竺鑫晨，劉 俊，嚴(yán) 佳，胡 克，陳 剛，劉 梅，章非敏

骨缺損是臨床常見的疾病，目前治療的臨床標(biāo)準(zhǔn)仍是自體骨移植、異體骨移植[1]，但這些方法存在來源受限、誘導(dǎo)繼發(fā)創(chuàng)傷、免疫排斥等缺點(diǎn)。組織工程將材料、生物及機(jī)械工程的原理與技術(shù)相結(jié)合，制造各種各樣的骨替代材料[2]，被認(rèn)為是最有前景的骨缺損治療方法。有機(jī)高分子合成材料聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone，PCL)是一種半結(jié)晶的可吸收脂肪族聚酯，其降解產(chǎn)物可以通過三羧酸循環(huán)或腎臟分泌物完全排出，對(duì)人體無(wú)毒副作用[3]，具有良好的機(jī)械靈活性、生物相容性、降解性，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)可用于臨床[4]。但由于PCL的疏水性、缺乏細(xì)胞可識(shí)別的生物活性位點(diǎn)，使材料表面的初始細(xì)胞附著率和增殖率較低[5]。因此，近年來學(xué)者們探索了使用不同方法改變PCL支架表面特性來克服這些限制，如與膠原蛋白、生物陶瓷及化學(xué)試劑混合[6-8]。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，存在于軟骨、骨、椎間盤、血管、肌腱、韌帶、皮膚和角膜中，其中Ⅰ型膠原是28種已知膠原中含量最豐富的一種，也是骨中含量最豐富的一種，構(gòu)成了骨有機(jī)質(zhì)量的90%，有親水性好、抗原性低、加工方便等優(yōu)點(diǎn)[9]，但力學(xué)性能較差、易膨脹、在體內(nèi)代謝率過高等缺點(diǎn)限制了膠原支架在體內(nèi)外的應(yīng)用[10]，因此常與其他材料混合使用[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)通過在PCL微球表面修飾0.1%、0.5%、2.0%的Ⅰ型牛腱膠原，模擬天然骨組織微環(huán)境，研究其對(duì)微球上BMSCs細(xì)胞附著、增殖及成骨能力的影響，以指導(dǎo)制備出利于骨組織再生的支架。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

PCL(濟(jì)南岱罡生物工程有限公司，中國(guó)山東)，二氯甲烷(國(guó)藥，中國(guó)北京)，BMSCs(P2，cyagen,中國(guó)上海)，Oricell SD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、Oricell SD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(cyagen，中國(guó)上海)，0.25%胰酶/EDTA(Gibco，美國(guó))，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS，Hyclone，美國(guó))，Triton X-100(solarbio，中國(guó)北京)，CCK-8(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)上海)，鬼筆環(huán)肽(Cytoskeleton，美國(guó))，DAPI(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)上海)，堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒(建成生物工程研究所，中國(guó)南京)，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(雷根生物技術(shù)有限公司，中國(guó)北京)，LGJ-10冷凍干燥機(jī)(松源華興科技發(fā)展有限公司，中國(guó)北京)，激光共聚焦顯微鏡(Jena，德國(guó))，Spectra Max 190酶標(biāo)儀(Molecular device，美國(guó))，Ⅰ型膠原由江南大學(xué)藥學(xué)院陳敬華教授課題組提供。

1.2 PCL微球制備及表面修飾

微球的制備：取5 mL明膠溶液，將其倒入10 mL PCL二氯甲烷溶液中，勻漿后倒入50 mL的1% PVA水溶液中，500 r/min攪拌1 min，將混合液體倒入400 mL 0.1% PVA水溶液，300 r/min攪拌4～6 h。50 ℃雙蒸水沖洗，過濾，得PCL微球，密封保存。

表面修飾：將冷凍干燥后的微球分別浸泡在0.1%、0.5%、2.0%的Ⅰ型膠原+0.05 mol/L乙酸溶液(已用氫氧化鈉將pH調(diào)至7)中24 h，吸棄溶液，室溫蒸發(fā)4 h，冷凍干燥。

