上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，上海200233

膽汁酸（bile acid，BA）是膽固醇在肝臟分解代謝的最終產(chǎn)物，是體內(nèi)類固醇/甾醇排泄的主要形式[1]。研究[2-4]表明BA不僅在食物消化、吸收方面具有重要的生理功能，同時(shí)也是機(jī)體內(nèi)一種重要的信號調(diào)節(jié)因子，在能量代謝、糖脂代謝等方面發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用。BA的合成是由肝臟膽固醇首先在膽固醇7α-羥基化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）作用下進(jìn)行7α-羥基化，或者在固醇27-羥化酶（sterol 27-hydroxylase，CYP27A1）作用下進(jìn)行27-羥基化開始的，即BA合成的“經(jīng)典途徑”與“替代途經(jīng)”[5]。人體中90%的BA主要靠經(jīng)典途徑合成[6-7]。在經(jīng)典途徑中，膽固醇的7α-羥基化是膽汁酸合成中的關(guān)鍵步驟，由限速酶CYP7A1所催化[8]，隨后經(jīng)3β-羥基-Δ5-C27-類固醇脫氫酶（3β-hydroxyl-Δ5-C27-steroid dehydrogenase，HSD3B7）轉(zhuǎn)化為7α-羥基-4-膽固醇烯-3-酮（7α-hydroxy-4-cholesten-3-one，C4）。既往研究[9]表明血漿C4的濃度水平與肝臟CYP7A1活性相關(guān)，因此，C4被認(rèn)為是表征CYP7A1活性的重要代謝物，同時(shí)它也是合成膽酸（cholic acid，CA）、鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）的前體物質(zhì)。因此，C4是反映肝臟膽汁酸合成水平的重要生物標(biāo)志物[10-13]。

研究報(bào)道檢測血中C4的方法多集中于對C4單一物質(zhì)的定量。Jean-Christophe等[14]通過對人血清C4的定量協(xié)助診斷膽汁酸吸收不良癥；Akira等[15]使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量血清中C4的水平以反映BA的合成；DeBarber等[16]通過定量人血漿C4的含量快速、簡便地診斷腦腱黃瘤病（cerebrotendinous xanthomatosis，CTX）。

本研究擬建立基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)的定量方法，同時(shí)定量C4及C4的下游代謝產(chǎn)物，即肝臟膽固醇分解代謝產(chǎn)生的2個(gè)初級膽汁酸CA和CDCA（可以反映肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸時(shí)關(guān)鍵酶CYP7A1的活性，還在一定程度上表征了肝臟合成膽汁酸的水平），并將該方法應(yīng)用于臨床糖尿病患者血漿中C4、CA、CDCA的含量變化研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

連續(xù)納入2019年4月—5月參與上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌科口服葡萄糖耐量試驗(yàn)的志愿者35人，以世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）糖尿病診斷與分型標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)將35名志愿者分為3組：糖尿病前期組10人，糖尿病組15人，正常健康對照組10人；3組之間年齡、性別比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有患者均知情同意且簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

C4與氘代同位素7α-羥基-4膽固醇烯-3-酮（d7-C4），購自加拿大Toronto Research Chemicals公司，CA和CDCA標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Steraloids公司，氘代同位素膽酸（d4-CA）、氘代同位素鵝去氧膽酸（d4-CDCA）均購自加拿大C/D/N ISOTopes 公司，色譜純的乙腈和甲醇購自美國Thermo Fisher Scientific公司，色譜純甲酸購自美國Sigma-Aldrich公司，超純水[電阻率18.2（MΩ·cm）]為Milli-Q純水儀制備。

1.3 方法

1.3.1 樣本前處理 分別使用含有肝素抗凝劑的負(fù)壓采血管收集35名試驗(yàn)對象的靜脈血各3 mL。采血后上下顛倒管子，使血液與肝素混合均勻。1 006×g離心10 min，分離，取上層得到血漿樣本。血漿質(zhì)控（quality control，QC）樣本為所收集的35例試驗(yàn)對象的血漿各取100 μL混合而成，共3 500 μL。

