徐瑞 黃鵬 張祎冰,3 任立群

(吉林大學(xué) 1白求恩醫(yī)學(xué)部，吉林 長(zhǎng)春 130021；2藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室；3第一醫(yī)院眼科)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)特征為主動(dòng)脈中脂質(zhì)和纖維成分的積累，這是心血管疾病發(fā)展的病理基礎(chǔ)〔1,2〕。內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)功能障礙導(dǎo)致膽固醇和其他脂質(zhì)在血管壁中沉積，這是AS發(fā)展的初始階段〔3〕。ECs損傷還會(huì)導(dǎo)致促炎因子的內(nèi)膜侵入及血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖異常。AS病變的主要原因之一就是VSMCs的異常增殖和遷移〔4,5〕，因此，VSMCs的增殖和遷移在AS斑塊的形成和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。MicroRNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA，由18～23個(gè)核苷酸組成，可通過(guò)與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)〔6〕。miRNA已被確定參與包括細(xì)胞分化、增殖、遷移和凋亡等多種生物學(xué)相關(guān)過(guò)程〔7～9〕。淫羊藿苷(ICA)是中藥淫羊藿(Epimedium)的主要藥效成分之一。近年來(lái)淫羊藿已被證實(shí)具有心血管系統(tǒng)保護(hù)作用，為AS的防治提供了新的選擇〔10〕。迄今為止，miR-205-5p與AS的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)miRNA及其通路介導(dǎo)的ICA抗AS作用進(jìn)行探索，以期揭示miRNA在ICA治療AS中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.1.1動(dòng)物分組及處理 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(許可號(hào)：2016-0304)，C57BL/6J背景的載脂蛋白(Apo)E-/-小鼠(8周齡，雄性)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，被安置在吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)研究所。在溫度(22±2)℃的環(huán)境下，將所有小鼠分組飼養(yǎng)在12 h/12 h的明暗循環(huán)中，自由獲取食物和水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，將80只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為：①正常對(duì)照(CON)組：普通飲食+等體積羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)灌胃；②模型對(duì)照(MOD)組：高脂飲食(HFD)+等體積CMC-Na灌胃；③陽(yáng)性藥辛伐他汀(SIM)組：高脂飲食+辛伐他汀(5 mg/kg)灌胃；④ICA低劑量(ICA-L)組：高脂飲食+ICA(20 mg/kg)灌胃；⑤ICA高劑量(ICA-H)組：高脂飲食+ICA(40 mg/kg)灌胃。每組均為16只，藥物溶于CMC-Na中，給藥體積為0.1 ml/10 g，每日灌胃1次。通過(guò)給小鼠喂食HFD來(lái)誘導(dǎo)加速發(fā)生AS，該飲食包含20%的脂肪和1.25%的膽固醇(D12108C，Research Diets Inc)。每天早晨9∶00灌胃，每組連續(xù)灌胃12 w，MOD組和ICA組分別接受0.2 ml ICA，CON組給予等體積CMC-Na灌胃。ICA購(gòu)自維克奇生物科技有限公司(中國(guó)四川)。待12 w實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取10只小鼠，行眼眶內(nèi)眥靜脈叢取血，室溫放置至上清液析出，離心取上層血清，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ儆诒蠈⑿∈笾鲃?dòng)脈從根部至腹主動(dòng)脈腎動(dòng)脈分支處離斷取出，固定于4%多聚甲醛，以備石蠟包埋切片備用。每組余下6只小鼠同上法取主動(dòng)脈立即置于液氮中保存，以備分子生物學(xué)檢測(cè)之用。

1.1.2血清學(xué)檢查 取小鼠血清進(jìn)行血脂水平檢測(cè)，采用膽固醇氧化酶-過(guò)氧化物酶耦聯(lián)法檢測(cè)血清中總膽固醇(TC)水平，采用磷酸甘油氧化酶-過(guò)氧化物酶耦聯(lián)法檢測(cè)三酰甘油(TG)水平，采用直接法(表面活性劑消除法)檢測(cè)血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清ox-LDL〔11〕。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.3小鼠胸主動(dòng)脈組織HE染色 將小鼠胸主動(dòng)脈組織固定，制備成石蠟切片后，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，HE染色，以中性樹(shù)脂封片，使用光學(xué)顯微鏡拍照。

