上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院牙周病科，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011

牙周炎是一種微生物相關(guān)的、宿主介導(dǎo)的、多因素參與并導(dǎo)致牙周附著喪失的炎癥性疾病[1-2]。牙周炎通過齦下菌斑中的微生物及其產(chǎn)物引起全身免疫炎癥反應(yīng)，從而成為系統(tǒng)性疾病的危險(xiǎn)因素。牙周炎與糖尿病、心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等全身疾病有關(guān)，近年研究[3]發(fā)現(xiàn)牙周炎與慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）也有密切聯(lián)系。

CKD在人群中的患病率為10%～12%，已成為主要的公共健康問題之一，超過50%的老年人有腎功能障礙[4]。橫斷面調(diào)查[5-7]顯示，與普通人群相比，CKD患者[包括CKDⅡ～Ⅴ期患者、正在接受腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）和血液透析（hemodialysis，HD）患者]的牙周炎患病率明顯增加，探診深度、探診出血量、附著喪失程度、牙槽骨吸收程度等均高于年齡與之匹配的無系統(tǒng)性疾病健康個(gè)體，并且牙周炎患病率與CKD進(jìn)展程度密切相關(guān)。目前關(guān)于牙周炎與CKD的相關(guān)性，大多來自流行病學(xué)調(diào)查，二者相關(guān)性機(jī)制尚不明確。

CKD患者體內(nèi)存在一類能與蛋白質(zhì)相結(jié)合且不能通過透析清除的毒素，其中最具代表性的為硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）。CKD患者隨著腎功能的惡化，血清IS濃度持續(xù)升高，可達(dá)正常人群的30倍以上。IS與CKD的進(jìn)展以及CKD患者心血管疾病的不良結(jié)局密切相關(guān)[8]，具有加劇纖維化、促進(jìn)炎癥基因表達(dá)、增加細(xì)胞內(nèi)氧化損傷、誘導(dǎo)免疫紊亂及抑制細(xì)胞增殖等作用[9-11]。而氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是牙周炎與全身疾病聯(lián)系的重要橋梁，但目前尚未有IS對(duì)人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）生物學(xué)作用的報(bào)道。

因此，本研究試圖通過觀察IS對(duì)hPDLCs的增殖活性、炎癥因子表達(dá)和活性氧（reactive oxygen species，ROS）表達(dá)的影響，為CKD與牙周炎的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為伴CKD牙周炎患者的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸吲哚酚鉀鹽、2′, 7′-二氯熒光素二乙酸鹽（2′,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFDA）（Sigma，美 國(guó)），DMEM培養(yǎng)基 （Hyclone，美國(guó)），胎牛血清（Gibco，美國(guó)），四甲基偶氮唑鹽比色（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（碧云天，中國(guó)），總RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（寶生物，中國(guó)），ELISA試劑盒（UBI，美國(guó)）。

1.2 hPDLCs的培養(yǎng)

采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行hPDLCs的培養(yǎng)。收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院18～25歲患者臨床因正畸需要拔除的、牙周健康的、無齲的前磨牙和第三磨牙，所有牙齒收集之前患者均知情同意。在超凈臺(tái)內(nèi)用無菌PBS反復(fù)沖洗，刮取牙根中部1/3的牙周膜組織置于6 cm培養(yǎng)皿中，加入1 mL培養(yǎng)液使其在皿底鋪平，吸棄多余培養(yǎng)液，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后加入4 mL培養(yǎng)基。待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%后常規(guī)傳代，選取第3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組：含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)組：在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入IS，使其終濃度分別為62.5、125、250、500、1 000 μmol/L。

1.4 IS對(duì)hPDLCs細(xì)胞活性的影響

取第3～5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hPDLCs，以1.6×104/mL密度接種于96孔板。于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按上述實(shí)驗(yàn)分組加入不同干預(yù)，再次培養(yǎng)24、48、72 h。加入配置好的0.5 mg/mL MTT溶液，避光孵育4 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD （490 nm）。以未加細(xì)胞的培養(yǎng)基孔為基準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)零。

