劉漢堤，李曉東、*，曹萌，代亮，李藝，蔣秋月,耿丹

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.盤錦光合蟹業(yè)有限公司研發(fā)中心，遼寧省中華絨螯蟹育種重點實驗室，遼寧 盤錦 124200； 3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

中華絨螯蟹Eriocheirsinensis，俗稱河蟹、大閘蟹，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛[1]。餌料作為中華絨螯蟹生長過程中最重要的營養(yǎng)來源，其對生長和肝胰腺、性腺發(fā)育的影響一直被眾多學(xué)者關(guān)注。由于雌蟹的可食部分含量及營養(yǎng)價值相對更高，因此，關(guān)于餌料對雌蟹育肥和發(fā)育等方面的研究也較多。常國亮等[2]研究了3種餌料對中華絨螯蟹雌蟹卵巢發(fā)育和育肥效果的影響，發(fā)現(xiàn)在育肥效果和卵巢發(fā)育方面，優(yōu)質(zhì)膨化飼料要優(yōu)于冰魚和傳統(tǒng)硬顆粒飼料。闕有清等[3]、何杰等[4]、潘杰等[5]的研究也均發(fā)現(xiàn)，餌料在中華絨螯蟹生長過程中起著重要的作用。

中華絨螯蟹在自然界中為雜食性動物，動物性餌料有魚、蝦、螺、蜆等，植物性餌料有小麥、玉米等[1]。爭食和好斗是中華絨螯蟹的天性，其經(jīng)常為爭奪食物互相格斗[1]。中華絨螯蟹之間的打斗不但會給蟹肢體帶來損傷甚至死亡，也會消耗體能影響其生長，從而降低成活率，影響?zhàn)B殖經(jīng)濟效益。Sneddon等[6]通過在有無餌料的情況下對雄性岸蟹Carcinusmaenas之間的打斗進行研究發(fā)現(xiàn)，餌料存在時，蟹的注意力會更多地集中在爭奪餌料上，打斗持續(xù)時間比沒有餌料時顯著縮短。陳翔宇等[7]研究了食性對克氏原螯蝦Procambarusclarkii格斗行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在配合飼料投喂下的螯蝦打斗時長和打斗次數(shù)顯著小于分別投喂鯽和生菜的組。秦浩等[8]研究了餌料種類對中國明對蝦Fenneropenaeuschinensis行為的影響，結(jié)果顯示，投喂鹵蟲比投喂配合飼料爭斗激烈。但關(guān)于餌料種類對中華絨螯蟹打斗行為的研究目前尚未見報道。

劉超等[9-10]通過研究餌料中脂肪酸的含量及小鼠腦內(nèi)C20∶5n3(EPA)和C22∶6n3(DHA)含量的不同，分析了其對小鼠攻擊行為的影響，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，脂肪酸含量的不同與小鼠由應(yīng)激所產(chǎn)生的攻擊行為具有一定的因果關(guān)系。但關(guān)于脂肪酸對水生生物行為方面的影響尚未見報道。

本研究中，通過設(shè)計配合飼料、粗飼料及動物性餌料3種投喂模式，研究各投喂模式下中華絨螯蟹雌蟹的肝胰腺、性腺發(fā)育、脂肪酸組成的差異，以及對中華絨螯蟹打斗行為的影響，旨在為實際生產(chǎn)中中華絨螯蟹的餌料選擇及科學(xué)投喂提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2018年9月在盤錦光合蟹業(yè)有限公司科技研發(fā)中心進行。試驗用蟹為盤錦光合蟹業(yè)有限公司所培育的品種“光合1號”，根據(jù)甲殼長度、寬度及體質(zhì)量，選取規(guī)格接近的無病害、肢體完整、同一家系(以排除遺傳因素干擾)的中華絨螯蟹雌性成熟蟹150只，體質(zhì)量為(55.00±3.09)g，體寬為(51.48±1.02)mm，體長為(47.79±1.42)mm。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理 將每只蟹單獨養(yǎng)殖于直徑為30 cm的聚乙烯塑料白桶中，養(yǎng)殖時間為45 d，試驗所用水為曝氣3 d以上的深井飲用水，自然光周期(12L∶12D)，水溫為20～22 ℃，pH為7.5，每天用充氣泵連續(xù)充氣，保持水中溶氧>5 mg/L，暫養(yǎng)期間每天18:00定時喂食，分組投喂粗飼料(A組)、動物性餌料(B組)及配合飼料(C組)，每組設(shè)置5個平行，投喂量為中華絨螯蟹體質(zhì)量的5%。第2天上午清理殘餌、換水。粗飼料(玉米、豆粕、麥麩、微量元素等)由大連海洋大學(xué)重點實驗室制作，動物性餌料(冰鮮雜魚和蛤蜊，比例1∶1)購自盤錦市水產(chǎn)市場，配合飼料為沈陽禾豐水產(chǎn)飼料有限公司生產(chǎn)。3組餌料的基本營養(yǎng)成分見表1，脂肪酸組成見表2。