1.1.4基因芯片檢測(cè)及生物信息學(xué)分析 將MOD組和ICA-H組主動(dòng)脈組織送檢基因芯片分析(課題組前期工作基礎(chǔ))〔11〕。將ICA-H組MOD組之間差異表達(dá)(DE)的mRNA進(jìn)行基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)途徑分析。通過(guò)構(gòu)建全基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)以證明基因之間的相互作用。使用Cytoscape軟件將網(wǎng)絡(luò)表示為圖形，每個(gè)基因?qū)?yīng)一個(gè)節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間通過(guò)一條邊連接。程度定義為從一個(gè)節(jié)點(diǎn)到其他節(jié)點(diǎn)的鏈接數(shù)，程度更高的基因在信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)更重要的位置。同樣地，基因的特征也由中介中心性來(lái)描述，中介中心性可以評(píng)估基因在網(wǎng)絡(luò)中的中心性?；蛳嗷プ饔每梢愿鶕?jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)得出。

根據(jù)mRNA和miRNA中特異性表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度，建立了miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)以鑒定miRNA與mRNA之間的相關(guān)性，使用Cytoscape軟件繪制共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

1.1.5定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá) 根據(jù)基因表達(dá)譜分析確定miRNA及其靶mRNA。并在CON組、MOD組及ICA兩個(gè)劑量組胸主動(dòng)脈組織所選取的miRNA及其靶基因mRNA表達(dá)情況進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。使用TRIzol試劑從小鼠胸主動(dòng)脈組織中提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作如下：25℃持續(xù)5 min，42℃持續(xù)60 min，80℃持續(xù)2 min。PCR引物設(shè)計(jì)參見(jiàn)前期實(shí)驗(yàn)〔12〕，按SYBR GREEN qPCR Super Mix試劑盒配制反應(yīng)體系(1∶20稀釋cDNA)5.0 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，2×SYBR Green qPCR SuperMix 10 μl，dd H2O 20 μl)，反應(yīng)條件為50℃(2 min)，95℃(2 min)，95℃(15 s)，60℃(32 s)，40個(gè)循環(huán)收集熒光信號(hào)，進(jìn)行溶解曲線分析。GAPDH為內(nèi)部參照，2-ΔΔCt法用于量化每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)，所有實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行，并重復(fù)3次。

1.1.6Western印跡驗(yàn)證相關(guān)蛋白表達(dá) 將小鼠胸主動(dòng)脈組織勻漿懸浮在放射免疫沉淀(RIPA)裂解緩沖液中30 min，離心(10 000 r/min，10 min)后，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司)定量上清液的蛋白質(zhì)濃度，然后將蛋白質(zhì)樣品在95℃下孵育10 min。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離變性的蛋白質(zhì)(20 μg/組)，并電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。隨后，將膜搖動(dòng)并用溶于TBS-T的5%牛血清白蛋白(BSA)在室溫下封閉2 h，然后在4℃下的一抗中孵育過(guò)夜。用0.1%TBS-T清洗膜后，將膜用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二級(jí)多克隆抗體在室溫下處理2 h。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher 公司)檢測(cè)條帶。ImageJ軟件分析相對(duì)譜帶強(qiáng)度。

1.2體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1小鼠VSMCs培養(yǎng)及傳代 小鼠VSMCs于中科院上海細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買。細(xì)胞培養(yǎng)：將裝有DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素及胎牛血清混合液的培養(yǎng)瓶放入37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱10 min；解凍細(xì)胞，制備懸液，離心，將細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)皿內(nèi)，置于上述培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)密度。細(xì)胞傳代：VSMCs貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好、細(xì)胞密度約為80%時(shí)，棄瓶中培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加胰蛋白酶消化，加入含血清培養(yǎng)基終止胰酶作用；吸管吹打至單個(gè)細(xì)胞懸液后，補(bǔ)足培養(yǎng)基，按稀釋比例轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中，于上述培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)〔12〕。

1.2.2四氮唑鹽(MTT)法確定ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs增殖的最佳濃度 將生長(zhǎng)良好的VSMCs以低血清培養(yǎng)基饑餓12 h后，使用正常血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板，每孔100 μl，待細(xì)胞貼壁后分別給予10、25、50、100、200 μg/ml的ox-LDL干預(yù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(CON組)，給予等量的無(wú)血清培養(yǎng)基。收集各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞(培養(yǎng)0 h，24 h，48 h，72 h，96 h)加入MTT溶液，每孔分別加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩，分別于溶解后的24 h、48 h、72 h時(shí)置于酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔吸光度值(OD)。