1.5 IS對(duì)hPDLCs炎癥因子基因和蛋白表達(dá)水平的影響

1.5.1 基因檢測(cè) 將細(xì)胞以2×105/mL密度接種于6孔板，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同干預(yù)，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用RNAiso Plus裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，加入引物以及SYBR，在實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行基因擴(kuò)增。采用相對(duì)定量2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 基因引物序列Tab 1 Primer sequences for target genes

1.5.2 蛋白檢測(cè) 將hPDLCs以2×105/mL密度接種于6孔板，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同干預(yù)，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后收集上清。取上述不同濃度IS處理4 h后的細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說明書要求檢測(cè)IL-1β、IL-8、IL-6的濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 IS對(duì)hPDLCs ROS表達(dá)的影響

hPDLCs以2×105/mL密度接種于24孔板，于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同干預(yù)，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，吸棄上清。用無血清培養(yǎng)液稀釋熒光探針DCFDA，使其終濃度為10 μmol/L，每孔加入500 μL。置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min后用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度（激發(fā)光495 nm，發(fā)射光525 nm），使用熒光顯微鏡觀察、拍攝各組細(xì)胞的熒光圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用Graphad Prism 6.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料采用±s表示。采用單因素方差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IS對(duì)hPDLCs增殖活性的影響

如圖1所示：24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，62.5 μmol/L IS濃度組細(xì)胞增殖活性無明顯變化（P＞0.05）；125、250、500、1 000 μmol/L IS濃度組細(xì)胞增殖活性顯著下降（P＜0.05），且細(xì)胞活性與IS濃度呈負(fù)相關(guān)。48 h時(shí)，125、250、500、1 000 μmol/L IS濃度組可觀察到細(xì)胞增殖活性受到抑制（P＜0.05），且抑制作用與IS濃度呈正相 關(guān)。72 h時(shí)，125、250、500、1 000 μmol/L IS濃度組細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組相比均受到抑制（P＜0.05），且抑制作用與IS濃度呈正相關(guān)。125 μmol/L的IS作用于hPDLCs 72 h時(shí)的細(xì)胞相對(duì)生存率（0.706±0.039）較48 h時(shí)（0.849±0.038）顯著下降（P＜0.05）。500 μmol/L的IS作用于hPDLCs 72 h時(shí)的細(xì)胞相對(duì)生存率（0.417±0.097）也較48 h時(shí)（0.662±0.119）明顯下降（P＜0.05）。500、1 000 μmol/L IS濃度組的細(xì)胞增殖活性隨著IS作用時(shí)間延長(zhǎng)而下降。

結(jié)果表明，125 μmol/L的IS即可對(duì)hPDLCs的增殖活性產(chǎn)生抑制作用，IS對(duì)hPDLCs的抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。

圖1 IS對(duì)hPDLCs的增殖活性影響Fig 1 Effect of indoxyl sulfate on the cell viability of hPDLCs

2.2 IS對(duì)hPDLCs炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響

如圖2所示：IS刺激hPDLCs 4 h時(shí)，與對(duì)照組相比，62.5 μmol/L IS濃度組的IL-1βmRNA表達(dá)量增加，而IL-6、IL-8mRNA的表達(dá)無明顯變化；125 μmol/L IS濃度組的IL-1β、IL-6和IL-8mRNA表達(dá)量均增加（P＜0.05）；IL-1β、IL-6和IL-8mRNA表達(dá)量與IS濃度呈正相關(guān)。結(jié)果顯示hPDLCs炎癥因子表達(dá)對(duì)IS呈濃度依賴性。

圖2 IS對(duì)hPDLCs炎癥因子mRNA表達(dá)的影響Fig 2 Effect of indoxyl sulfate on cytokines mRNA expression of hPDLCs

2.3 IS對(duì)hPDLCs炎癥因子蛋白表達(dá)水平的影響

如圖3所示：4 h時(shí)，與對(duì)照組相比，62.5 μmol/L IS濃度可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-8蛋白的表達(dá)（P＜0.05）；125 μmol/L IS濃度可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)IL-6蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)果表明，IS可促進(jìn)hPDLCs細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-8和IL-6蛋白的分泌，蛋白表達(dá)量與IS濃度呈正相關(guān)，且具有濃度依賴性。

圖3 IS對(duì)hPDLCs炎癥因子蛋白表達(dá)的影響Fig 3 Effect of indoxyl sulfate on cytokines protein expressions of hPDLCs