因此一共4組：未修飾，0.1%、0.5%、2.0%的Ⅰ型膠原修飾，用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 表面形貌觀察

PCL微球經(jīng)過冷凍干燥24 h后，噴金3 min，置于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察其表面形貌。

1.4 微球吸水率

用比重法測(cè)量四組微球的吸水率。每組樣品制作3個(gè)平行樣，室溫下，將干重為W0的材料在雙蒸水中浸泡24 h后拿出，吸干材料表面水分并稱重為W1。按照公式吸水率=(W1-W0)/W0×100%計(jì)算吸水率。

1.5 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2、100%濕度，培養(yǎng)液每?jī)商鞊Q1次。接種細(xì)胞前，微球于75%乙醇溶液浸泡1 h，無(wú)菌PBS漂洗3次，完全培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)過夜，備用。

1.5.1 細(xì)胞增殖情況檢測(cè) 將四種微球鋪滿96孔板底部，每孔接種5×103個(gè)BMSCs，按前述條件培養(yǎng)細(xì)胞。在細(xì)胞接種后第1、3、5、7天棄原培養(yǎng)液，加入工作液100 μL(CCK-8與完全培養(yǎng)液以1∶10混合)，37 ℃孵育2 h，每孔吸取80 μL液體至96孔板，于酶標(biāo)儀上測(cè)試在450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值。

1.5.2 細(xì)胞粘附能力檢測(cè) 用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在微球上的鋪展形態(tài)。細(xì)胞接種于24孔板中，1×104個(gè)/孔。于6、12、24 h后以4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.5% Triton X-100打孔3 min，鬼筆環(huán)肽37 ℃避光孵育30 min，PBS沖洗3次，DAPI避光染色30 s，PBS沖洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5.3 ALP活性檢測(cè) 將微球鋪滿6孔板底部，每孔接種細(xì)胞2.5×105個(gè)，BMSCs專用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基下培養(yǎng)3、7 d后，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，每孔加300 μL 0.5% Triton X-100裂解30 min，離心收集上清液進(jìn)行分析。ALP活性和總蛋白濃度分別按照ALP檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 四種微球表面形貌及微觀結(jié)構(gòu)

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下(圖1)觀察發(fā)現(xiàn)：PCL微球粒徑約為450～500 μm，呈疏松有孔狀。對(duì)照組PCL框架表面光滑，0.1% COLⅠ組、0.5% COLⅠ組可見蜘蛛網(wǎng)狀膠原覆蓋微球表面，膠原絲直徑約為150～200 nm；2.0% COLⅠ組可見膠原絲直徑較粗，約為600～800 nm，微球表面較多膜狀、顆粒狀膠原覆蓋，分布不規(guī)則。

A：對(duì)照組；B：0.1% COLⅠ組；C：0.5% COLⅠ組；D：2.0% COLⅠ組

圖1 四組微球的表面電鏡圖

Fig.1Field emission scanning electron microscopyimages of microspheres of four groups

2.2 吸水率

吸水率如圖2顯示，三組膠原修飾后的PCL微球與對(duì)照組相比吸水率均有顯著增長(zhǎng)(0.1% COLⅠ組P=0.027，0.5% COLⅠ組P=0.021，2.0% COLⅠ組P=0.018)，2.0% COLⅠ組高于0.1% COLⅠ組(P=0.011)，但與0.5% COLⅠ組無(wú)明顯差異(P=0.617)。

