劉靜，蔡皓，段煜，裴科，周佳，張雅婷，莫子晴，鈕敏潔

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2．南京中醫(yī)藥大學(xué)國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023；3．山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院，山西 太原 030024)

四逆散(Sinisan，SNS)由柴胡、白芍、枳實(shí)和炙甘草組成，源于張仲景《傷寒論》。研究表明，SNS能夠顯著改善抑郁模型大鼠的抑郁狀態(tài)[1]。本研究將醋柴胡(柴胡的炮炙品)和醋白芍(白芍的炮炙品)與枳實(shí)和炙甘草配伍，形成醋炙品組方四逆散(Vinegar-processed Sinisan，VPSNS)。由課題組前期實(shí)驗研究可知，VPSNS也同樣具有抗抑郁作用。但SNS和VPSNS抗抑郁的機(jī)制目前尚未明確。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在抑郁癥中發(fā)揮著非常重要的作用。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)與學(xué)習(xí)記憶分子神經(jīng)機(jī)制的關(guān)系特別受到關(guān)注，其參與介導(dǎo)依賴Ca2+的BDNF表達(dá)。此外，在抑郁的發(fā)展過程中，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號在抑郁相關(guān)的大腦區(qū)域被破壞。由此我們推測，BDNF-ERK-CREB信號系統(tǒng)可能參與了抑郁癥的分子機(jī)制。

基于此，課題組擬通過對損傷指標(biāo)和抑郁指標(biāo)的檢測，探討皮質(zhì)酮(CORT)致PC12細(xì)胞模型作為體外抑郁模型的科學(xué)性并探討SNS以及VPSNS減輕CORT導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動物與細(xì)胞系

SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(180±20)g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，許可證號：SCXK(浙)2019-0002；高分化PC12細(xì)胞購于上海賽百慷公司。

1.2 藥物與試劑

柴胡飲片(產(chǎn)地：甘肅，批號：20161101)，白芍飲片(產(chǎn)地：安徽，批號：20161001)，枳實(shí)飲片(產(chǎn)地：江西，批號：20160901)和炙甘草飲片(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，批號：20160801)均購自安徽銅陵禾田中藥飲片有限公司，經(jīng)檢測均符合2015版《中國藥典》(一部)各飲片項下的質(zhì)量規(guī)定。醋柴胡飲片和醋白芍飲片均采用上述對應(yīng)批號的柴胡飲片和白芍飲片按照2015版《中國藥典》(四部)炮制至規(guī)定程度。

MTT(北京Solarbio公司，批號：M8180-250)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號：10099141)；青霉素-鏈霉素溶液(美國Gibco公司，批號：BL505A)；PBS緩沖液(德國Hyclone公司，批號：lw-sh30256.01)；胰酶(美國Gibco公司，批號：C0205)；DMSO(美國MPBIO公司，批號：D4540-500ML)；CORT(北京Solarbio公司，批號：HY-B1618)；RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0013B)；大鼠ELISA試劑盒(南京金益柏生物科技有限公司，批號：201909)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20190910)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20190912)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：C11995500BT)；蛋白濃度檢測試劑BCA液(美國Thermo公司，批號：EE60997A)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：KGA1023-1026)；總RNA快速提取試劑(含RNApure)(南京翼飛雪生物科技有限公司，批號：YFXM0011P)；氯仿(中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號：20180611)；異丙醇(上海申博化工有限公司，批號：XK13-011-00011)；DEPC水(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：R0021)；2×SYBR Green Fast qPCR Master Mix(南京翼飛雪生物科技有限公司，批號：YFXM001)；cDNA第一鏈快速合成試劑盒(去基因組)(南京翼飛雪生物科技有限公司，批號：YFXM0012-100)。

