等[26]描述的方法。

(3)SiPK的5′/3′末端片段克隆。將所獲得的5段核心片段序列進行拼接后于NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，最終確定其為SiPK的核心片段，隨后以此為模板，設(shè)計5′和3′RACE特異性外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物(表2)，然后以cDNA為模板分別進行5′/3′ 末端片段的擴增，具體參照李蒙等[27]的方法。

表2 試驗用PCR引物序列Tab.2 PCR primers used in this study

(4)SiPK序列的生物信息學分析。對SiPKcDNA全長序列進行生物信息學分析，按崔東遙等[22]的方法進行。采用Blastx進行序列相似性分析，采用DNAMAN 6.0軟件進行多重序列比對，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計SiPK基因的實時熒光定量引物(表2)，選取β-actin為內(nèi)參基因，并對引物的特異性和擴增效率進行檢測。使用ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和SYBR?Premix ExTaq TM ⅡKit[寶生物工程(大連)有限公司]進行qRT-PCR試驗，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序均參照江東能等[28]方法。采用2-ΔΔCt法計算SiPK基因的相對表達量。

1.2.5 中間球海膽組織總PK酶活性的測定 取0.5～1.0 g組織樣品經(jīng)液氮研磨后，按質(zhì)量與體積比為1∶9(g∶mL)加入無菌海水，低溫離心(4 ℃，430×g)10 min后取上清液，按照丙酮酸激酶(PK)測試盒(A076-1，南京建成生物工程有限公司)說明書步驟測定總PK酶活性。使用Epoch酶標儀(Biotek，美國騰儀器有限公司)測定反應(yīng)底物吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean± S.D.)表示。對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiPK基因的cDNA全長序列

SiPK基因的cDNA序列全長為3616 bp，其中，5′非編碼區(qū)長度為91 bp，3′非編碼區(qū)長度為1911 bp，具有一個長度為1614 bp(包含終止密碼子)、編碼537個氨基酸的開放閱讀框(ORF)(圖1)，原子組成為C4051H6467N1137O1215S46，推測該基因編碼的PK蛋白相對分子質(zhì)量為58 740，理論等電點為6.62。二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，SiPK蛋白包含42個無規(guī)則卷曲、22個延伸鏈和19個α-螺旋(見電子版附圖1)。以人PK蛋白(PDB登陸號：3srf.1.A)為模板構(gòu)建SiPK蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果顯示，二者的一致性為63.88%(見電子版附圖2)。采用在線分析軟件對SiPK氨基酸序列分析顯示，該蛋白為非跨膜、溫和疏水蛋白且無信號肽結(jié)構(gòu)。

2.2 SiPK多重序列比對及系統(tǒng)進化分析

多序列比對結(jié)果顯示，14種生物PK氨基酸序列的平均一致性為60.21%(見電子版附圖3)，其中，中間球海膽與人類Homosapiens、小鼠Musmusculus、白鱀豚Lipotesvexillifer、非洲爪蟾Xenopuslaevis、斑馬魚Daniorerio、青鳉Oryziaslatipes、紅鰭東方鲀Takifugurubripes、蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis、長棘海星Acanthasterplanci、刺參Apostichopusjaponicus和紫球海膽StrongylocentrotuspurpuratusPK的一致性均大于50%，與南美白對蝦Penaeusvannamei、美洲牡蠣CrassostreavirginicaPK的一致性則均小于50%；中間球海膽與其他3種棘皮動物的PK氨基酸序列比較，其中，與長棘海星PK的一致性最高，達66.26%，與刺參PK的一致性為65.25%，與紫球海膽PK的一致最低，為61.27%。系統(tǒng)進化樹分析顯示，中間球海膽與紫球海膽、刺參的PK聚為一支(圖2)。

Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of PK amino acid sequence from sea urchinStrongylocentrotusintermediusand other 13 species

2.3 SiPK基因及總PK酶活性的組織表達規(guī)律

從圖3-B可見，中間球海膽各組織的總PK酶活性依次為管足>性腺>體腔液>腸，其中，管足中總PK酶活性最高且顯著高于其他3種組織(P<0.05)，性腺組織中總PK酶活性顯著高于腸和體腔液(P<0.05)，而腸與體腔液中總PK酶活性無顯著性差異(P>0.05)。