1.2.3細(xì)胞分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分組及處理如下：①正常對(duì)照(CON)組，②模型(MOD組，25 μg/ml ox-LDL)，③ICA 10 μmol/L組(25 μg/ml ox-LDL)，④ICA 20 μmol/L組(25 μg/ml ox-LDL)，⑤ICA 40 μmol/L 組(25 μg/ml ox-LDL)。

1.2.4MTT法檢測(cè)ICA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs增殖的作用 將生長(zhǎng)良好的VSMCs以低血清培養(yǎng)基饑餓12h后，用正常血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)〔12〕，實(shí)驗(yàn)分組見(jiàn)1.2.3，各給藥組分別給予相應(yīng)濃度的ICA干預(yù)，CON組和MOD組給予等量的無(wú)血清培養(yǎng)基。0.5 h后，MOD組及各給藥組給予ox-LDL至終濃度為25 μg/ml，CON組給予等量的無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞加入MTT溶液。MTT實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)1.2.2。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ICA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs遷移的影響 實(shí)驗(yàn)分組參見(jiàn)1.2.3，實(shí)驗(yàn)方法：將生長(zhǎng)良好的VSMCs以無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，在6孔板背面每隔1 cm畫(huà)上一條直線，每個(gè)孔加入100 μl，即每孔細(xì)胞為1×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿后，用200 μl槍頭垂直于線制造細(xì)胞劃痕，吸掉舊培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS沖洗細(xì)胞3次，再加入無(wú)血清培養(yǎng)基，各實(shí)驗(yàn)組按實(shí)驗(yàn)方法加入相應(yīng)藥物。將6孔培養(yǎng)板置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。選擇24和48 h拍照，使用ImageJ進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。

1.2.6qPCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)情況 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及處理參照1.2.3。細(xì)胞復(fù)蘇1 w后將生長(zhǎng)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs，以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以PBS清洗細(xì)胞，將VSMCs刮下并收集，總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行qPCR，方法參見(jiàn)1.1.5。為保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，每次實(shí)驗(yàn)做3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.7Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 蛋白樣品定量試劑見(jiàn)表1。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及處理參見(jiàn)1.2.3。方法如下：(1)總蛋白提?。喊? ml裂解液加10 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)(100 mmol/L)和10 μl混合物〔乙二胺四乙酸(EDTA)，100×二甲基亞砜(DMSO)儲(chǔ)液〕，搖勻置于冰上，收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，將裂解液加入細(xì)胞中，在冰上吹打混勻裂解30 min，4℃條件下離心10 min，取上清并進(jìn)行蛋白定量。(2)蛋白樣品定量：①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)備96孔板，按照下表加入試劑；配制BCA工作液；每孔加入200 μl BCA工作液，37℃避光孵育30 min；用酶標(biāo)儀讀取560 nm的吸光度值。②樣品檢測(cè)：稀釋待測(cè)樣品至合適濃度，使樣品稀釋液總體積為20 μl，加入BCA工作液200 μl充分混勻，37℃避光孵育30 min，用酶標(biāo)儀讀取560 nm的吸光度值，由已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值得到樣品的蛋白含量。(3)SDS-PAGE方法同1.1.6。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析及LSD-t檢驗(yàn)。

表1 各孔蛋白樣品定量實(shí)驗(yàn)試劑

2 結(jié) 果

2.1整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1各組血脂水平 MOD組血清TC、TG、LDL-C和ox-LDL含量明顯高于CON組(P<0.001)，HDL-C含量顯著低于CON組(P<0.001)。與MOD組比較，SIM組及ICA-L、-H組血清TC、TG、LDL-C和ox-LDL含量均明顯下降(P<0.001)，HDL-C水平均顯著升高(P<0.05或P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2 各組血清脂質(zhì)