2.4 IS對(duì)hPDLCs胞內(nèi)ROS表達(dá)的影響

如圖4所示：與對(duì)照組相比，125 μmol/L IS作用于hPDLCs 4 h時(shí)即可見細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且隨著IS濃度的增加hPDLCs胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)。

圖4 IS對(duì)hPDLCs ROS表達(dá)的影響Fig 4 Effect of indoxyl sulfate on ROS production in hPDLCs

3 討論

牙周炎是一種由病原微生物感染所致的宿主炎性破壞性疾病。宿主免疫應(yīng)答在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂會(huì)導(dǎo)致牙周感染概率或程度的增加[12]。近年來，氧化應(yīng)激在牙周炎發(fā)展中的作用逐漸受到重視，許多研究認(rèn)為氧化應(yīng)激的直接和間接參與是導(dǎo)致牙周組織破壞的關(guān)鍵因素。牙周炎可以是氧化應(yīng)激相關(guān)的全身疾病的局部表現(xiàn)，也可以通過氧化應(yīng)激來加速全身疾病的進(jìn)展[13]。IS是CKD患者腎功能衰退后在體內(nèi)大量蓄積的毒素[14]，尿毒癥患者的血清內(nèi)IS濃度較健康人群高43～88倍[15]。血液中IS的增加與腎小球硬化、腎纖維化和CKD的進(jìn)展以及心血管疾病的不良結(jié)局密切相關(guān)[16]。IS可促進(jìn)ROS表達(dá)增加，破壞體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡，造成內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等損傷。IS以多種途徑誘發(fā)炎癥免疫反應(yīng)：IS進(jìn)入T細(xì)胞可使其向Th17細(xì)胞分化，引起免疫功能紊亂；IS與蛋白結(jié)合可影響單核細(xì)胞的趨化功能從而刺激促炎因子的釋放，使機(jī)體處于炎癥狀態(tài)；IS可促進(jìn)脂肪細(xì)胞TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。而氧化損傷及免疫炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的過量炎癥介質(zhì)與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

已有研究[17-18]表明，IS可抑制巨噬細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及腎臟細(xì)胞的增殖及代謝，且呈時(shí)間及濃度依賴性。本研究參考尿毒癥患者體內(nèi)平均IS濃度以及最大濃度（尿毒癥患者體內(nèi)平均IS濃度為211 μmol/L，最大濃度為940 μmol/L）[19]設(shè)立濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)125 μmol/L的IS可對(duì)hPDLCs的增殖活性產(chǎn)生抑制作用，且IS對(duì)hPDLCs的抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。hPDLCs是一類具有多向分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞，若hPDLCs的生物學(xué)功能受到損害，將會(huì)導(dǎo)致牙周組織再生修復(fù)能力下降[20]。IS可通過增加腎小管上皮細(xì)胞中ROS的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡蛋白酶-3的表達(dá)，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡[21]。IS也可通過ROS的表達(dá)抑制腸黏膜上皮細(xì)胞增殖[22]。本研究中，經(jīng)IS處理的細(xì)胞胞內(nèi)ROS表達(dá)明顯上升，IS濃度為125 μmol/L的細(xì)胞胞內(nèi)ROS上升顯著，與細(xì)胞增殖受抑制IS濃度一致。由此表明，ROS可能在IS抑制hPDLCs增殖中起作用。