1.3 儀器

Zeiss Axion A1倒置顯微鏡(德國Zeiss公司)；INE600 CO2培養(yǎng)箱(德國MEMMERT公司)；低速離心機(jī)(中國湘儀離心機(jī)儀器公司)；BioRad Model 550型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；XW-80A旋渦振蕩器(中國海門其林貝爾儀器制造有限公司)；ST 16R高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Sorvall公司)；移液器(德國Eppendorf公司)；CFX Connect熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 按照SNS的處方比例(1∶1∶1∶1)，分別稱取柴胡飲片6.0 g，白芍飲片6.0 g，枳實(shí)飲片6.0 g和炙甘草飲片6.0 g，置同一圓底燒瓶中，加6倍量的蒸餾水回流提取1.5 h，過四層紗布濾出藥液，殘渣再加4倍量的蒸餾水回流提取1 h，過四層紗布濾出藥液，合并2次所得藥液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至藥物濃度為0.1 g/mL，即得SNS的供試品溶液，置冰箱保存供大鼠灌胃用。

分別稱取醋柴胡飲片6.0 g，醋白芍飲片6.0 g，枳實(shí)飲片6.0 g和炙甘草飲片6.0 g，采用上述SNS供試品溶液制備的同樣方法制得VPSNS的供試品溶液，置冰箱保存供大鼠灌胃用。

2.1.2 含藥血清的制備 SD大鼠(n=6)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，連續(xù)灌胃給藥3 d，早晚各1次，給藥劑量為成年人臨床劑量的6倍[2]，采血前禁食不禁水12 h以上。末次給藥1 h后，常規(guī)乙醚麻醉。麻醉后腹主動脈取血，37 ℃靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，加入10 mL無菌離心管。56 ℃水浴鍋滅活30 min后于細(xì)胞房中75%酒精消毒，血清用0.22 μm微孔濾膜除菌，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察

PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗。

6孔板觀察細(xì)胞形態(tài)，每孔細(xì)胞數(shù)5×104個，種板體積1 mL，孵育箱中孵育24 h后，給予不同濃度(100、200、300、400、500、600 μmol/L)的CORT溶液，給藥體積500 μL。分別繼續(xù)孵育24、36、48 h后，于顯微鏡下觀察拍照。

2.3 細(xì)胞給藥及分組

2.3.1 CORT條件篩選分組 取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞，消化、計數(shù)，以每孔1×104個的密度接種于96孔板中，每孔200 μL。培養(yǎng)24 h后，棄去上清，200 μL PBS洗2遍。給予不同濃度(100、200、300、400、500、600 μmol/L)的CORT溶液，每個濃度6個復(fù)孔，同時設(shè)置6個調(diào)零孔，內(nèi)加培養(yǎng)液。藥物分別作用24、36、48 h。

2.3.2 含藥血清濃度的確定 細(xì)胞處理方法同2.3.1。分為空白對照組(200 μL全培)、CORT組(500 μmol/L CORT)、SNS血清組(濃度分別為2.5%、5%、10%、20%、40%)和VPSNS血清組(濃度分別為2.5%、5%、10%、20%、40%)。每個濃度6個復(fù)孔，同時設(shè)置6個調(diào)零孔，內(nèi)加培養(yǎng)液。

2.3.3 藥效實(shí)驗 細(xì)胞處理方法同2.3.1。分為空白對照組(200 μL全培)、CORT組(500 μmol/L CORT)、SNS血清組(100 μL 20%SNS血清+100 μL 500 μmol/L CORT)和VPSNS血清組(100 μL 20%VPSNS血清+100 μL 500 μmol/L CORT)，每個濃度6個復(fù)孔，同時設(shè)置6個調(diào)零孔，內(nèi)加培養(yǎng)液。

2.4 MTT法檢測細(xì)胞活力

2.3.1和2.3.2實(shí)驗結(jié)束后，棄去上清，每孔加入200 μL 0.5 mg/mL MTT，孵育4 h后，棄去上清，加入150 μL DMSO，搖床上搖晃10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光度值。

2.5 ELISA法檢測抑郁指標(biāo)

將PC12細(xì)胞培養(yǎng)24 h，按2.3.3項下進(jìn)行給藥處理后，用無菌管收集200 μL細(xì)胞上清液，于4 ℃離心機(jī)中3 000 r/min離心20 min。收集各組上清液，用ELISA試劑盒檢測多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)含量。

2.6 WST-1法檢測損傷指標(biāo)

將細(xì)胞按2.3.3項下進(jìn)行給藥處理后，用無菌管收集，離心20 min左右(2 000～3 000 r/min)。收集各組上清液，用WST-1法檢測LDH含量和SOD活力。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