測試血漿樣本前處理過程：精密吸取各試驗(yàn)對象的血漿50 μL置于1.5 mL離心管中，加入200 μL的乙腈（含d7-C4、d4-CA、d4-CDCA同位素內(nèi)標(biāo)，濃度均為50 nmol/L），渦旋5 min。于-20 ℃下放置20 min后在4 ℃，20 375×g離心10 min，取上清液200 μL，待測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本的前處理：C4的標(biāo)準(zhǔn)品儲存液濃度為100 μmol/L，CA和CDCA的標(biāo)準(zhǔn)品儲存液濃度為200 μmol/L。3種標(biāo)準(zhǔn)品儲存液各取10 μL混合均勻，再加入970 μL甲醇稀釋成C4為1 000 nmol/L、CA和CDCA均為2 000 nmol/L的標(biāo)品混合液。之后用甲醇逐級稀釋成8個(gè)濃度梯度（STD1～STD8），其中C4濃度梯 度 為5、10、25、50、100、250、500、1 000 nmol/L；CA和CDCA濃度梯度為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 nmol/L。分別精密吸取各濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL置于1.5 mL離心管，按測試血漿樣本的前處理過程處理。

1.3.2 儀器測定條件 色譜系統(tǒng)為Waters公司Acquity?UPLC，色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），保護(hù)柱為ACQUITY UPLC?BEH C18 vanGuard? Pre-Column（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）。流動相A為含0.01%甲酸的去離子水，流動相B為含0.01%甲酸的乙腈-甲醇（體積比9:1），柱溫45 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 C4與BAs的梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution of C4 and BAs

試驗(yàn)的質(zhì)譜系統(tǒng)為Waters公司Xevo?TQ，采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子源，毛細(xì)管電壓3kV（正離子模式，ES+），2.5 kV（負(fù)離子模式，ES-），干燥氣溫度500 ℃，干燥氣流速1 000 L/h，錐孔氣50 L/h，碰撞氣流速0.14 mL/min，離子源溫度150 ℃。數(shù)據(jù)采集采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）。C4及其同位素內(nèi)標(biāo)d7-C4在正離子模式下監(jiān)測，CA、CDCA與其同位素內(nèi)標(biāo)d4-CA、d4-CDCA在負(fù)離子模式下監(jiān)測，C4、BAs及其同位素內(nèi)標(biāo)的定量離子對見表2。

表2 C4、BAs和同位素內(nèi)標(biāo)的定量離子對Tab 2 Quantitative ion pairs of C4, BAs and isotopic internal standards

1.4 檢測項(xiàng)目

1.4.1 提取溶劑的選擇 為了有效地提取血漿中C4、CA和CDCA，本實(shí)驗(yàn)一共設(shè)計(jì)5組提取溶劑，為不同比例的乙腈-甲醇，體積比分別為1:0，4:1，1:1，1:4，0:1。平行取5份QC樣本，每份50 μL，分別加入以上5種提取溶劑，按1.3.1的處理方法進(jìn)行樣本前處理，比較5種提取溶劑下C4、CA和CDCA的色譜峰形與響應(yīng)值大小，確定最佳提取溶劑。

1.4.2 檢出限、定量限和線性 檢出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantitation，LOQ）是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液測試，計(jì)算不同濃度下各物質(zhì)的信噪比（signal-noise ratio，S/N）。隨著濃度的降低，每個(gè)物質(zhì)測定的信噪比也會降低。本研究將一系列已知濃度的3種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液上機(jī)測試，C4、CA、CDCA濃度相同，分別為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56 nmol/L。取S/N≥3的濃度作為各標(biāo)準(zhǔn)品的LOD，取S/N≥10的濃度作為各標(biāo)準(zhǔn)品的LOQ。

標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本按1.3.1中標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本處理方法處理后檢測。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以物質(zhì)峰面積（compound peak area）和對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積（internal standard peak area）的比值為縱坐標(biāo)（response，R），建立線性回歸方程，考察方法的線性。

1.4.3 重復(fù)性 平行取6份標(biāo)準(zhǔn)品混合液（C4濃度為100 nmol/L，CA和CDCA濃度為200 nmol/L），6份QC樣本，按1.3.1方法處理后測試，分別計(jì)算6次測試濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），評估方法的重復(fù)性。

1.4.4 日內(nèi)精密度、日間精密度 取3份標(biāo)準(zhǔn)品混合液（C4濃度為100 nmol/L，CA和CDCA濃度為200 nmol/L），3份QC樣本，按1.3.1中對應(yīng)樣本處理方法處理后，1 d內(nèi)測試3次，每次重復(fù)測試3針，分別計(jì)算所測試濃度的RSD，考察日內(nèi)精密度。

