田歡，楊麗萍，單春會(huì)，蔡文超，楊明君，唐鳳仙

(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000)

紅提葡萄(red globe grape)又名紅地球、晚紅，歐亞種；紅提葡萄含有大量的植物化學(xué)物質(zhì)，包括酚類、黃酮類、花色苷及白藜蘆醇，因其表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，所以對健康非常有益[1,2]。

醋因其具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病等功能特性而備受歡迎[3]。醋不僅是食品調(diào)味料的一種成分，也是飲料配方的主要成分。果醋是以新鮮水果或果品加工下腳料為主要原料通過連續(xù)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵生產(chǎn)得到的一種酸性液體產(chǎn)品[4,5]。Coelho等[6]對不同水果濃縮物制醋的抗氧化活性和揮發(fā)性成分進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)這些水果醋擁有較高的抗氧化活性。目前市場上已有和已研究的果醋有蘋果醋、番茄醋、柿子醋和紅棗醋等[7]，但大多都沒有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，而且果醋的品種比較單一，果醋生產(chǎn)過程不夠業(yè)和細(xì)致，造成果醋的營養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值沒有得到完全體現(xiàn)。

本研究利用功能性成分和抗氧化活性的測定方法，并結(jié)合主成分分析，對紅提葡萄不同發(fā)酵階段產(chǎn)品的功能性成分和抗氧化活性進(jìn)行對比分析，為紅提葡萄的深加工利用提供參考，對未來食品加工與調(diào)味品行業(yè)發(fā)展具有重要的理論價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅提葡萄采摘自新疆石河子市的一個(gè)農(nóng)場，采摘時(shí)紅提葡萄完全成熟，由人工采摘選取無病蟲害的放置于保鮮袋里，于-20 ℃下冷藏。醋酸菌由石河子大學(xué)食品學(xué)院果蔬加工實(shí)驗(yàn)室保藏。

檸檬酸、檸檬酸鈉(食品級)：西安沐森生物工程有限公司；果膠酶、抗壞血酸、偏重亞硫酸鉀：北京索寶生物科技有限公司；釀酒活性干酵母：安琪酵母(伊犁)有限公司。

DPPH、ABTS、蘆丁：上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸：成都市科龍化工試劑廠；鹽酸、三氯乙酸、三氯化鐵、亞硝酸鈉、過硫酸鉀、水楊酸、鐵氰化鉀：天津運(yùn)盛化學(xué)品有限公司；碳酸鈉、無水乙酸鈉：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、硫酸亞鐵、30%過氧化氫、硝酸鋁：武漢荊隆化工有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；福林酚：上海麥克林生化科技有限公司；總抗氧化試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；以上所采購的藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MC202231手持折光儀 四川成都泰華光學(xué)有限公司；Multifuge X1R離心機(jī) 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；JP-1000B-2高速多功能粉碎機(jī) 浙江久品工貿(mào)有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；酒精計(jì)(規(guī)格為0～40) 新疆宏道儀器科技有限公司；LDZX-30KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；THZ-98恒溫?fù)u床 上海百典儀器設(shè)備有限公司；XB3200C分析天平 上海天平儀器廠；ZXSR-1430恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；WD-2102A酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.3 紅提原汁的制備

稱取定量的紅提葡萄清洗晾干，然后用破碎機(jī)進(jìn)行榨汁破碎即得紅提原汁。

1.4 紅提果酒的制備

對紅提原汁添加0.08%抗壞血酸、0.03%果膠酶和0.006%偏重亞硫酸鉀；隨后進(jìn)行成分調(diào)整，使用白砂糖調(diào)整其糖度為24 °Bx，使用檸檬酸鈉調(diào)整其pH值至4.0；成分調(diào)整完成后添加0.03%釀酒活性干酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵，22 ℃下發(fā)酵5 d；發(fā)酵完成后殺菌過濾，即得酒精度為8.6%的紅提果酒。

1.5 紅提果醋的制備

對紅提果酒接種5%經(jīng)過馴化培養(yǎng)的醋酸菌，然后在35 ℃、160 r/min的恒溫?fù)u床下發(fā)酵10 d得到醋酸含量為6.65 g/dL的紅提果醋。

1.6 理化指標(biāo)測定

總糖測定：采用直接滴定法[8]；總酸含量(以檸檬酸計(jì))：采用酸堿滴定法。

1.7 功能性成分的測定

1.7.1 維生素C

采用2,6-二氯靛酚法[9]。取適量樣品溶液用2%草酸溶液定容至100 mL，過濾備用。取5 mL濾液于用標(biāo)定的2,6-二氯靛酚溶液滴定至微粉色不褪色。同時(shí)用蒸餾水做空白試驗(yàn)。維生素C含量按下式計(jì)算：