按2.3.3項下給藥后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，終止消化后，1 500 r/min離心3 min，吸去上清，用PBS洗1遍，離心后用PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。每樣本細(xì)胞數(shù)為5×105mL-1，離心去上清，加入500 μL Bing buffer重懸細(xì)胞。槍頭反復(fù)吹吸混勻細(xì)胞，加入7-ADD以及Annexin V-APC染液各5 μL，室溫避光孵育15 min。PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡數(shù)。

2.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)

按2.3.3項下給藥后，收集細(xì)胞，每孔加入100 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑及PMSF各10 μL)，振蕩器震蕩30 s，超聲裂解細(xì)胞15 min后，12 000×g，4 ℃離心20 min，取上清，BCA檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液煮沸，每孔上樣50 μg，SDS-PAGE電泳，將蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)緩沖液轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA封閉3 h，一抗4 ℃孵育15 h，TBS洗滌1次，二抗孵育2 h后ECL發(fā)光液壓片顯色，GAPDH為內(nèi)參。

2.9 qPCR檢測基因表達(dá)

采用Triozol法提取RNA，以提取的細(xì)胞總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR法進(jìn)行檢測。ERK1上游引物序列：5'-GCCAGTGGCCGAGGAACCTTTC-3'，下游引物序列：5'-GCTGGAAGCGGGCTGTCTCCT-3'；ERK2上游引物序列：5'-GTTCCCCGAACGCGGACTCCAAAG-3'，下游引物序列：5'-ATCCCGGCTGGAATCGAGCAGTC-3'；CREB上游引物序列：5'-CTGAGGAGCTTGTACCACCG-3'，下游引物序列：5'-AATCTGTGGCTGGGCTTGAA-3'；BDNF上游引物序列：5'-CTCCTCTGCTCTTTCTG-3'，下游引物序列：5'-GACCCACTCGCTAATAC-3'；GAPDH上游引物序列：5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，下游引物序列：5'-ACATACTCAGCACCAGCATCAC-3'。ERK1、ERK2和GAPDH為兩步法延伸，延長溫度為56.5 ℃，即初始95 ℃、10 s，56.5 ℃、45 s，合計40個循環(huán)；CREB和BDNF為三步法，初始95 ℃、10 s，55 ℃、30 s，70 ℃、45 s，合計40個循環(huán)。引物由南京翼飛雪生物科技有限公司合成，GAPDH為內(nèi)參。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 CORT造模條件及含藥血清濃度的研究

3.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡下，正常的PC12細(xì)胞呈多邊形，貼壁生長，軸突清晰可見，胞體較大，細(xì)胞數(shù)目較多，如空白對照組所示(圖1)。損傷的PC12細(xì)胞隨CORT濃度的不同呈現(xiàn)出不同程度的損傷甚至死亡，軸突不明顯，貼壁性減弱。死亡細(xì)胞完全不貼壁,呈圓形。給予不同濃度的CORT 24、36、48 h后的結(jié)果分別如圖1所示。500 μmol/L CORT所致PC12損傷的藥效最強(qiáng)，細(xì)胞全部死亡，視野中無貼壁細(xì)胞。當(dāng)CORT濃度增加到600 μmol/L時，視野中又出現(xiàn)貼壁、有軸突的細(xì)胞。

3.1.2 最佳CORT給藥濃度和時間的研究 如圖2所示，CORT致PC12細(xì)胞損傷的最佳濃度和時間為500 μmol/L和36 h，與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。

3.1.3 含藥血清濃度的確定 由圖3可知，SNS血清組和VPSNS血清組的最佳給藥濃度均為20%。

3.2 各組細(xì)胞上清液中DA、5-HT、TNF-α和IL-1β含量的比較

與空白對照組相比，CORT組DA、5-HT含量下降(P<0.05)；與CORT組相比，20%SNS血清組和20%VPSNS血清組DA、5-HT含量均有上升(P<0.05)；與20%SNS血清組相比，20%VPSNS血清組DA、5-HT含量顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組DA和5-HT含量的比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與CORT組比較，#P<0.05；與SNS血清組比較，△P<0.05。