1.2.2 打斗行為學(xué)試驗 養(yǎng)殖45 d后，根據(jù)餌料組內(nèi)與餌料組間兩兩配對，共設(shè)6個處理組(AA、BB、CC、AB、AC、BC)，每組試驗設(shè)5個平行，共30組試驗。使用無毒、無味樹膠水彩對試驗蟹進行標記，用以區(qū)別不同餌料組的蟹。打斗場所為120 L的水槽，水槽中放入直徑為30 cm的聚乙烯管，底部鋪有2 cm厚的沙子，模擬中華絨螯蟹的室外條件并為蟹提供附著力。將兩只試驗蟹放入聚乙烯管中，用兩個不透明的容器將兩只蟹分別扣住，待兩只蟹適應(yīng)水體10 min后將容器移走。水槽正上方為紅外網(wǎng)絡(luò)槍式攝像機(TL-IPC525C)連續(xù)拍攝3 h。打斗結(jié)束后通過視頻觀察試驗蟹爭斗發(fā)起方、爭斗次數(shù)及爭斗時長等指標，記錄并進行統(tǒng)計分析。

表1 不同餌料的基本營養(yǎng)成分(干物質(zhì))

Tab.1 Proximate nutrients of different diets (dry mass) g/100 g

表2 不同餌料的脂肪酸組成Tab.2 Fatty acid composition of different diets %

1.2.3 樣品的采集及指標的計算 打斗結(jié)束后，對AB、AC、BC組的試驗蟹共30只全部取樣，解剖取其性腺和肝胰腺并準確稱重(精確到0.01 g)，稱重后將所有樣品保存于-80 ℃冰箱中待生化測定，重復(fù)測定3次，取其平均值。肝胰腺指數(shù)(HSI)和性腺指數(shù)(GSI)計算公式為

HSI=肝胰腺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%，

GSI=卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.4 脂肪酸組成測定 將氯仿甲醇法提取的粗脂肪溶解于0.76%的NaCl中，采用飽和甲醇的石油醚和飽和石油醚的甲醇進行甲酯化，使用氣相色譜儀進行測定。色譜柱為AgIlent 6890-5973N毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。升溫程序：80 ℃保持1 min，階升1∶14 ℃/min升溫至220 ℃。進樣口溫度230 ℃，檢測器溫度285 ℃，氣體流速為0.9 mL/min，分流比為100∶1，上樣量為1 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用平均值±標準差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)、Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同餌料投喂下中華絨螯蟹肝胰腺和性腺發(fā)育

從表3可見：在3種餌料組中，配合飼料組(A)的HSI指數(shù)最大，動物性餌料組(B)的HSI最小，但各組間HSI無顯著性差異(P>0.05)；動物性餌料組GSI指數(shù)顯著高于粗飼料組(P<0.05)，其他組間均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 不同餌料投喂下中華絨螯蟹的肝胰腺和性腺指數(shù)

注：同列中標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note：The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2 不同餌料投喂下中華絨螯蟹脂肪酸組成

從表4可見：在3種餌料投喂下，中華絨螯蟹肌肉、肝胰腺及性腺中分別檢測出11、15、17種脂肪酸,其中C18∶1n8、C18∶2n6c、C16∶0為中華絨螯蟹體內(nèi)含量最高的脂肪酸；肌肉中主要脂肪酸為多不飽和脂肪酸(PUFA)，而肝胰腺和性腺中主要脂肪酸為單不飽和脂肪酸(MUFA)。