維生素C含量(mg/100 g)=[(V-V0)/m]×T×100。

式中：V為滴定樣品溶液時(shí)消耗染料體積；V0為空白時(shí)消耗染料體積；m為樣品質(zhì)量；T為1 mL染料相當(dāng)于抗壞血酸溶液的量。

1.7.2 總酚含量

采用福林酚法，取0.8 mL樣品上清液加蒸餾水至10 mL，加入1 mL福林酚，混合均勻避光保存5 min后，加入2 mL 12%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至25 mL。室溫避光保存90 min，測定765 nm波長吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總酚含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品建立擬合回歸方程為Y=75.371X+0.0175，相關(guān)系數(shù)R2=0.9947?？偡雍恳詻]食子酸含量計(jì)。

1.7.3 總黃酮含量

取0.5 mL樣品溶液加入0.15 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻靜置6 min；然后加入0.15 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻靜置6 min；再加入2 mL 4%氫氧化鈉溶液；蒸餾水定容至5 mL，混勻靜置3 min。測定508 nm波長吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為標(biāo)準(zhǔn)品建立擬合回歸方程Y=16.892X-0.0119，相關(guān)系數(shù)R2=0.9962?？傸S酮含量以蘆丁含量計(jì)。

1.7.4 總花色苷含量

采用pH示差法[10]，取2.5 mL樣品，分別用pH 1的氯化鉀-鹽酸緩沖液和pH 4.5的乙酸鈉-鹽酸緩沖液定容至10 mL；避光靜置90 min。測定525 nm和700 nm波長處的吸光度。

花色苷含量按下式計(jì)算：

A=pH 1(A525-A700)-pH 4.5(A525-A700)。

C=[(A×MW)/(ε×I)]×DF×100。

式中：C為樣品中總花色苷含量，mg/dL；MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量449.2；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)26900；I為比色皿光程；DF為稀釋因子。

1.8 抗氧化活性的測定

1.8.1 總抗氧化能力

總抗氧化能力采用FRAP法[11]，取5 μL樣品溶液與180 μL FRAP工作液混合，于37 ℃孵育5 min。測定593 nm波長處的吸光度值。以硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液建立擬合回歸方程為Y=0.1949X-0.0073，相關(guān)系數(shù)R2=0.9934?？偪寡趸芰σ粤蛩醽嗚F含量表示。

1.8.2 DPPH自由基清除能力

取3支試管，第一支試管加入1 mL 0.2 mmol/L的DPPH工作液與1 mL樣品溶液；第二支試管加入1 mL無水乙醇與1 mL樣品溶液；第三支試管加入1 mL 0.2 mmol/L的DPPH工作液與1 mL無水乙醇。振搖，避光靜置30 min，取上清液于517 nm波長測定吸光度[12]。DPPH自由基清除率按下式計(jì)算：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中：A1為第一支試管的吸光度值；A2為第二支試管的吸光度值；A3為第三支試管的吸光度值。

1.8.3 ABTS+自由基清除能力

取3支試管，第一支試管加入0.8 mL ABTS+工作液與0.2 mL樣品溶液；第二支試管加入0.8 mL無水乙醇與0.2 mL樣品溶液；第三支試管加入0.8 mL ABTS+工作液與0.2 mL無水乙醇。振搖后靜置6 min，取上清液在波長734 nm處測定吸光度[13]。ABTS+自由基清除率按下式計(jì)算：

ABTS+自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中：A1為第一支試管的吸光度值；A2為第二支試管的吸光度值；A3為第三支試管的吸光度值。

1.8.4 羥自由基清除能力

取3支試管，第一支試管依次加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液，1 mL樣品溶液，1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液，1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液；第二支試管依次加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液，1 mL樣品溶液，1 mL蒸餾水，1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液；第三支試管依次加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液，1 mL蒸餾水，1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液，1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液?；旌暇鶆蚝笕∩锨逡号c于510 nm處測定吸光度[14]。羥自由基清除率按下式計(jì)算：

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中：A1為第一支試管的吸光度值；A2為第二支試管的吸光度值；A3為第三支試管的吸光度值。

1.8.5 還原能力

取1支試管，依次加入1 mL樣品溶液，0.2 mL pH 6.6的PBS緩沖液(0.2 mol/L)，0.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃恒溫放置20 min；加入1 mL 10%三氯乙酸，4000 r/min離心10 min；取1.5 mL上清液加入0.2 mL 1%的三氯化鐵溶液，3 mL蒸餾水；混勻靜置5 min。測定700 nm波長處的吸光度值[15]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