與空白對照組相比，CORT組的TNF-α、IL-1β含量升高(P<0.05)；與CORT組相比，20%SNS血清組和20%VPSNS血清組的TNF-α、IL-1β含量均有下降(P<0.05)；與20%SNS血清組相比，20%VPSNS血清組TNF-α、IL-1β含量明顯增加(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組炎癥因子TNF-α和IL-1β含量的比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與CORT組比較，#P<0.05；與SNS血清組比較，△P<0.05。

3.3 各組細(xì)胞上清液中LDH含量和SOD活力的比較

與空白對照組相比，CORT組的LDH含量增加(P<0.05)；與CORT組相比，20%SNS血清組和20%VPSNS血清組的LDH含量均有減少(P<0.05)；與20%SNS血清組相比，20%VPSNS血清組的LDH含量顯著減少(P<0.05)。

與空白對照組相比，CORT組的SOD活力減少(P<0.05)；與CORT組相比，20%SNS血清組和20%VPSNS血清組的SOD活力均顯著增加(P<0.05)；與20%SNS血清組相比，20%VPSNS血清組SOD活力顯著增加(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組損傷因子LDH含量和保護(hù)因子SOD活力的比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與CORT組比較，#P<0.05；與SNS血清組比較，△P<0.05。

3.4 各組細(xì)胞凋亡率比較

結(jié)果如圖4和表4所示。與空白對照組相比，CORT組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與CORT組相比，20%SNS血清組和20%VPSNS血清組的細(xì)胞凋亡率均有降低(P<0.05)；與20%SNS血清組相比，20%VPSNS血清組的細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

3.5 各組Western blot檢測蛋白表達(dá)的比較

表4 各組細(xì)胞凋亡率比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與CORT組比較，#P<0.05；與SNS血清組比較，△P<0.05。

由圖5～6可知，與空白對照組相比，CORT組的BDNF、ERK、p-ERK、CREB和p-CREB蛋白表達(dá)均有下降(P<0.05)；與CORT組相比，20%SNS血清組和20%VPSNS血清組的BDNF、ERK、p-ERK、CREB和p-CREB蛋白表達(dá)均有上升(P<0.05)；與20%SNS血清組相比，20%VPSNS血清組的BDNF、ERK、p-ERK、CREB和p-CREB蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

3.6 各組qPCR檢測基因表達(dá)的比較

由圖7可知，與空白對照組相比，CORT組的BDNF、ERK和CREB基因表達(dá)均有下降(P<0.05)；與CORT組相比，20%SNS血清組和20%VPSNS血清組的BDNF、ERK和CREB基因表達(dá)均有上升(P<0.05)；與20%SNS血清組相比，20%VPSNS血清組的BDNF、ERK和CREB基因表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

4 討論

目前，具有典型的神經(jīng)元和糖皮質(zhì)激素受體特征的PC12細(xì)胞，已被廣泛應(yīng)用于研究神經(jīng)元損傷的體外模型[3-5]。研究表明，抑郁癥患者“下丘腦-垂體-腎上腺”(HPA)軸的活躍會最終導(dǎo)致CORT含量的升高，而CORT含量的升高是抑郁癥發(fā)生機(jī)制的一個終點(diǎn)性變化指標(biāo)。已有實(shí)驗發(fā)現(xiàn)抑郁癥大鼠中的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和CORT濃度顯著增加，表明抑郁癥大鼠HPA軸亢進(jìn)，推測這可能是抑郁癥的發(fā)病機(jī)制之一[6-8]。CORT為抑郁細(xì)胞實(shí)驗的一個常用模型藥物[9]。抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有多種假說，其中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說有眾多的研究支持，參與抑郁癥過程的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有5-HT和DA等[10]。姚輝等[10]通過對醫(yī)院就診抑郁癥患者治療前后細(xì)胞因子的水平變化，得出就診前患者IL-1β水平高于正常人水平，經(jīng)過4周治療后，患者的細(xì)胞因子水平顯著降低。葉曉楠等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SNS可改善慢性刺激所致的抑郁癥大鼠睡眠，全腦TNF-α水平增加，認(rèn)為SNS對TNF-α信號通路的調(diào)節(jié)可能是SNS治療抑郁的機(jī)制之一。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能夠消除細(xì)胞新陳代謝的產(chǎn)物，并有減小細(xì)胞損傷和氧化的作用。LDH是一種能夠催化乳酸脫氫生成丙酮酸的酶。當(dāng)細(xì)胞損傷時，LDH大量溢出，SOD則對細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