注：標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)

Note：The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences

圖3 中間球海膽不同組織中PK基因的相對表達量及總PK酶活性

Fig.3 Relative expression level ofPKgene and total PK activity in different tissues of sea urchinStrongylocentrotusintermedius

2.4 海水酸化對各組織中PK基因表達及總PK酶活性的影響

從圖4-A可見：與對照組相比，經(jīng)過60 d 海水酸化脅迫后，中間球海膽管足、腸、性腺和體腔液中PK基因的相對表達量均呈現(xiàn)不同程度的變化；隨著酸化程度的加重，管足、性腺和體腔液中PK基因的相對表達量均呈極顯著下降趨勢(P<0.01)，其中管足和性腺中基因表達量下降幅度更大；腸組織中，當海水pH降低0.3個單位時(SA1)，PK基因表達量極顯著低于對照組(P<0.01)，當海水pH降低0.4個單位時(SA2)，基因表達量略低于對照組(P>0.05)，當海水pH降低0.5個單位時(SA3)，基因表達量則極顯著高于對照組(P<0.01)。

從圖4-B可見：與對照組相比，經(jīng)過60 d海水酸化脅迫處理后，各酸化組中間球海膽管足、腸、性腺和體腔液中總PK酶活性均呈一定的組織特異性變化；隨著酸化程度的加重，管足組織中總PK酶活性呈極顯著下降的趨勢(P<0.01)，腸組織總PK酶活性呈極顯著上升的趨勢(P<0.01)，性腺中總PK酶活性呈先升高后降低的趨勢(P<0.05)，體腔液中總PK酶活性則呈顯著下降的趨勢(P<0.05)。

注：*表示與對照組有顯著性差異(P<0.05)；**表示與對照組有極顯著性差異(P<0.01)

Note： *means significant difference compared with the control (P<0.05)；**means very significant difference compared with the control(P<0.01)

圖4 不同海水酸化條件下中間球海膽各組織中PK基因的相對表達量及總PK酶活性

Fig.4 Relative expression level ofPKgene and total PK activity in different tissues of sea urchinStrongylocentrotusintermediusunder different seawater acidification conditions

3 討論

3.1 中間球海膽PK基因的序列特征

本研究中利用cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù)首次獲得了中間球海膽PK基因的cDNA全長(NCBI登錄號：MN_240486)，經(jīng)生物信息分析發(fā)現(xiàn)，中間球海膽PK核苷酸序列與紫球海膽的相似度最高，為97.82%；而多重序列比對結(jié)果顯示，中間球海膽PK二級結(jié)構(gòu)與長棘海星最相近，中間球海膽、紫球海膽和長棘海星雖棲居于同一類型的環(huán)境，但中間球海膽與長棘海星的棲息溫度相似且不同于紫球海膽。這與鄧小弓等[29]研究中長期生活在地下的裸鼴鼠Heterocephalusglaber和高原鼢鼠Eospalaxbaileyi的氨基酸序列會產(chǎn)生一定程度的趨同進化(Convergent evolution)結(jié)果相似，因此，筆者猜測，中間球海膽和長棘海星PK間可能存在趨同進化。比較中間球海膽與刺參、紫球海膽和長棘海星PK蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，中間球海膽與長棘海星、刺參PK蛋白的二級結(jié)構(gòu)相似度較高，而與紫球海膽PK相似度最低，推測中間球海膽PK在二級結(jié)構(gòu)形成上具有一定的種屬特異性。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析顯示，中間球海膽PK與親緣關(guān)系較遠的哺乳動物人類PK的一致性為63.88%，二者在三維結(jié)構(gòu)上差異性較小，這表明中間球海膽PK的空間結(jié)構(gòu)和生物學功能在進化過程中具有較高的保守性。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，中間球海膽PK與同屬于棘皮動物的紫球海膽、刺參的PK聚為一支，符合其進化及分類地位。

