劉 琴，王玲萍，陸仁偉，陸茜瑩，許 中

(1.蘇州市相城區(qū)漕湖人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 蘇州 215144；2.蘇州市立醫(yī)院東區(qū)檢驗科，江蘇 蘇州 215001）

維生素D（Vitamin D, VD）是一種脂溶性固醇類物質(zhì)，是人體必需維生素，主要以麥角鈣化醇（維生素D2）和膽鈣化醇（維生素D3）兩種無活性形式存在，人體不能自身合成，需通過紫外線照射皮膚合成或者直接從植物中攝取[1]。VD的主要生理作用是維持機體鈣磷代謝，進而保證骨骼健康，VD缺乏或不足可導致佝僂病、軟骨病等骨骼系統(tǒng)疾病，還與自身免疫性疾病、心血管疾病、抑郁癥、糖尿病等疾病關(guān)系密切[2-6]，因此，VD缺乏已經(jīng)成為一個全球公共衛(wèi)生問題，VD檢測也日益成為臨床檢驗關(guān)注焦點。VD在體內(nèi)經(jīng)25羥化酶催化合成25-羥維生素D[25(OH)D]，再經(jīng)25(OH)D-1α羥化酶催化成1,25(OH)2D，后者是VD發(fā)揮其生理作用的主要活性物質(zhì)，但是其含量極少，半衰期短，且受血鈣、磷和甲狀旁腺激素（PTH）水平的影響[7]，而25(OH)D是VD的主要儲存形式，能充分反映體內(nèi)VD總量和轉(zhuǎn)化能力。因此，血清總25-羥維生素D被認為是評估體內(nèi)VD狀態(tài)的最為有效的指標。

本研究旨在通過對蘇州博源醫(yī)療科技有限公司（以下簡稱“蘇州博源”）生產(chǎn)的總25-羥維生素D檢測試劑盒（膠乳增強免疫比濁法）進行方法學性能評估，并通過與羅氏診斷（上海）產(chǎn)品有限公司（以下簡稱“羅氏診斷”）代理的進口產(chǎn)品25-羥維生素D檢測試劑盒（電化學發(fā)光法）進行方法學比對，評價兩者之間的一致性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

1.1.1 試劑性能驗證樣品：(1)正確度評估試驗樣品：選擇低、中、高值血清樣品，每個樣品分別加入一定體積的25-羥維生素D3標準溶液（北京中科），制成待回收分析樣品。(2)精密度評價試驗樣品：低值和高值血清樣品。(3)線性評估試驗樣品：選擇低值和高值兩個濃度的血清樣品，按比例配制成不同梯度的線性評估樣品。(4)靈敏度評估實驗樣品：純水和低濃度血清樣品。以上血清樣品均來自2019年5月—10月蘇州市立醫(yī)院東區(qū)檢驗科血清樣本，樣品收集后在我－20 ℃下凍存。

1.1.2 方法學比對驗證樣品：選取蘇州市立醫(yī)院東區(qū)2019年5月—10月無溶血、脂血、黃疸新鮮血清樣品110 例，樣品收集后在－20 ℃下凍存。

1.2 主要儀器與試劑 7600全自動分析儀（日本日立公司）?？?5-羥維生素D試劑及其配套校準品和質(zhì)控品分別來自蘇州博源和羅氏診斷公司，批號分別為191213和191210，前者為試驗試劑，后者為參比試劑。按照制造商提供的說明書設(shè)置相應參數(shù)，并按照標準化操作程序完成校準和質(zhì)控。

1.3 方法

1.3.1 正確度：選擇3個不同濃度水平的血清樣品，分別在血清樣品（濃度C0，體積V0＝0.9 mL）中加入一定量的標準溶液（濃度Cs＝150 ng/mL，體積V＝0.1 mL），配制成待測回收樣品（濃度C）。每個樣品重復測定3 次，計算每個樣品的回收率（R），計算公式：R（%）＝[C×(V＋V0)－C0×V0]/(Cs×V)×100%[8]。

1.3.2 精密度：參考CLSI EP15-A文件方案[9]，選取低值和高值兩個濃度的血清樣品連續(xù)進行5 d的測定，每日一個批次，每個樣品重復測定4 次。

1.3.3 線性范圍：參考CLSI EP6-A文件方案[10]，將低水平混合血清（ L：8 ng/mL）和高水平混合血清（ H：152 ng/mL）按照比例L、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、H進行稀釋，配制成6個梯度的混合血清。各濃度梯度混合血清測定2 次，以預期濃度為X軸，實測濃度為Y軸繪制散點圖，計算回歸方程和R2，通過EP軟件進行統(tǒng)計分析。預期濃度計算公式：X＝(CL×VL＋CH×VH)/(VL＋VH)。其中：CL：低水平混合血清樣品的濃度，VL：低水平混合血清樣品的體積，CH：高水平混合血清樣品的濃度，VH：高水平混合血清樣品的體積。

1.3.4 分析靈敏度：參考CLSI EP17-A方案[11]，在同一批內(nèi)連續(xù)測定空白樣品純水和低濃度樣品各20 次，記錄測定結(jié)果。計算空白檢測限（limit of blank, LOB）和分析靈敏度（limit of detection,LOD）?？瞻讟悠返臏y定值以不超過3個大于廠商聲明的LOB（1.2 ng/mL）認為結(jié)果可接受；低濃度樣品測定結(jié)果中以不超過5%（1個）小于廠商聲明的LOD（2.9 ng/mL）認為分析靈敏度符合要求。