取9份標(biāo)準(zhǔn)品混合液（C4濃度為100 nmol/L，CA和CDCA濃度為200 nmol/L），9份QC樣本，按1.3.1中對應(yīng)樣本處理方法處理，每日處理3份，1 d內(nèi)測試3次，每次重復(fù)測試3針，連續(xù)3 d，分別計(jì)算每日所測試濃度的RSD，考察日間精密度。

1.4.5 加標(biāo)回收率 混合QC中分別加入低、中、高濃度的C4、CA和CDCA的標(biāo)準(zhǔn)品混合液后，按1.3.1中QC樣本處理方法處理，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加入標(biāo)準(zhǔn)品混合液前后QC樣本中C4、CA和CDCA的濃度，計(jì)算各自的加標(biāo)回收率。

1.4.6 穩(wěn)定性 取3份QC樣本，按1.3.1中QC樣本處理方法處理后，每份取30 μL提取液立即測試作為0 h結(jié)果，每份剩余提取液密封存放于4 ℃冰箱保存，并分別于12、24、48、72、96 h和7 d，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)每份各取30 μL進(jìn)行測試，通過比較每份其余各時(shí)間點(diǎn)的濃度與0 h濃度的RSD，評估樣本在4 ℃存放的穩(wěn)定性。

1.4.7 方法應(yīng)用 用本文建立的方法，分別測試每個(gè)血漿樣本中C4、CA、CDCA的離子對峰面積，并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量每個(gè)血漿樣本中C4、CA、CDCA的含量。計(jì)算糖尿病前期組、糖尿病組、健康對照組中C4、CA、CDCA的平均值，考察并比較這3種物質(zhì)在各組中的變化情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用t-test雙尾檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)方法，P＜0.05為有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 提取溶劑

5種提取溶劑測試結(jié)果顯示：不同提取溶劑提取QC樣本，對C4的提取效率影響最大。其中純乙腈提取C4的峰強(qiáng)度最強(qiáng)，干擾峰最少，而對CA、CDCA的影響相對較小。綜合考慮，確定乙腈為最終提取溶劑，提取離子峰見圖1。

圖1 C4、CA和CDCA的提取離子流色譜圖Fig 1 Extracted ion chromatograms of C4, CA and CDCA

2.2 C4、CA和CDCA的檢出限、定量限和線性

通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品溶液測定結(jié)果的信噪比（S/N）確定3種物質(zhì)C4、CA和CDCA的LOD分別為0.16、0.02和0.04 nmol/L，LOQ分別為0.32、0.04和0.16 nmol/L。線性結(jié)果顯示：C4在5～1 000 nmol/L濃度范圍內(nèi)，CA、CDCA在10～2 000 nmol/L濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，滿足定量要求（表3）。

2.3 C4、CA和CDCA的重復(fù)性

標(biāo)準(zhǔn)品溶液和QC樣本各自平行處理6份，6份測試結(jié)果的RSD顯示該方法C4、CA和CDCA的重復(fù)性良好，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和QC樣本中3種物質(zhì)的RSD均低于3%，如表4所示，滿足定量要求。

表3 C4、CA 和CDCA的濃度梯度與線性關(guān)系Tab 3 Concentration gradient and linear relationships of C4, CA and CDCA

表4 C4，CA 和CDCA的重復(fù)性Tab 4 Repeatabilities of C4, CA and CDCA

2.4 C4、CA和CDCA的日內(nèi)精密度和日間精密度

標(biāo)準(zhǔn)品溶液和QC樣本中C4、CA和CDCA的日內(nèi)精密度的RSD均低于5%；兩者日間精密度第1日結(jié)果在6%以內(nèi)，第2日結(jié)果在4%以內(nèi)，第3日結(jié)果在5%以內(nèi)。如表5所示，該方法的日內(nèi)精密度與日間精密度良好，RSD符合定量要求。

表5 C4、CA 和CDCA的日內(nèi)精密度與日間精密度結(jié)果Tab 5 Inter-day and intra-day RSDs of C4, CA and CDCA

2.5 C4、CA和CDCA的加標(biāo)回收率

加標(biāo)回收率結(jié)果顯示，C4、CA、CDCA的平均加標(biāo)回收率分別是97.7%、113.3%、105.0%，且3種物質(zhì)在中、高2個(gè)濃度下的回收率良好（表6）。