肌肉中，各組間僅C18:1n9c含量無顯著性差異(P>0.05)；粗飼料組C20:4n6(ARA)、C20:5n3(EPA)和C22:6n3(DHA)含量顯著低于配合飼料組和動物性餌料組(P<0.05)，而配合飼料組含量略高于動物性餌料組(P>0.05)；粗飼料組多不飽和脂肪酸(∑PUFA)含量顯著低于動物性餌料組和配合飼料組(P<0.05)，其他兩組相差不大。

肝胰腺中，C18:2n6c是多不飽和脂肪酸(PUFA)中的主要脂肪酸，動物性餌料組C18:2n6c含量顯著低于粗飼料組和配合飼料組(P<0.05)，粗飼料組含量最高；配合飼料組C20:5n3(EPA)含量最高，但各組之間無顯著性差異(P>0.05)；動物性餌料組C22:6n3(DHA)含量顯著高于粗飼料和配合飼料組(P<0.05)；動物性餌料組多不飽和脂肪酸(∑PUFA)含量顯著低于粗飼料和配合飼料組(P<0.05)，粗飼料組含量最高。

性腺中，各組間僅C18:3n3和C20:4n6含量無顯著性差異(P>0.05)；配合飼料組C18:2n6c、C20:5n3(EPA)含量顯著高于粗飼料組和動物性餌料組(P<0.05)；各組間C22:6n3(DHA)含量有顯著性差異(P<0.05)，動物性餌料組C22:6n3(DHA)含量最高，粗飼料組含量最低；粗飼料組多不飽和脂肪酸(∑PUFA)含量顯著低于動物性餌料組和配合飼料組(P<0.05)，其中配合飼料組含量最高。

2.3 不同餌料投喂下中華絨螯蟹組內(nèi)打斗行為

從表5可見：各餌料組內(nèi)，中華絨螯蟹在第1 h內(nèi)打斗次數(shù)和打斗時長最多，隨著時間推移，打斗次數(shù)和打斗時長逐漸降低；配合飼料組內(nèi)在第1 h內(nèi)打斗次數(shù)最多且顯著多于其他兩組(P<0.05)，粗飼料組內(nèi)打斗次數(shù)最少；與打斗次數(shù)一樣，配合飼料組內(nèi)在第1 h內(nèi)打斗時間最長且顯著長于其他兩組(P<0.05)，動物性餌料組內(nèi)打斗時長最短。

2.4 不同餌料投喂下中華絨螯蟹組間打斗行為

從表6可見：與同種餌料組內(nèi)的打斗相似，不同餌料組中華絨螯蟹打斗次數(shù)和打斗時長在第1 h內(nèi)最多，隨著時間推移呈下降趨勢；在第1 h和第2 h內(nèi)，AB組打斗次數(shù)最多，BC組打斗次數(shù)最少，二者有顯著性差異(P<0.05)；在打斗時長方面，第1 h內(nèi)，BC組打斗時間最長，AB組打斗時間最短，各組間無顯著性差異(P>0.05)，第2 h內(nèi)，AB組打斗時間最長，BC組打斗時間最短且顯著短于其他組(P<0.05)。

表4 不同餌料投喂下各組中華絨螯蟹脂肪酸組成Tab.4 Fatty acid composition of Chinese mitten handed crab fed different diets %

注：同行中標有不同字母者表示同一組織不同飼料組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)

Note：The means with different letters within the same line are significantly different in the same tissue in the different diet groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter within the same line are not significant differences

表5 不同餌料組內(nèi)中華絨螯蟹打斗次數(shù)和打斗時長Tab.5 Fighting frequency and duration of the Chinese mitten handed carb in different diet groups

表6 不同餌料組間中華絨螯蟹打斗次數(shù)和打斗時長Tab.6 Fighting frequency and duration of the Chinese mitten handed crab among different diet groups

從圖1可見：在AB和AC組，粗飼料組中華絨螯蟹爭斗發(fā)起次數(shù)顯著高于動物性餌料組和配合餌料組(P<0.05)；在BC組，配合飼料組蟹爭斗發(fā)起次數(shù)顯著高于動物性餌料組(P<0.05)。