1.3.5 臨床樣品比對：選取本院2019年5月—10月無溶血、脂血、黃疸的新鮮血清樣品110 例，分別用蘇州博源和羅氏診斷的25-羥維生素D試劑進行檢測，比對試驗統(tǒng)計根據(jù)MedCalc軟件中方法比對和評估進行。

1.4 統(tǒng)計學分析 所用統(tǒng)計量及統(tǒng)計圖表均由MedCalc分析軟件計算繪制。

2 結(jié)果

2.1 正確度 低、中、高濃度血清樣品的回收率分別為106.2%、102.3%、99.8%，在生產(chǎn)廠商聲明的范圍內(nèi)，結(jié)果見表1。

表1 正確度評估試驗結(jié)果

2.2 精密度 低值血清樣品的批內(nèi)精密度為2.87%，小于廠商聲明的1/4TEa（6.25%），總精密度為3.60%，小于廠商聲明的1/3TEa（8.33%）；高值血清樣品的批內(nèi)精密度為1.42%，小于廠商聲明的1/4TEa（6.25%），總精密度為2.09%，小于廠商聲明的1/3TEa（8.33%）。

2.3 線性范圍 該試劑在8.0～152.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝－2.5853＋1.0410X，R2＝0.996。散點圖見圖1。

圖1 線性范圍散點圖

2.4 分析靈敏度 測定結(jié)果中符合條件的空白樣品的測定值個數(shù)為20個，所有低濃度樣品測定結(jié)果均大于廠商聲明的LOD，因此該試劑的分析靈敏度符合要求。

2.5 臨床樣品比對 Deming回歸圖見圖2，回歸方程的截距（intercept）和斜率（slope）分別為－2.59（95%CI：－3.81～－1.37）和1.04（95%CI：0.98～1.11），r為0.951，線性相關(guān)性良好。以蘇州博源和羅氏診斷測定結(jié)果的均值為X軸，比值為Y軸繪制Bland-Altman圖（見圖3），結(jié)果顯示，95%一致性界限為（0.43,1.33），有95.5%（105/110）的點落在一致性界限范圍內(nèi)，可見兩種檢測方法的檢測結(jié)果一致性良好。

圖2 Deming回歸圖

圖3 Bland-Altman圖

3 討論

本文參照CLSI文件對蘇州博源的總25-羥維生素D試劑正確度、精密度、線性范圍、分析靈敏度等重要指標進行了評價。結(jié)果顯示，采用回收實驗驗證試劑正確度符合廠商聲明的可接受范圍，低、中、高濃度血清樣品的回收率分別為106.2%、102.3%、99.8%；低值、高值血清樣品的批內(nèi)精密度和總精密度分別為2.87%、1.42%和3.60%、2.09%，小于廠商聲明的1/4TEa（6.25%）和1/3TEa（8.33%）；線性范圍為8.0～152.0 ng/mL，符合廠商聲明的范圍；分析靈敏度符合廠商聲明的值（2.9 ng/mL）；參考區(qū)間驗證符合廠商聲明的參考區(qū)間（＞30 ng/mL）。與同類產(chǎn)品羅氏診斷進行了方法學比對，結(jié)果一致性良好。試劑符合實驗室質(zhì)量要求，適用于實驗室常規(guī)檢測的開展。

目前，25-羥維生素D的檢測方法有放射免疫法、酶免疫法、化學發(fā)光法、高效液相色譜法、膠乳增強免疫比濁法等[12-13]。免疫分析法原理是基于抗原抗體的結(jié)合，適用于全自動分析儀，操作簡單，分析速度快，可實現(xiàn)高通量檢測，只是不能區(qū)分維生素D2和D3，臨床上一般用于檢測總25-羥維生素D。LC-MS/MS被認為是公認的測定25-羥維生素D的金標準，敏感性高、特異性強。但是，目前市面上25-羥維生素D測定結(jié)果之間可比性較差，檢測方法的一致性有待提高[1]。對于免疫法來說，不同廠家的試劑抗體交叉反應差異顯著；LC-MS/MS方法則會受到3-表-25-羥維生素D的干擾，而且檢測方法大多由實驗室自主研發(fā)和驗證，各儀器廠家方法間結(jié)果可比性差，方法的標準化也亟待解決，而且儀器價格偏高，對實驗室條件及操作人員技術(shù)要求嚴格，所以不能廣泛應用于大多數(shù)實驗室。

隨著社會經(jīng)濟發(fā)展和生活方式的改變，VD不足或缺乏的情況日漸普遍，而VD有著非常重要的生理作用，不僅在鈣磷代謝和骨骼發(fā)育中至關(guān)重要，還與心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病、肥胖等疾病相關(guān)，因此，VD的檢測值在各個實驗室廣泛推廣和使用。25-羥維生素D作為VD在體內(nèi)的主要儲存物質(zhì)可作為檢測的最佳指標，但是，臨床的應用需要解決很多問題，還有許多工作需要進一步完善，本研究也是筆者一直在不斷深入探索的一部分，希望能為檢驗領(lǐng)域解決更多亟待解決的問題。