與CON組比較：1)P<0.001;與MOD組比較：2)P<0.01,3)P<0.001

2.1.2主動(dòng)脈HE染色結(jié)果 CON組主動(dòng)脈組織內(nèi)膜、中膜和外膜分界清楚，內(nèi)皮細(xì)胞排列有序完整，中膜可見(jiàn)梭形平滑肌細(xì)胞，彈力纖維層結(jié)構(gòu)清晰完整，外膜為疏松結(jié)締組織；MOD組主動(dòng)脈內(nèi)膜及中膜層見(jiàn)平滑肌細(xì)胞增殖及少量泡沫樣細(xì)胞，彈力纖維變性、斷裂和崩解，中膜萎縮；ICA-L、-H組內(nèi)膜下見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、平滑肌細(xì)胞輕度增殖，泡沫樣細(xì)胞少見(jiàn)，AS病理改變較MOD組有不同程度的減輕，以SIM和ICA-H組上述改善最明顯。見(jiàn)圖1。

2.1.3基因芯片檢測(cè)及生物信息學(xué)分析結(jié)果 對(duì)基因芯片分析發(fā)現(xiàn)53個(gè)差異表達(dá)miRNAs，通過(guò)對(duì)miRNAs同源性比較，篩選出人與小鼠同源性良好的、差異表達(dá)更顯著的目標(biāo)miRNA，即miR-205-5p。在基因芯片miRNAs差異表達(dá)譜聚類圖中，miR-205-5p位列差異表達(dá)上調(diào)的第1位，前10位上調(diào)差異表達(dá)miRNAs見(jiàn)表3。

通過(guò)KEGG及target scan找到靶基因，取交集，然后David分析進(jìn)行富集，再通過(guò)富集程度找到可能的目的基因——蛋白激酶Cα(PRKCA)，構(gòu)建miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)如圖2。通過(guò)構(gòu)建信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，確定p38為靶基因PRKCA的下游信號(hào)分子(圖3)，因此構(gòu)建出miR-205-5p/PRKCA/p38信號(hào)通路。

表3 miRNA數(shù)據(jù)集上調(diào)差異表達(dá)前10位基因

登記號(hào)基因號(hào)差異倍數(shù)P值MIMAT0000238mmu-miR-205-5p45.723 968 800.026 764 868MIMAT0000236mmu-miR-203-3p18.901 274 500.005 816 500MIMAT0001537mmu-miR-429-3p9.095 330 370.028 541 938MIMAT0000212mmu-miR-183-5p8.871 045 240.011 745 582MIMAT0000519mmu-miR-200a-3p6.761 404 830.045 266 507MIMAT0000140mmu-miR-128-3p4.488 462 580.002 425 582MIMAT0004545mmu-miR-200b-5p3.543 857 690.025 400 297MIMAT0003475mmu-miR-146b-5p3.179 383 900.022 357 791MIMAT0000672mmu-miR-199b-5p3.143 073 040.010 533 375MIMAT0017281mmu-miR-511-3p3.028 066 260.001 391 541

深灰色節(jié)點(diǎn)，miR-205-5p；淺灰色節(jié)點(diǎn)，miR-205-5p的靶mRNA,節(jié)點(diǎn)之間通過(guò)線連接。*所選靶mRNA圖2 miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

2.1.4ICA對(duì)ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈miR-205-5p及PRKCA mRNA表達(dá)的影響 與CON組(1.067±0.04、1.005±0.13)對(duì)比，MOD組miR-205-5p表達(dá)(0.283±0.03)明顯降低(P<0.05)，PRKCA mRNA表達(dá)(1.736±0.43)明顯升高(P<0.05)；與MOD組相比，ICA-L、-H組miR-205-5p表達(dá)(2.632±0.31、5.288±0.90)明顯上調(diào)(P<0.001)，PRKCA mRNA表達(dá)(1.446±0.18、0.612±0.10)明顯下降(P<0.01或P<0.001)，且miR-205-5p及PRKCA mRNA的變化與ICA的劑量改變具有明顯量效關(guān)系。

2.1.5ICA對(duì)ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈PRKCA蛋白表達(dá)及p38蛋白磷酸化的影響 與CON組(1.00±0.085、1.00±0.103)相比，MOD組PRKCA蛋白表達(dá)(1.61±0.009)明顯升高(P<0.001)，p38蛋白磷酸化(1.82±0.052)明顯增加(P<0.001)；與MOD組相比，ICA-L、-H組PRKCA蛋白表達(dá)(1.28±0.012、0.91±0.003)明顯降低(P<0.001)，p38蛋白磷酸化(1.47±0.017、0.53±0.008)明顯減少(P<0.001)，且具有量效關(guān)系。見(jiàn)圖4。