雖然單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說在抑郁癥發(fā)病機(jī)制假說中被廣泛接受，但同時也有越來越多的學(xué)者研究證明了炎癥因子與抑郁癥發(fā)病的相關(guān)聯(lián)系。文獻(xiàn)表明，分化PC12細(xì)胞具有神經(jīng)性，很多學(xué)者用CORT致PC12細(xì)胞損傷來進(jìn)行體外抑郁研究，但是CORT作用前后的相關(guān)抑郁指標(biāo)變化并沒有學(xué)者進(jìn)行相關(guān)闡述。在本研究中，CORT組與空白對照組相比，DA、5-HT、TNF-α和IL-1β的含量均有降低，且5-HT、TNF-α和IL-1β的含量變化具有顯著性差異(P<0.05)，從單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說和炎癥細(xì)胞因子假說這2個角度來看，顯示出CORT作用于PC12細(xì)胞用于研究體外抑郁實(shí)驗具有一定的科學(xué)性。

有學(xué)者將抑制PC12細(xì)胞凋亡的作用作為抗抑郁活性成分的篩選[12]。在本實(shí)驗研究中，20%SNS血清組和20%VPSNS血清組的細(xì)胞凋亡率均有所降低，且20%VPSNS血清組的細(xì)胞凋亡率小于20%SNS血清組的細(xì)胞凋亡率，提示SNS和VPSNS的抗抑郁作用可能與其抗細(xì)胞凋亡作用有關(guān)，且VPSNS的抗細(xì)胞凋亡作用優(yōu)于SNS的抗細(xì)胞凋亡作用，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，BDNF的表達(dá)與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)[13]。BDNF可促進(jìn)5-HT神經(jīng)元的存活和分化[14]。在BDNF的控制下，CREB在調(diào)節(jié)運(yùn)動誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)和記憶增強(qiáng)方面具有功能作用[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，L型VSCCs介導(dǎo)了Ca2+的內(nèi)流，而Ca2+通過CREB家族依賴機(jī)制刺激了BDNF啟動子Ⅲ的轉(zhuǎn)錄[16]。這些研究結(jié)果表明，BDNF是CREB家族轉(zhuǎn)錄因子的一個關(guān)鍵靶點(diǎn)，可能介導(dǎo)了CREB家族對突觸功能的影響。p-CREB是CREB的磷酸化活化形式。最近的一項研究預(yù)測，哺乳動物基因組中可能有多達(dá)10 000個CREB結(jié)合位點(diǎn)，例如，BDNF和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子等分子含有CREs[17]。根據(jù)細(xì)胞類型或大腦區(qū)域的不同，CREB磷酸化的持續(xù)時間可能不同。也有研究表明，Aβ可通過調(diào)節(jié)p-CREB來降低BDNF轉(zhuǎn)錄[18]。CREB的激活是通過一個特定的絲氨酸(Ser133)殘基的磷酸化介導(dǎo)的。這種磷酸化可以促進(jìn)CREB與CREB結(jié)合蛋白的結(jié)合，CREB結(jié)合蛋白是一種輔助激活蛋白，可以幫助轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的裝配，從而激活靶基因[19]。ERK信號通路的缺陷與抑郁行為的表現(xiàn)有關(guān)[20]。ERK包括ERK1和ERK2。有研究表明，參與了抑郁癥神經(jīng)機(jī)制的ERK-CREB信號系統(tǒng)可能是氟西汀抗抑郁作用的靶點(diǎn)[21]。BDNF是ERK的直接上游調(diào)節(jié)因子[22]。同時，海馬內(nèi)Raf/ERK/RSK/CREB信號通路可能參與了耳甲電針的抗抑郁效應(yīng)[23]。本實(shí)驗結(jié)果顯示，SNS和VPSNS均具有一定的抗抑郁作用，此作用可能是通過調(diào)控BDNF-ERK-CREB通路實(shí)現(xiàn)的。