蔡琳玲，方麗文，劉子修

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009；2.中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210002)

高血脂癥是一種以血脂異常為主要特征的代謝綜合征，是動脈粥樣硬化、冠心病、脂肪肝的誘發(fā)因素之一[1]。臨床上運(yùn)用他汀類藥物治療高血脂癥，雖然能夠顯著降低血漿中的總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)，降低心腦血管疾病的發(fā)病率，但他汀類藥物能夠引起胃腸道反應(yīng)、肝損傷以及橫紋肌溶解癥等毒副反應(yīng)[2]。荷丹調(diào)脂方是由荷葉、丹參、補(bǔ)骨脂、山楂及番瀉葉組成的復(fù)方中成藥，荷葉行氣祛濕、丹參活血化瘀、山楂理氣消食、番瀉葉潤腸通便、補(bǔ)骨脂溫補(bǔ)肝腎，具有活血化瘀、補(bǔ)肝益腎、化痰降濁等功效，進(jìn)而降低血脂，同時(shí)臨床運(yùn)用鮮有不良反應(yīng)的報(bào)道。國內(nèi)很多基礎(chǔ)及臨床實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)荷丹調(diào)脂方具有降脂、減體質(zhì)量和改善胰島素抵抗的作用。本研究通過液質(zhì)聯(lián)用及數(shù)學(xué)建模的方式篩選出荷丹調(diào)脂方能夠顯著調(diào)節(jié)的脂質(zhì)種類，豐富臨床用藥的依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

荷丹調(diào)脂方主要由荷葉、山楂、丹參、補(bǔ)骨脂(鹽炒)、番瀉葉。購自南京鶴齡有限公司，由周惠英主管藥師鑒定為合格正品。

1.2 血清樣本

由南京中醫(yī)藥大學(xué)提供，包括：正常飲食飼喂4周大鼠血清50 μL、高脂飲食飼喂4周大鼠血清50 μL、荷丹調(diào)脂方灌胃給藥(600 mg/kg)+高脂飲食飼喂4周大鼠血清50 μL。

1.3 試劑

HPLC級甲醇、乙腈、異丙醇、甲基叔丁基醚(Merck，德國)，HPLC級甲酸、甲酸銨(ROE，美國)。

1.4 儀器

LTQ/OrbitrapxL質(zhì)譜儀、UltiMate 3000型超高效液相色譜，Millipore Synergy型超純水系統(tǒng)(Merck，德國)，KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法

將-80 ℃凍存的小鼠血清于4 ℃解凍，精密吸取20 μL血清于1.5 mL離心管中，加入225 μL含內(nèi)標(biāo)[Lyso PE(17∶1)，SM(17∶0)，PE(17∶0/17∶0)濃度約為5 μg/mL]的冰甲醇，渦旋10 s，加入750 μL MTBE再次渦旋10 s，于4 ℃震蕩10 min，加入188 μL超純水，渦旋20 s后于4 ℃，14 000 r/min離心2 min，吸取350 μL上清液至1.5 mL離心管中，置于離心濃縮儀中揮干。揮干的樣品用110 μL復(fù)溶液(甲醇∶甲苯=9∶1)進(jìn)行復(fù)溶，即渦旋10 min，超聲10 min，14 000 r/min離心10 min后取上清進(jìn)樣分析[3]。

3 脂質(zhì)組學(xué)及分析

3.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD aQ柱(Thermo Fisher，2.1 mm×150 mm,3 μm)。流動相：A為含0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨的乙腈/水溶液(40∶60,V/V)，B為含0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨的異丙醇，乙腈溶液(9∶1,V/V)。梯度洗脫程序：0～l min，20%B；1～21 min，20%～100%B；21～25 min，100%B；25～30 min，20%B。流速：0.35 mL/min；柱溫：55 ℃；自動進(jìn)樣器溫度：4 ℃；進(jìn)樣量2 μL[4]。