深灰色節(jié)點(diǎn)，靶基因PRKCA上調(diào)；淺灰色節(jié)點(diǎn)，下調(diào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,節(jié)點(diǎn)之間通過(guò)線連接。*與PRKCA級(jí)聯(lián)的信號(hào)通路分子圖3 與PRKCA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

圖4 各組胸主動(dòng)脈PRKCA蛋白表達(dá)及p38蛋白磷酸化

2.2體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs增殖最佳濃度的確定 10、25、50、100、200 μg/ml CON組、ox-LDL組VSMCs相對(duì)細(xì)胞活性為100.0%±1.2%、127.7%±1.0%、160.0%±3.5%、144.0%±5.3%、125.0%±8.1%和100.1%±3.5%。與CON組相比，當(dāng)ox-LDL濃度在10～100 μg/ml時(shí)VSMCs的增殖能力明顯增強(qiáng)，當(dāng)ox-LDL濃度為25 μg/ml對(duì)VSMCs的增殖能力作用最強(qiáng)(P<0.01)，而隨著ox-LDL濃度增加到200 μg/ml，ox-LDL促進(jìn)VSMCs增殖能力反而降低。故選擇25 μg/ml ox-LDL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。

2.2.2ICA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs增殖的抑制作用 CON組、MOD組、ICA 10、20、40 μmol/L組VSMCs相對(duì)細(xì)胞活性為100.0%±3.3%、165.7%±1.6%、125.5%±5.4%、101.4%±2.1%、100.8%±2.6%。與CON組相比，MOD組ox-LDL對(duì)VSMCs有明顯的增殖作用(P<0.001)；與MOD組相比，ICA 3個(gè)濃度組均顯著抑制VSMCs的增殖(P<0.001)。

2.2.3ICA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs遷移的影響 CON組、MOD組、ICA 10、20、40 μmol/L組VSMCs遷移率分別為培養(yǎng)24 h，(7.1±0.10)%、(22.3±2.17)%、(13.2±1.75)%、(7.6±0.12)%、(7.1±0.09)%；培養(yǎng)48 h，(13.9±0.08)%、(45.1±1.20)%、(33.8±1.75)%、(14.7±0.21)%、(14.1±0.24)%。培養(yǎng)24 h和48 h，MOD組細(xì)胞遷移均較CON組明顯增加(P<0.01)，與MOD組相比，ICA 3個(gè)濃度組細(xì)胞遷移均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

2.2.4ICA對(duì)ox-LDL刺激VSMCs miR-205-5p及PRKCA mRNA表達(dá)的影響 與CON組(1.063±0.06、1.006±0.15)相比，MOD組細(xì)胞miR-205-5p表達(dá)水平(0.339±0.06)顯著降低(P<0.05)，PRKCA mRNA表達(dá)(2.178±0.37)顯著升高(P<0.01)；與MOD組相比，ICA 10、20、40 μmol/L組細(xì)胞miR-205-5p表達(dá)(2.744±0.45、4.843±0.35、4.103±0.05)均顯著升高(P<0.01，P<0.001)，ICA 10、20、40 μmol/L組細(xì)胞PRKCA mRNA表達(dá)(1.445±0.17、0.905±0.29、1.152±0.16)均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

1～5：CON組、MOD組、ICA 10 μmol/L組、ICA 20 μmol/L組、ICA 40 μmol/L組，下圖同圖5 各組VSMCs遷移能力

2.2.5ICA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)VSMCs PRKCA蛋白表達(dá)及p38蛋白磷酸化的影響 與CON組(1.00±0.099、1.00±0.008)相比，MOD組VSMCs PRKCA蛋白表達(dá)(1.31±0.012)顯著升高(P<0.001)，p38蛋白磷酸化(2.24±0.102)顯著升高(P<0.01)；與MOD組相比，ICA 10、20、40 μmol/L組VSMCs PRKCA蛋白表達(dá)(0.91±0.015、0.42±0.009、0.56±0.015)和p38蛋白磷酸化水平(0.89±0.011、0.43±0.018、0.68±0.025)顯著降低(P<0.001)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組VSMCs PRKCA和p-p38蛋白表達(dá)