3 討論

3.1 餌料種類對肝胰腺和性腺發(fā)育的影響

肌肉、肝胰腺及性腺是中華絨螯蟹的主要可食部分，其中肝胰腺和性腺是最具有營養(yǎng)價值的部分。肝胰腺是中華絨螯蟹雄的脂類吸收和貯存器官，受餌料中脂肪含量的影響較大[3]。本研究表明，在不同餌料投喂下中華絨螯蟹的肝胰腺指數(shù)無顯著性差異，但肝胰腺指數(shù)的變化(表3)與餌料中的脂肪含量(表1)基本呈正相關(guān)，因此，選擇高脂肪含量的餌料可以促進中華絨螯蟹的肝胰腺發(fā)育。Sui等[11]研究表明，中華絨螯蟹發(fā)育期肝胰腺指數(shù)及肝胰腺中的脂類成分會隨著性腺指數(shù)和性腺中的脂肪含量升高而降低。本研究中，在動物性餌料投喂下中華絨螯蟹的性腺指數(shù)最高，且性腺指數(shù)大于肝胰腺指數(shù)，說明投喂動物性餌料對中華絨螯蟹性腺的發(fā)育有促進作用，可以加快其性腺發(fā)育。

3.2 餌料種類對脂肪酸組成的影響

蟹類機體的脂肪酸含量組成與餌料脂肪酸含量具有顯著相關(guān)性[12-13]。本試驗結(jié)果顯示，中華絨螯蟹肌肉中EPA，肝胰腺中C15∶0、C16∶0及∑SFA，性腺中C16∶0、∑SFA及EPA等(表4)與餌料中脂肪酸(表2)的含量具有顯著相關(guān)性。可食部位中的脂肪酸和氨基酸的組成及含量是評價蟹類營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標[14]。與畜禽動物相比，水產(chǎn)動物的多不飽和脂肪酸(PUFA)含量較高，故脂肪酸營養(yǎng)價值也更高[15]。本試驗中，中華絨螯蟹肌肉中的多不飽和脂肪酸(PUFA)含量最高，占總脂肪酸的37.34%～42.80%。有研究指出，中華絨螯蟹性腺快速發(fā)育期需要大量的 PUFA 才能保證性腺的正常發(fā)育[16]。本試驗結(jié)果顯示，性腺中配合飼料組的PUFA含量要高于粗飼料組和動物性餌料組，這可能是由于配合飼料中含有較多的PUFA成分，對性腺的發(fā)育具有促進作用，進而可能會提高中華絨螯蟹的繁殖能力[3]。

肝胰腺是中華絨螯蟹脂類存儲和代謝中心，對性腺發(fā)育過程中的脂類積累具有重要影響[17]。脂肪在機體中發(fā)揮作用主要是通過脂肪酸來完成的，尤其是蝦蟹類在生長過程中要完成蛻皮、產(chǎn)卵等過程，對脂肪酸的需求就更加明顯。投喂3種餌料下，在中華絨螯蟹肌肉、肝胰腺和性腺中分別檢測出11、15、17種脂肪酸。因此，不同餌料對肌肉脂肪酸含量影響較小，而對性腺和肝胰腺脂肪酸含量影響較大，這可能是因為中華絨螯蟹性腺和肝胰腺的脂肪酸周轉(zhuǎn)代謝相對于肌肉較快造成的結(jié)果[13,18]。

本研究中，投喂不同餌料組中華絨螯蟹肌肉中的n-3 PUFA與n-6 PUFA比值(n-3/n-6)為0.71～1.21, 高于 FAO/WHO[19]推薦值(食物中n-3/n-6的比例至少在0.1～0.2), 而n-3/n-6值越高, 具有的營養(yǎng)價值就越高[20]。 本研究中還發(fā)現(xiàn), 配合飼料組蟹肌肉的n-3/n-6值(1.21±0.08)顯著高于粗飼料組和動物性餌料組(P<0.05), 相對具有更高的脂肪酸營養(yǎng)價值。

水產(chǎn)動物的營養(yǎng)成分主要受環(huán)境(溫度、鹽度、餌料的種類與密度等)和遺傳因素(基因結(jié)構(gòu)、發(fā)育階段等)等多方面的影響[21]。本試驗中，不同餌料投喂下，中華絨螯蟹各組織內(nèi)的脂肪酸含量相對穩(wěn)定，不同于銀鮭Oncorhynchuskisutch[22]和歐洲扇貝Pectenmaximus[23]等在相同養(yǎng)殖條件下，其體內(nèi)脂肪酸含量之間存在很大差異，作者認為是本試驗中采用的是同一家系的中華絨螯蟹，具有相同的遺傳品質(zhì)，因此，在相同的養(yǎng)殖環(huán)境下，中華絨螯蟹體內(nèi)的脂肪酸含量相對比較穩(wěn)定。