3.2 質(zhì)譜條件

儀器使用Thermo LTQ Orbitrap XL，電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子電離模式，正離子噴霧電壓為4.80 kV，負(fù)離子噴霧電壓為4.50 kV，鞘氣40 arb，輔助氣15 arb。毛細(xì)管溫度325 ℃，毛細(xì)管電壓35 V/-15 V，管透鏡電壓50 V/-50 V，以分辨率60 000進(jìn)行全掃描，掃描范圍50～1 000，并采用CID進(jìn)行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時(shí)采用動態(tài)排除(重復(fù)計(jì)數(shù)為2)去除無必要的MS/MS[5]。

3.3 質(zhì)量控制

在進(jìn)行基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)研究時(shí)，為了獲得可靠且高質(zhì)量的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，通常需進(jìn)行質(zhì)量控制(QC)與質(zhì)量保證(QA)工作。通過QC，可以獲取整個(gè)實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差是否在可控范圍內(nèi)；通過QA，剔除不可靠的變量，可以將分析誤差控制在不影響多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的范圍內(nèi)。若QC的誤差在2 SD以內(nèi)，則QC樣本聚集系統(tǒng)可靠。對于QA，F(xiàn)DA建議用于生物標(biāo)記物分析的RSD小于30%是可以接受的，因此對RSD大于30%的變量在后續(xù)生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)過程中進(jìn)行剔除，由此將QA的RSD控制在30%以內(nèi)[6]。

4 數(shù)據(jù)分析

4.1 主成分分析(PCA)

PCA是一種運(yùn)用線性代數(shù)的數(shù)據(jù)降維方法，為無監(jiān)督分析方法，能夠反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)。PCA將代謝物變量按一定的權(quán)重通過線性組合后產(chǎn)生新的特征變量，通過主要新變量(主成分)對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類，因無外加人為因素，得到的PCA模型反映了代謝組數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，有利于掌握數(shù)據(jù)的整體情況并對數(shù)據(jù)從整體上進(jìn)行把握，有利于發(fā)現(xiàn)和剔除異常樣品，提高模型的準(zhǔn)確性。

4.2 主坐標(biāo)分析(PCoA)

PCoA是一種線性代數(shù)的處理方式，該模型能夠展示樣本間相似性，它的分析思路與PCA分析基本一致，都是通過降維方式尋找復(fù)雜樣本中的主要樣本差異距離。與PCA不同的是，PCoA主要利用Unifrac、Bray-Curtis等樣本距離信息進(jìn)行計(jì)算以及降維圖形展示，因此結(jié)果更集中于體現(xiàn)樣本間的相異性距離。

4.3 非度量多維尺度分析(NMDS)

NMDS是一種將多維空間的研究對象(樣本或變量)簡化到低維空間進(jìn)行定位、分析和歸類，同時(shí)又保留對象間原始關(guān)系的非線性數(shù)據(jù)分析方法。NMDS模型適用于無法獲得研究對象間精確的相似性或相異性數(shù)據(jù)，其設(shè)計(jì)目的是為了克服線性模型(包括PCA、PCoA)的缺點(diǎn)，更好地反映生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)。

4.4 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析，首先使用正交信號校正技術(shù)，將自變量X矩陣信息分解成與因變量Y相關(guān)和不相關(guān)的兩類信息，然后將與Y相關(guān)的信息集中在第一個(gè)主成分方向，不相關(guān)信息放在其他主成分方向。R2X、R2Y、Q2Y分別表示OPLS-DA模型自變量的可解釋方差和百分比、模型因變量的可解釋方差和百分比及模型的可預(yù)測度。

4.5 差異代謝物篩選條件選擇

代謝組學(xué)差異代謝物篩選可結(jié)合采用單變量分析和多元數(shù)據(jù)分析或選擇其中一種。用于篩選差異代謝物的單變量數(shù)據(jù)分析,包括2組間比較的t檢驗(yàn)(ttest)和差異倍數(shù)分析(FC)，多組件比較的方差分析(ANOVA)；多元數(shù)據(jù)分析為偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和OPLS-DA。相關(guān)差異代謝物篩選條件有：