菌斑微生物是牙周炎的始動(dòng)因子，但牙周炎所造成的病理破壞不僅與菌斑微生物相關(guān)，還與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的炎性因子密切相關(guān)。牙周炎患者的齦溝液及血清中常可檢測(cè)到多種炎癥因子水平增高，而炎癥過程中免疫細(xì)胞及牙周組織細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子又進(jìn)一步促進(jìn)牙周炎的發(fā)生發(fā)展[20]。體外實(shí)驗(yàn)研究[23-24]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腹腔注射IS的小鼠腎臟組織中炎癥因子IL-1β、IL-6水平明顯上升，且與腎臟纖維化密切相關(guān)；IS還可激活單核巨噬細(xì)胞IL-1β的表達(dá)。IL-1β是牙周炎發(fā)展過程中重要的炎癥因子，可激活淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞，其水平與牙周炎的一系列病理變化有關(guān)，包括上調(diào)炎癥性細(xì)胞因子、趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、黏附分子等；IL-1β還可抑制堿性磷酸酶表達(dá)，抑制組織形成，激活破骨細(xì)胞，刺激破骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2并導(dǎo)致牙槽骨喪失[25]。IL-8是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的促炎趨化因子，可激活體內(nèi)中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使其釋放溶菌酶，并增強(qiáng)溶菌酶的活性及吞噬效應(yīng)，導(dǎo)致相應(yīng)組織器官的病理損傷。Gamonal等[26]發(fā)現(xiàn)牙周炎患者齦溝液中的IL-8水平顯著高于正常對(duì)照者，提示IL-8可能是牙周炎的標(biāo)志性炎癥因子之一。IL-6是一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，是牙周炎與CKD共同的炎癥因子，在牙槽骨的破壞中充當(dāng)重要角色，其濃度與牙周炎的發(fā)生發(fā)展及其破壞程度密切相關(guān)。IL-6可通過增加急性期反應(yīng)蛋白的產(chǎn)生加重炎癥反應(yīng)，抑制hPDLCs生長(zhǎng)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化成熟，影響牙周組織健康[27]。Kobayash等[28]發(fā)現(xiàn)健康牙周組織中IL-6含量極少，在探診深度＞3 mm位點(diǎn)的牙周組織中分泌量增多，而在探診深度＞6 mm位點(diǎn)的牙周組織尤為明顯，牙周組織中IL-6含量與探診深度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，IS在濃度為125 μmol/L時(shí)可上調(diào)hPDLCs炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8mRNA和蛋白的表達(dá)水平，且促炎作用呈濃度依賴性，表明IS可誘導(dǎo)hPDLCs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。關(guān)于IS促進(jìn)炎癥因子釋放，有研究[15,29]表明其可以通過體內(nèi)ROS的產(chǎn)生以及激活核轉(zhuǎn)錄因子κB產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，從而導(dǎo)致腎臟受損。本研究中，125 μmol/L的IS可以上調(diào)hPDLCs炎癥因子、蛋白的表達(dá)，與ROS表達(dá)增加相符，與前述研究結(jié)果一致。

氧化損傷與牙周炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，牙周炎患者的唾液和血液中的ROS水平高于牙周健康人群[30]。高水平ROS是牙周炎患者探診深度、附著水平、牙齦指數(shù)的危險(xiǎn)因素[31]。在正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，ROS可維持在無害的極低水平。但當(dāng)機(jī)體代謝異常時(shí)，大量ROS自由基的產(chǎn)生或機(jī)體抗氧化物質(zhì)的不足可導(dǎo)致氧化與抗氧化失衡，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，并進(jìn)一步引發(fā)以細(xì)胞死亡和組織損傷為表現(xiàn)的一系列病理過程[32]。Lin等[33]發(fā)現(xiàn)濃度為10 μmol/L的IS可通過增加ROS水平導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。ROS可通過直接破壞牙周支持組織以及間接免疫損傷造成牙周炎的發(fā)生發(fā)展[34-36]。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)IS濃度為125 μmol/L時(shí)可增加hPDLCs中ROS的表達(dá)，且ROS表達(dá)量與IS濃度呈正相關(guān)。氧化應(yīng)激的產(chǎn)生是IS導(dǎo)致腎臟、血管平滑肌細(xì)胞損傷的最主要因素，其核心為IS導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)炎性小體激活，使得炎癥因子增加[37]。本研究與上述研究結(jié)果一致，hPDLCs增殖及炎癥因子表達(dá)與ROS表達(dá)同步，表明ROS在IS對(duì)hPDLCs生物學(xué)特性的影響中可能起到重要作用，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

本研究通過使用生理范圍內(nèi)不同濃度的IS刺激hPDLCs，發(fā)現(xiàn)125 μmol/L濃度水平的IS可抑制其增殖，并上調(diào)相關(guān)炎癥因子及ROS的表達(dá)水平。初步證實(shí)了IS可能是CKD患者更易罹患牙周炎的關(guān)鍵因素之一。該結(jié)果為CKD的治療提供了潛在的新思路，但I(xiàn)S作用于hPDLCs的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。