每項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)至少平行測定3次，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 9.0 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)測定結(jié)果

圖1 紅提原汁、果酒和果醋中總糖和總酸的變化Fig.1 The changes of total sugar and total acid in red grape juice, fruit wine and fruit vinegar

由圖1可知，在紅提果汁至紅提果酒階段，總酸含量上升，這可能是由于發(fā)酵時(shí)期酵母菌發(fā)揮作用產(chǎn)生有機(jī)酸，導(dǎo)致總酸含量上升[16]，在紅提果酒至紅提果醋階段，總酸含量呈現(xiàn)上升的趨勢，可能是紅提果酒在醋酸發(fā)酵的過程中由于醋酸菌作用將乙醇氧化為乙酸，導(dǎo)致總酸含量上升[17]。在酒精發(fā)酵及醋酸發(fā)酵階段總糖含量呈現(xiàn)下降趨勢，這是因?yàn)榫凭l(fā)酵階段，糖是酵母菌生長繁殖必要營養(yǎng)物質(zhì)，酵母菌將糖轉(zhuǎn)換為乙醇從而導(dǎo)致總糖含量減少[18]，醋酸發(fā)酵階段，醋酸菌利用乙醇產(chǎn)乙酸，部分糖也會(huì)被利用產(chǎn)生乙酸[19]。

2.2 不同發(fā)酵階段的色度變化

圖2 紅提原汁、果酒和果醋色度的變化Fig.2 The changes of chromaticity of red grape juice, fruit wine and fruit vinegar

由圖2可知，發(fā)酵樣品的L*、a*、b*之間都存在著明顯的差異，說明在不同發(fā)酵階段，發(fā)酵液中的呈色物質(zhì)在發(fā)生著變化，而這種呈色物質(zhì)主要是花色苷、單寧和酚類物質(zhì)，其中L*和a*的變化是與花色苷含量密切相關(guān)的， L*和a*的這種變化可能是由于發(fā)酵液的花色苷含量變化所引起的，L*和a*的變化與花色苷之間呈負(fù)相關(guān)[20]；由圖中花色苷含量的變化趨勢也能證明此相關(guān)性。此外，酒精發(fā)酵階段發(fā)生呈色物質(zhì)的變化可能是由于酵母菌的作用導(dǎo)致發(fā)酵液中花色苷和酚類物質(zhì)的變化；醋酸發(fā)酵過程中，由于醋酸菌為好氧菌，發(fā)酵過程中需要不斷的通入氧氣，而醋液中含有許多單寧和酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)被氧化導(dǎo)致紅提果醋的a*增加。

2.3 不同發(fā)酵階段的功能性成分變化

圖3 紅提原汁、果酒和果醋功能成分特征雷達(dá)圖Fig.3 The radar chart of functional components of red grape juice, fruit wine and fruit vinegar

注：TAC表示總花色苷，TFC表示總黃酮，TPC表示總酚，VC表示維生素C。

由圖3可知，VC含量的變化為紅提果酒>紅提原汁>紅提果醋，TAC含量的變化為紅提原汁>紅提果酒>紅提果醋，TPC含量的變化為紅提果醋>紅提果酒>紅提原汁，TFC含量的變化為紅提果醋>紅提原汁>紅提果酒；在酒精發(fā)酵階段TAC含量出現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于酒精發(fā)酵對花色苷產(chǎn)生影響，在酒精發(fā)酵前期酵母菌處于增值階段，這時(shí)葡萄皮中的花色苷浸出物較多，在發(fā)酵后期酵母菌消耗糖類產(chǎn)生乙醇，同時(shí)酵母菌自身也會(huì)產(chǎn)生代謝物，這種酵母代謝物與花色苷相互作用導(dǎo)致花色苷含量發(fā)生變化[21]，在醋酸發(fā)酵階段TFC與TPC含量上升，VC與TAC含量下降，這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中TFC、TPC不斷地水解浸出導(dǎo)致含量升高，而VC是熱敏性活性成分，酒精發(fā)酵結(jié)束殺菌作用導(dǎo)致VC分解，且VC與TAC均有光敏性，在醋酸發(fā)酵過程中也在分解損失，導(dǎo)致VC與TAC含量減少。

2.4 不同發(fā)酵階段的抗氧化能力

表1 紅提原汁、果酒和果醋的抗氧化活性Table 1 The antioxidant activities of red grape juice, fruit wine, fruit vinegar