①P-value≤0.05+VIP≥1；(t test,PLS-DA/OPLS-DA)

②P-value≤0.05+fold_change≥1.5或≤0.667；(t test,FC)

③P-value≤0.05+VIP>=1+s-plot.pcorr≥0.8；(t test,FC,PLS-DA/OPLS-DA)

④one-way ANOVAP-value≤0.05；(one-way ANOVA)

⑤two-way ANOVAP-value≤0.05.(two-way ANOVA)

本次研究采用條件②篩選差異脂質(zhì)代謝物。

5 結(jié)果

5.1 PCA分析結(jié)果

采用對照組(C)、模型組(M)以及荷丹調(diào)脂方組(T)3組樣品建立PCA模型，模型第一主成分(PC1)解釋了代謝組方差和的35.9%，第二主成分(PC2)解釋了方差和的14.4%，模型質(zhì)量較好。以第一和第二主成分繪制3組樣品的PCA得分圖(圖1)，由圖可知，對照組(C)、模型組(M)以及荷丹調(diào)脂方組(T)組間存在分組趨勢，無異常樣本。

5.2 PCoA分析結(jié)果

由PCoA圖(圖2)可知對照組(C)、模型組(M)以及荷丹調(diào)脂方組(T)樣品按照分組分別聚集為3組，顯示了各組間樣本的差異較大；PCoA模型中第一主成分(PCo1)解釋的自變量差異為64.5%，模型第二主成分(PCo2)解釋的自變量差異為12.4%。

5.3 NMDS分析結(jié)果

由圖3可知，對照組(C)和模型組(M)樣本分開，顯示了2組間樣本差異較大；荷丹調(diào)脂方組(T)和模型組(M)樣本分開，顯示了2組間樣本差異較大；對照組(C)和荷丹調(diào)脂方組(T)存在交集，2組樣本不能明顯分開，顯示了組間樣本的相似性。模型應(yīng)力stress一般在0.2以內(nèi)則可接受，本次建模stress=0.035，顯示了極佳的擬合效果。

5.4 OPLS-DA分析結(jié)果

OPLS-DA模型用于進(jìn)一步分析3組樣品間差異的顯著性。由得分圖可知，對照組與模型組以及模型組與荷丹調(diào)脂方組兩兩組間的模型解釋的代謝組差異分別為32%和39%，解釋的分組信息差異分別為95.4%和78.8%，對分組信息的預(yù)測性為0.761和0.659，數(shù)學(xué)建模較為合理。得分圖中兩兩組間樣本存在分離趨勢，顯示了兩兩組間代謝物的差異性。為了進(jìn)一步分析組間差異的顯著性，使用排列交叉驗(yàn)證(Permutation test)來評估OPLS-DA模型是否過度擬合(Overfitting)。隨機(jī)模型質(zhì)量用R2Y和Q2表示，由圖可知對照組與模型組隨機(jī)模型R2Y和Q2的經(jīng)驗(yàn)性P值分別為0.005和0.005，未出現(xiàn)過度擬合情況，2組樣品差異顯著；荷丹調(diào)脂方組與模型組間隨機(jī)模型R2Y和Q2的經(jīng)驗(yàn)性P值分別為0.105和0.01，也未出現(xiàn)過度擬合情況，2組間差異也達(dá)到了顯著水平。因而，本實(shí)驗(yàn)建立的OPLS-DA模型具有較高的可靠性，建模方式成功，荷丹調(diào)脂方對小鼠血漿脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生了較大影響。OPLS-DA得分圖以及排列交叉驗(yàn)證結(jié)果見圖4。

5.5 差異脂質(zhì)代謝物篩選結(jié)果

差異代謝物的相對含量及名稱、統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)分別見表1～2。

表1 篩選出的由藥物調(diào)節(jié)的差異脂質(zhì)代謝物

表2 差異脂質(zhì)代謝物的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)