3.3 餌料種類對中華絨螯蟹打斗行為的影響

在不同餌料組間的打斗中，由于粗飼料發(fā)起攻擊次數(shù)顯著高于動物性餌料組和配合飼料組，因此，AB、AC組的總打斗次數(shù)和打斗時長高于BC組，從一般營養(yǎng)成分來看，主要是由于配合飼料和動物性餌料中含有較多的蛋白質(zhì)和脂肪，這些營養(yǎng)成分需要一定的時長消化和吸收，因此，減少了中華絨螯蟹的活動。同時獲得食物和能量等資源也是打斗發(fā)生的原因之一，而配合飼料和動物性餌料較高的營養(yǎng)成分可以滿足中華絨螯蟹對于食物的需求，這可能是其打斗行為減弱的原因之一。

魏鴻擎等[24]和 Kravitz[25]關(guān)于神經(jīng)生物學(xué)的研究認為, 5-羥色胺(5-HT)是水生生物重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì), 與爭斗性行為密切相關(guān)。5-HT廣泛地分布在甲殼動物中樞和外周神經(jīng)組織, 作為神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)或激素物質(zhì)調(diào)控許多重要的生理功能[26]。研究表明，適當(dāng)提高5-HT含量能夠降低中華絨螯蟹互殘的殘肢率，從而提高成活率[27]，對鋸緣青蟹打斗行為起到抑制作用[28]。而n-3 PUFAs含量與中樞5-HT濃度變化有一定的關(guān)聯(lián)度[29]。Kodas等[30]對小鼠的研究中證實，餌料中缺乏n-3 PUFAs能夠降低其神經(jīng)系統(tǒng)的5-TH濃度。關(guān)于n-3 PUFAs如何影響5-HT的功能，Hibbeln等[31]認為，n-3 PUFAs缺乏可能通過新陳代謝和分解代謝的調(diào)低而降低 5-HT功能。本試驗顯示，粗飼料投喂組中華絨螯蟹肌肉、肝胰腺和性腺中n-3 PUFAs含量均為最低，結(jié)合不同餌料組間打斗次數(shù)、打斗時長及爭斗發(fā)起方發(fā)起攻擊次數(shù)，認為可能是因為n-3 PUFAs的缺乏導(dǎo)致粗飼料組的中華絨螯蟹相對更具有攻擊性。

劉超等[10]研究了小鼠腦內(nèi)EPA和DHA對攻擊行為的影響，發(fā)現(xiàn)通過食物降低小鼠體內(nèi)的EPA和DHA含量，可顯著增加小鼠的攻擊行為。在不同餌料組間打斗中，粗飼料組表現(xiàn)出更具有攻擊性，比較3組餌料的脂肪酸組成，粗飼料中的EPA和DHA含量低于動物性餌料和配合飼料組(表2)，同時用其投喂下的中華絨螯蟹體內(nèi)EPA和DHA含量也低于動物性餌料和配合飼料組(表4)，認為這可能是導(dǎo)致其攻擊性增強的主要原因。這為實際養(yǎng)殖過程中采取在餌料中添加一定量的高度不飽和脂肪酸策略提供了參考。

4 結(jié)論

不同餌料投喂下，投喂配合飼料組性腺中的PUFA含量要高于粗飼料組和動物性餌料組，對性腺的發(fā)育具有促進作用，進而可提高中華絨螯蟹的繁殖能力。配合飼料投喂下的n-3/n-6值顯著高于粗飼料和動物性餌料,相對具有更高的脂肪酸營養(yǎng)價值。粗飼料投喂下，中華絨螯蟹體內(nèi)的n-3PUFA含量較低，但與動物性餌料和配合飼料組相比，其更具有攻擊性。因此，在實際的養(yǎng)殖過程中，建議投喂配合飼料和動物性餌料來提高中華絨螯蟹的營養(yǎng)品質(zhì)，同時又能減少其因為打斗造成的機械損傷，從而提高中華絨螯蟹的成活率和能量轉(zhuǎn)化效率。