2.3 細(xì)胞增殖

CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞在四種微球支架上的增殖情況(圖3)，各組支架上的細(xì)胞均從第1天到第7天不斷增殖。第1天各組間無(wú)明顯差異，第3天0.1% COLⅠ組和0.5% COLⅠ組的細(xì)胞數(shù)量明顯高于其他兩組(P<0.001)； 第5天膠原修飾的各組均高于對(duì)照組，且膠原濃度越低細(xì)胞數(shù)量越高(0.1% COLⅠ組P<0.001，0.5% COLⅠ組P<0.001，2.0% COLⅠ組P=0.039)；2.0% COLⅠ組細(xì)胞在第7天增長(zhǎng)緩慢，與第5天相比細(xì)胞無(wú)明顯增殖(P=0.667)，且細(xì)胞數(shù)量低于對(duì)照組(P<0.001)，0.5% COLⅠ組與對(duì)照組無(wú)差異(P=0.998)。

1：0.1% COLⅠ組；2：0.5% COLⅠ組；3：2.0% COLⅠ組；4:對(duì)照組；*：與0.1% COLⅠ組相比，P<0.05；#：與0.5% COLⅠ組相比，P<0.05；&：與2.0% COLⅠ組相比，P<0.05

圖2四組微球吸水率

Fig.2Water absorption rate of microspheres of four groups

*：與0.1% COLⅠ組相比，P<0.05；#：與0.5% COLⅠ組相比，P<0.05；&：與2.0% COLⅠ組相比，P<0.05

圖3CCK-8法檢測(cè)BMSCs細(xì)胞在四組微球上第1、3、5、7天的增殖活性

Fig.3Proliferation of BMSCs onmicrospheres of fourgroups measured by CCK-8assays after1,3,5and7days

2.4 細(xì)胞初期粘附

細(xì)胞粘附結(jié)果如圖4所示，紅色為鬼筆環(huán)肽(顯示細(xì)胞骨架)，藍(lán)色為DAPI(顯示細(xì)胞核)。在接種6 h后0.1% COLⅠ組和0.5% COLⅠ組可見較多細(xì)胞附著，細(xì)胞呈圓形，無(wú)明顯偽足，2.0% COLⅠ組和對(duì)照組細(xì)胞附著較少；在12 h和24 h后可見各組細(xì)胞呈多邊形，偽足伸展，互相連接，各組差異不明顯。

2.5 ALP活性檢測(cè)

BMSCs細(xì)胞在四組材料上培養(yǎng)3、7 d的ALP活性結(jié)果(ALP單位以U/g蛋白表示)如圖5所示。

紅色為鬼筆環(huán)肽(顯示細(xì)胞骨架)，藍(lán)色為DAPI(顯示細(xì)胞核)

圖4BMSCs細(xì)胞接種于四組微球后6、12、24h激光共聚焦圖(×100)

Fig.4CLSM images of BMSCs onmicrospheres of four groups after6,12and24hours (×100)

第7天所有組內(nèi)ALP活性比第3天升高，0.1% COLⅠ組間P=0.026，0.5% COLⅠ組間P=0.015，2.0% COLⅠ組間P=0.009，對(duì)照組間P=0.044，0.1% COLⅠ組ALP活性均高于其他三組，0.1% COLⅠ組與0.5% COLⅠ組相比P=0.045，與2.0% COLⅠ組相比P=0.046，與對(duì)照組相比P=0.027，第3天其他三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，0.5% COLⅠ組與2.0% COLⅠ組相比P=0.109，0.5% COLⅠ組與對(duì)照組相比P=0.246，2.0% COLⅠ組與對(duì)照組相比P=0.999；第7天，0.5% COLⅠ組和2.0% COLⅠ組間無(wú)差異(P=0.999)但均高于對(duì)照組，0.5% COLⅠ組與對(duì)照組相比P=0.014，2.0% COLⅠ組與對(duì)照組相比P=0.057。