5.6 差異代謝物統(tǒng)計(jì)結(jié)果

荷丹調(diào)脂方能夠顯著降低模型組甘油三酯(TG)，包括TG 50∶3、TG 52∶4、TG 54∶5、TG 54∶6、TG 56∶5在血漿中的含量；荷丹調(diào)脂方能夠顯著升高模型組磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)包括：LysoPC 20∶2、LysoPC 23∶0、PC 34∶1、PC 36∶2、PC 36∶4、PC 38∶1在血漿中的含量。組間差異代謝物量化圖見圖5。

6 討論

血脂異常是心腦血管疾病中極為重要的致病危險(xiǎn)因素,減少外源性脂質(zhì)的攝入、降低內(nèi)源性脂質(zhì)的合成及增加機(jī)體脂質(zhì)代謝能力是目前調(diào)控血脂的重要思路。血液中的脂質(zhì)主要以脂蛋白的形式在血漿中轉(zhuǎn)運(yùn)，共同維持機(jī)體血脂的穩(wěn)態(tài)，脂蛋白的組成主要包括甘油三酯類、膽固醇酯(CE)類、磷脂類以及相應(yīng)的載脂蛋白。PC是目前公認(rèn)的最具有生物學(xué)活性的磷脂，被廣泛地運(yùn)用在生物醫(yī)藥領(lǐng)域[7]。血漿中的脂質(zhì)多以載脂蛋白嵌入磷脂包裹的脂質(zhì)核心的脂蛋白顆粒形式在血漿中運(yùn)輸，其中PC起到親和極性載脂蛋白與非極性脂質(zhì)的作用。PC在卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)催化下能夠轉(zhuǎn)化為LysoPC，同時(shí)生成一分子游離脂肪酸(FFA)，F(xiàn)FA再同外周組織、巨噬細(xì)胞等轉(zhuǎn)移出的游離膽固醇一起形成CE，減少了膽固醇在外周組織、巨噬細(xì)胞的沉積，從而降低動脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此，較高水平的PC、LysoPC反映了血漿脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。TG是一種可供外周組織利用的供能物質(zhì)，對于其是否直接增加心腦血管突然事件的發(fā)生率尚存在爭議，但臨床調(diào)查顯示血漿中過高的TG含量是誘發(fā)心腦血管疾病突發(fā)事件的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[9]。

對荷丹調(diào)脂方的藥理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)了其能夠升高LCAT，加速脂質(zhì)的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，減少脂質(zhì)在血管壁的沉積，降低血液黏稠度，保護(hù)血管內(nèi)皮的完整性，同時(shí)還能降低血漿炎癥因子水平，發(fā)揮抗心腦血管疾病的作用[10]。通過UPLC-MS以及多種數(shù)學(xué)建模分析(PCA、PCoA、NMDS、OPLS-DA)驗(yàn)證了荷丹調(diào)脂方對高脂飲食小鼠血漿脂質(zhì)的調(diào)節(jié)和改善作用，荷丹調(diào)脂方通過升高能夠促進(jìn)血漿脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的6種PC、LysoPC含量，促進(jìn)外周游離膽固醇的酯化，被載脂蛋白攜帶最終轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟代謝，從而降低了血漿膽固醇的含量；同時(shí)給予荷丹調(diào)脂方能夠顯著降低血漿中由于造模而升高的5種TG，從而部分降低血液的黏稠度，降低對血管壁的機(jī)械性損傷。由于方法學(xué)的限制，我們在分析中沒有得到完整的膽固醇類組分，但對檢測出的幾種CE的量化統(tǒng)計(jì)顯示了荷丹調(diào)脂方降低了模型組顯著升高的血漿膽固醇，這樣的結(jié)果與臨床報(bào)道一致?？傊?，我們的研究結(jié)果證實(shí)了荷丹調(diào)脂方的降脂作用，豐富了其臨床用藥的依據(jù)，同時(shí)篩選出了藥物顯著性調(diào)控的脂代謝產(chǎn)物，為進(jìn)一步闡明荷丹調(diào)脂方參與調(diào)控的脂代謝靶點(diǎn)和相關(guān)通路提供了思路。