3 討 論

AS是動(dòng)脈壁對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的一種慢性炎癥反應(yīng)，病變的機(jī)制包括脂蛋白氧化修飾、單核巨噬細(xì)胞與動(dòng)脈壁細(xì)胞成分之間的相互作用，病變進(jìn)展的核心因素包括內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥因子的釋放、平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移等〔13～15〕。

構(gòu)建AS模型的方法很多，但大部分是基于AS的發(fā)病機(jī)制。如根據(jù)脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)，建立了高脂飼料喂養(yǎng)法；根據(jù)損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)，建立機(jī)械損傷法等。因高脂飼料喂飼法復(fù)制的AS模型較接近人類病變，使用率較高。相比于非ApoE-/-的健康小鼠，ApoE-/-小鼠AS風(fēng)險(xiǎn)更高，尤其是在高脂飲食喂飼的情況下，可以在短期內(nèi)構(gòu)建AS模型，因而該模型得到廣泛應(yīng)用〔16,17〕。本研究結(jié)果表明，以HFD喂飼ApoE-/-小鼠在12 w內(nèi)可以成功構(gòu)建小鼠AS動(dòng)物模型，與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔11，13，16〕。

ICA可通過(guò)抑制氧化損傷和趨化作用等生物學(xué)進(jìn)程，達(dá)到延緩AS進(jìn)展的作用〔17～19〕。沈曉君等〔20〕證實(shí)，ICA可通過(guò)抑制核因子(NF)-κB的活性進(jìn)而抑制兔主動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。馬一君等〔21〕證實(shí)ICA可顯著抑制兔VSMCs增殖及凋亡作用。

miRNA在AS的發(fā)生發(fā)展起重要作用〔22,23〕。蔣子平〔24〕發(fā)現(xiàn)，miR-200a/Keap1/Nrf2抗氧化信號(hào)通路與糖尿病導(dǎo)致的AS有著密切聯(lián)系。王明輝〔25〕報(bào)道，miRNA-361-5p在AS中與血管重構(gòu)有關(guān)。miRNA miR-29b在調(diào)節(jié)VSMCs功能中發(fā)揮重要作用，而VSMCs增殖遷移與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔26〕。

生物信息學(xué)分析廣泛用于確定目的基因〔20,24〕。miRNA在DE基因的代表性譜中有顯著差異，通過(guò)使用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)GO可以分析特定基因的主要功能進(jìn)而揭示基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并將基因組織作為分層類別。根據(jù)KEGG及target scan路徑分析可以定位DE基因的重要途徑〔27〕，取DE基因交集然后采用David分析進(jìn)行富集，再通過(guò)富集程度找到目的基因，通過(guò)構(gòu)建全基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)以證明基因之間的相互作用。PRKCA是PKC家族的成員，PRKCA的上調(diào)在幾種類型的癌癥中被發(fā)現(xiàn)并可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖，存活和轉(zhuǎn)移，PRKCA的表達(dá)升高與肺腺癌相關(guān)，肺腺癌患者中較高的PRKCA表達(dá)與較低的累積總生存率相關(guān)〔28〕，研究表明PRKCA上調(diào)受miR-203調(diào)節(jié)〔29〕。p38絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與AS的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系。蘇紹紅等〔30〕研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷對(duì)AS大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α/p38 MAPK/NF-κB/視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)4信號(hào)通路具有影響，孫曉旭等〔31〕報(bào)道Urantide可降低AS大鼠動(dòng)脈p38 MAPK表達(dá)。已有實(shí)驗(yàn)表明，在小鼠肺腺癌模型中，PRKCA-/-小鼠在體外和體內(nèi)腫瘤中均顯示出支氣管肺泡干細(xì)胞(BASCs)中的磷酸化p38 MAPK降低〔32〕，即PRKCA表達(dá)減少可能導(dǎo)致p38蛋白磷酸化減少。本研究結(jié)果表明miR-205-5p/PRKCA/p38信號(hào)通路在ICA抑制AS的發(fā)生發(fā)展中起介導(dǎo)作用。

綜上，ICA具有抗AS作用，其機(jī)制可能是通過(guò)提高miR-205-5p mRNA表達(dá)，下調(diào)PRKCA mRNA及蛋白表達(dá)，進(jìn)而減少p38蛋白磷酸化，并抑制VSMCs增殖與遷移，發(fā)揮其抗AS的作用。