3 討 論

組織工程的目的是開發(fā)合適的支架，模擬天然骨組織微環(huán)境，易于被再生功能良好的自體細(xì)胞定植從而修復(fù)骨缺損。支架必須具備的要求：形狀與缺損部位相匹配；生物相容性好無(wú)炎癥或免疫反應(yīng)；生物可降解，便于新形成的組織取代支架；有空間容納細(xì)胞遷移和養(yǎng)分交換及實(shí)現(xiàn)在宿主組織中血管增長(zhǎng)可能[13]。而本研究中掃描電鏡結(jié)果顯示PCL微球含有疏松的孔隙結(jié)構(gòu)(圖1)， 符合此要求。設(shè)計(jì)成這樣的結(jié)構(gòu)有很多優(yōu)點(diǎn)，比如： 擴(kuò)大了比表面積，與平面二維材料相比，材料上的細(xì)胞可利用更多的空間進(jìn)行擴(kuò)張，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖[14]；另外，支架材料的這樣的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)通過保存組織體積、提供機(jī)械性能和傳遞生物因子，在組織再生中提供了細(xì)胞通道來引導(dǎo)細(xì)胞遷移和組織生長(zhǎng)[15]；表面積大的支架材料可以促進(jìn)有效的蛋白質(zhì)吸附、細(xì)胞附著、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[16]。然而，這樣的有孔結(jié)構(gòu)增加了PCL的疏水性[17]且單純的PCL微球過于單一，無(wú)法滿足支架的多重要求，近年來復(fù)合支架的出現(xiàn)與研究越來越受學(xué)者的關(guān)注。

*與0.1% COLⅠ組相比，P<0.05；#與0.5% COLⅠ組相比，P<0.05；&與2.0% COLⅠ組相比，P<0.05

圖5四組微球上BMSCs細(xì)胞成骨誘導(dǎo)3、7d的ALP活性檢測(cè)結(jié)果

Fig.5ALP activity of BMSCs onmicrospheres of fourgroups after osteogenic induction of3and7days

因此我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其以不同濃度的膠原修飾，得到了具有不同結(jié)構(gòu)和細(xì)胞學(xué)特性的微球。在膠原修飾后，掃描電鏡結(jié)果顯示膠原修飾組微球表面及孔隙中均有網(wǎng)狀膠原纖維覆蓋貫穿。吸水率實(shí)驗(yàn)顯示隨著膠原濃度的增高，吸水率也在升高。

而細(xì)胞增殖結(jié)果卻沒有隨著膠原濃度的增加而增加，其中0.1% COLⅠ組效果最好，而高濃度效果卻明顯降低?？赡茉蛉缦拢河捎谀z原的吸水膨脹性，高濃度膠原修飾過的支架孔隙率下降，比表面積降低，物質(zhì)流通減少，過小的孔隙使細(xì)胞無(wú)法伸入生長(zhǎng)[18-19]。因此，這也就可能導(dǎo)致了2.0% COLⅠ組中細(xì)胞增殖速率低于0.1% COLⅠ組。激光共聚焦結(jié)果也顯示低濃度的膠原修飾后的微球有著良好的早期細(xì)胞粘附鋪展特性。在接種后6 h，低濃度膠原修飾組就有較多的細(xì)胞粘附，可能也是此原因?qū)е隆?/p>

ALP結(jié)果進(jìn)一步顯示了低濃度膠原修飾的作用，ALP是早期成骨細(xì)胞分化標(biāo)志，由細(xì)胞外基質(zhì)礦化的細(xì)胞產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)ALP活性定量結(jié)果顯示0.1% COLⅠ組在第3、7天均高于其他組別。膠原是可以啟動(dòng)和促使礦化過程的[10]。根據(jù)Sisson等[20]的研究，成骨細(xì)胞的分化作用在小直徑纖維支架(110 nm)上較在大直徑纖維支架(600 nm)上更為明顯。而本研究中掃描電鏡結(jié)果顯示低濃度膠原組具有較細(xì)的膠原纖維，這可能便是該組細(xì)胞有著較為活躍的成骨活性的原因。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)0.1% COLⅠ表面修飾提高了細(xì)胞的粘附增殖及成骨分化能力，但其在體內(nèi)成骨作用的影響還有待進(jìn)一步研究。