3.2 中間球海膽PK基因及總PK酶活性的組織表達規(guī)律及其對海水酸化的響應(yīng)方式

本研究表明，中間球海膽PK基因相對表達和總PK酶活性均具有顯著而鮮明的組織特異性。其中，管足和性腺是PK基因相對表達和總PK酶活性較高的兩種組織。管足是海膽的運動器官，也是能量消耗的主要器官，較高水平的PK基因表達和總PK酶活性也進一步反映了海膽管足組織中的糖酵解過程較為活躍，此外，Lawrence等[30]發(fā)現(xiàn)，中間球海膽在繁殖期會將其用于殼徑和體質(zhì)量增長的能量降至最低水平，而將更多的能量分配給性腺組織，優(yōu)先發(fā)育性腺組織以保證繁殖的正常進行。本研究中取樣時間正處于中間球海膽繁殖期，在性腺組織中檢測到較高水平的PK基因表達和總PK酶活性，這一結(jié)果也印證了Lawrence等的觀點。

海水酸化脅迫試驗結(jié)果顯示，不同海水酸化條件下，中間球海膽管足、腸、性腺和體腔液組織中的PK基因表達量和總PK酶活性各不相同，這說明中間球海膽PK基因和PK酶在應(yīng)答不同海水酸化脅迫的策略上具有一定的組織特異性。海膽的管足是一種高度特化的器官，可附著于基底[31]，是海膽主要的運動器官和觸覺器官，本研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，不同海水酸化脅迫條件下中間球海膽管足中的PK基因的相對表達量和總PK酶活性均處于極顯著降低趨勢。值得注意的是，與其他3種組織相比，不同海水酸化脅迫條件下，中間球海膽管足組織中PK基因的相對表達量最低，這與本課題組前期研究海水酸化會對中間球海膽多個組織中LDH造成影響具有一定的相似性[22]，由此，筆者推測，中間球海膽為了應(yīng)對海水酸化的脅迫可能會通過降低運動器官的無氧代謝水平，節(jié)省能量消耗，并將其主要能量用于調(diào)節(jié)體內(nèi)外酸堿平衡。

海膽性腺是海膽主要的食用部分[33]，本研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，不同海水酸化脅迫條件下中間球海膽性腺組織中PK的表達量均處于極顯著降低趨勢，由此推測，海水酸化可能通過降低中間球海膽性腺組織中的能量代謝相關(guān)基因的表達，而削弱其用于性腺發(fā)育的能量，這一結(jié)果與海水酸化導致紫海膽Anthocidariscrassispina[34]、馬糞海膽Hemicentrotuspulcherrimus[35]和加州紅海膽Strongylocentrotusfranciscanus[36]能量代謝水平降低、性腺發(fā)育緩慢的結(jié)果具有一定的相似之處。而中間球海膽的性腺組織中總PK酶活性隨著海水酸化程度的加重呈先極顯著升高(SA1組)后逐漸降低的趨勢(SA2、SA3組)，筆者猜測，當海水酸化程度較低時，中間球海膽可能先通過提高其PK酶的催化效率而補償海水酸化對其能量產(chǎn)生的影響，以便其性腺能夠有足夠的能量進行發(fā)育，而伴隨著海水酸化程度的不斷加重和性腺中PK基因表達產(chǎn)物的減少，中間球海膽性腺組織中的總PK酶活性被嚴重抑制，進而對其性腺的正常發(fā)育成熟乃至繁殖造成影響，但就其背后的細胞應(yīng)激機制及分子響應(yīng)策略仍需進一步研究和探討。

海膽體腔液中存在多種非特異性的免疫因子，其與脊椎動物的淋巴液功能相似，可直接抵抗入侵的病原體，是海膽進行免疫防御的重要組織[37]。此外，海膽體腔液也為調(diào)節(jié)體內(nèi)外滲透壓平衡和氣體交換提供了場所。本研究中發(fā)現(xiàn)，不同海水酸化脅迫條件下，中間球海膽體腔液中PK基因的相對表達量和總PK酶活性均顯著低于對照組，且與其他3種組織相比，體腔液中的PK基因的相對表達及總PK酶活性下降趨勢較小。而Collard等[38]研究發(fā)現(xiàn)，海水pH的降低會使海膽體腔液的緩沖能力提高，因此，筆者猜測，中間球海膽可能將體內(nèi)大部分能量轉(zhuǎn)移至體腔液，以提高體腔液的代謝能力和緩沖能力，應(yīng)對海水酸化脅迫。