注：TAOC為總抗氧化能力，·OH為羥自由基清除率，RP為還原能力。

由表1可知，TAOC、ABTS+自由基清除能力、·OH自由基清除率及RP隨著發(fā)酵程度的深入都表現(xiàn)為上升趨勢，其中TAOC、·OH、RP變化趨勢都表現(xiàn)出較顯著的差異性(P<0.05)，且都隨發(fā)酵程度的深入表現(xiàn)出增高的趨勢，ABTS+自由基清除率變化趨勢無明顯差異(P>0.05)，DPPH自由基清除率在發(fā)酵不同階段略有所下降，但依然有很高的清除能力。

2.5 功能性成分與抗氧化能力的相關(guān)性分析

圖4 紅提原汁、果酒和果醋功能成分及抗氧化性主成分分析圖Fig.4 The principal component analysis diagrams of functional components and antioxidant activities of red grape juice, fruit wine, fruit vinegar

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用PCA揭示不同加工階段中產(chǎn)品品質(zhì)、功能性成分及抗氧化能力的變化。圖4中(a)、(b)分別為因子載荷圖和因子得分圖。通過PCA發(fā)現(xiàn)，不同加工階段的紅提果醋整體信息主要集中在前兩個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.93%，其中第一主成分(PC1)的方差貢獻(xiàn)率為68.44%，第二主成分(PC2)的方差貢獻(xiàn)率為18.49%。

由圖4 中(a)可知，PC1主要由DPPH、TAC、ABTS+及TA等10個(gè)指標(biāo)構(gòu)成，PC2主要由VC、L*等4個(gè)指標(biāo)構(gòu)成。其中PC1指標(biāo)主要分布在第二象限， TPC與RP等指標(biāo)在空間排布上較近，形成了聚類，代表它們之間存在著正相關(guān)關(guān)系；TA與TS指標(biāo)在空間排布上距離最遠(yuǎn)，說明它們之間存在著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

由圖4中(b)可知，果汁樣品分布在第三象限，果酒分布在第一象限，果醋分布在第四象限，說明酵母菌與醋酸菌的發(fā)酵對產(chǎn)品理化指標(biāo)、功能性成分以及抗氧化能力有著明顯的影響。結(jié)合圖4中(a)可得，果汁TAC指標(biāo)高，果酒VC指標(biāo)高，果醋TFC指標(biāo)高，這與2.3分析結(jié)果一致。另外，從空間排布上來看，相較于果汁，果酒和果醋樣品呈現(xiàn)出更為明顯的分離趨勢，說明酵母菌與醋酸菌的發(fā)酵賦予了產(chǎn)品更豐富的品質(zhì)變化。

由圖4中(a)的因子載荷圖可知，紅提原汁、果酒、果醋分布在不同的區(qū)域，說明在紅提發(fā)酵的不同階段之間的功能成分含量及抗氧化能力相差較大。在圖4中(a)分析基礎(chǔ)上，對3個(gè)樣品的功能成分與抗氧化性進(jìn)行進(jìn)一步分析得到圖4中(b)。

由圖4中(b)可知，PCA模型中PC1(68.44%)和PC2(18.49%)累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.93%，能夠反映大部分信息。由圖4中(b)和圖4中(a)可知，紅提原汁附近主要聚集了TS、a*、b*、TAC、DPPH；紅提果酒附近聚集了L*、VC；紅提果醋附近聚集了ABTS+、·OH、TAOC、RP、TPC、TFC及TA，這說明紅提果醋整體抗氧化能力>紅提原汁>紅提果酒，與之前的分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究通過功能性成分和抗氧化活性的測定，結(jié)合主成分分析，對紅提原汁、果酒及果醋的相關(guān)指標(biāo)差異分析可知：紅提葡萄在不同的發(fā)酵階段的功能性成分具有很大的差異，紅提原汁的維生素C 的含量較高，紅提果酒的花色苷含量較高，紅提果醋的總酚和總黃酮的含量較高，造成這種差異主要是由于不同菌種的作用所導(dǎo)致的；抗氧化活性方面紅提果醋比紅提果汁和果酒的較高。

本研究對紅提葡萄的不同發(fā)酵階段進(jìn)行了對比分析，確定不同發(fā)酵階段產(chǎn)品之間的相關(guān)性差異分析，為紅提葡萄相關(guān)產(chǎn)品的成分分析提供了參考，同時(shí)為其深加工利用提供了依據(jù)。對食品原料不同加工階段的品質(zhì)變化提供了理論依據(jù)。