表6 C4、CA 和CDCA的加樣回收率Tab 6 Recovery rates of C4, CA and CDCA

2.6 C4、CA和CDCA的穩(wěn)定性

通過將12、24、48、72、96 h及7 d各時(shí)間點(diǎn)QC樣本的測試結(jié)果與0 h的測試結(jié)果相比較，得出C4、CA和CDCA在各時(shí)間點(diǎn)的濃度與0 h濃度的RSD均小于10%（表7），說明經(jīng)該方法處理后樣本在4 ℃條件下能夠穩(wěn)定存儲（7 d內(nèi)）。

2.7 方法應(yīng)用

本研究采用上文建立的方法，對10例健康對照、10例糖尿病前期和15例糖尿病患者血漿中C4、CA和CDCA的濃度進(jìn)行了定量測定。結(jié)果表明，糖尿病組血漿C4濃度與健康對照組相比顯著下降（P＜0.05），但糖尿病前期組與健康對照組相比血漿C4濃度沒有顯著性改變。同時(shí)，糖尿病前期組與糖尿病組相比血漿C4濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣的，血漿中CA和CDCA與C4表現(xiàn)出相似的情況（圖2）。

進(jìn)一步通過相關(guān)性分析可知，血漿中C4濃度與血漿CDCA的濃度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系（r=0.554，P=0.000），如圖3所示。

圖3 血漿中C4與CDCA濃度的相關(guān)性Fig 3 Correlation of C4 and CDCA in plasma

3 討論

血漿中C4被看作是肝臟合成BA時(shí)表征CYP7A1活性的一個(gè)重要生物標(biāo)志物[17-18]，一直以來備受關(guān)注，也誕生了各種檢測手段。質(zhì)譜檢測儀器的高靈敏度與高特異性，使得檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。而相對于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS），UPLC-MS/MS由于在樣本前處理部分不需要進(jìn)行衍生化而縮短了樣本制備時(shí)間，大大降低了檢測的時(shí)間成本。而BA除了在脂肪乳化中的傳統(tǒng)作用外，還是機(jī)體重要的信號分子。因此，在生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的BA研究日益增多，對檢測的敏感性要求也更高[19]。根據(jù)研究報(bào)道，絕大多數(shù)基于質(zhì)譜的檢測方法都集中在對C4的定量，而未同時(shí)定量BA合成的實(shí)際水平。本研究建立了一種能同時(shí)定量C4和BA含量的方法，經(jīng)驗(yàn)證具有高靈敏度、準(zhǔn)確度和快速等特點(diǎn)。

本研究建立的方法經(jīng)過對血樣進(jìn)行簡單前處理后，采用UPLC-MS/MS對C4，以及C4下游合成的CA和CDCA同時(shí)進(jìn)行定量。該方法經(jīng)方法學(xué)考察符合準(zhǔn)確定量的要求，適用于臨床樣本的定量檢測。其中C4的加標(biāo)回收率結(jié)果顯示，在加入低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液時(shí)，由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，C4的加標(biāo)回收率結(jié)果較差（78.0%）。隨著加入的標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度增大，這種影響會降低，能夠得到較好的回收率結(jié)果，這與Jean-Christophe 等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。使用該方法對所收集的臨床糖尿病患者血漿樣本進(jìn)行C4、CA和CDCA定量，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血漿中C4含量顯著低于健康人水平，表明糖尿病患者BAs合成能力下降。且C4合成的下游BA CA和CDCA水平均分別低于健康對照組，這也印證了BA合成的減少。由于CYP7A1是經(jīng)典膽汁酸合成途徑中唯一的限速酶，因此C4的含量高低與CYP7A1的活性呈正相關(guān)，C4濃度水平的下降主要反映CYP7A1活性的減弱，而膽汁酸合成中的經(jīng)典途徑主要合成CA和CDCA 2種初級膽汁酸，CYP7A1活性的減弱會直接影響到這2種初級膽汁酸的合成水平，這與我們的檢測結(jié)果是一致的。同時(shí)，血漿C4濃度與CDCA濃度呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，表明C4濃度的下降將主要影響到CDCA的合成，提示糖尿病患者血膽汁酸水平的降低可能與初級膽汁酸CDCA的合成減少有直接關(guān)系，這為研制靶向藥物及制定臨床干預(yù)措施提供了重要的依據(jù)。

綜上所述，利用UPLC-MS/MS同時(shí)定量C4和CA、CDCA的方法簡單可靠、實(shí)用性強(qiáng)。結(jié)合膽汁酸水平，可以獲得人體膽汁酸代謝情況，為臨床疾病的預(yù)后和診斷提供依據(jù)。