李宛澤, 劉 洋, 張艷華, 劉金亮, 潘洪玉, 張祥輝

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院, 吉林 吉林 132001； 2.吉林大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012)

玉米大斑病(northern corn leaf blight)是玉米主要的真菌病害之一, 影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì).非核糖體肽合成酶基因6(StNPS6基因)是編碼非核糖體肽合成酶家族(NRPS)基因中的一員, 其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 是絲狀真菌胞外鐵載體生物合成酶的關(guān)鍵基因.NPS6基因在玉米小斑病菌、水稻胡麻葉斑病菌、禾谷鐮孢菌以及鏈格孢菌中均與致病力有關(guān): Lee等[1]對(duì)玉米小斑病菌中的12個(gè)NPS基因進(jìn)行了敲除分析, 結(jié)果表明, 僅NPS6基因與致病力相關(guān), 且對(duì)H2O2敏感性增加; 在柑橘病原菌鏈格孢菌中,NPS6基因缺失影響鏈格孢菌鐵載體的產(chǎn)生和致病力[2]; 將稻瘟菌一個(gè)編碼NRPS的基因SSM2敲除后, 可導(dǎo)致稻瘟菌不能產(chǎn)生任何鐵載體、菌絲生長(zhǎng)速率變慢及分生孢子產(chǎn)生數(shù)量變少, 且對(duì)氧脅迫更敏感[3].

為明確StNPS6基因在玉米大斑病菌中的作用, 本文構(gòu)建玉米大斑病菌T-DNA插入突變體庫(kù), 獲得StNPS6基因敲除突變體, 并利用蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析對(duì)StNPS6基因相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析, 為了解StNPS6基因與玉米大斑病菌致病力的關(guān)系提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

用固體或液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PD或PDA)培養(yǎng)玉米大斑病菌野生型菌株St28A及轉(zhuǎn)化突變體菌株.用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基培養(yǎng)農(nóng)桿菌AGL-1.

1.2 方 法

1.2.1 構(gòu)建玉米大斑病菌T-DNA插入突變體庫(kù) 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行玉米大斑病菌轉(zhuǎn)化.先用熱激法將質(zhì)粒pBI-G3C轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株AGL-1中, 將含有pBI-G3C的農(nóng)桿菌AGL-1在添加卡那霉素(50 μg/mL)的基本(MM)培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)36 h.再用誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋農(nóng)桿菌菌懸液, 并加入卡那霉素和乙酰丁香酮, 28 ℃震蕩培養(yǎng)6 h后, 與玉米大斑病菌孢子懸浮液(106個(gè)/mL)混合.取400 μL混合液涂在鋪有纖維素膜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上, 28 ℃培養(yǎng)48 h后, 將纖維素膜轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)的培養(yǎng)基上.7 d后, 將候選轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到新的含有潮霉素的肉湯(CM)培養(yǎng)基上, 并進(jìn)行單孢分離.通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)hph基因?qū)蜻x轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定.

1.2.2 篩選致病力下降轉(zhuǎn)化子 對(duì)具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行致病力測(cè)定.將10 μL無(wú)菌水配制的孢子懸浮液(105個(gè)/mL)滴在玉米葉片上(品種： 先玉335), 7 d后觀察發(fā)病情況.每次接種3個(gè)葉片, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.3 T-DNA插入位置分析 根據(jù)T-DNA序列設(shè)計(jì)TAIL-PCR特異性引物, 三對(duì)特異性引物分別為

LB1: CTTGGTTGACGGCAATTTCGATGAT;

LB2: ATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTC;

LB3: CGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTA;

RB1: CTTACAATTTCCATTCGCCATTCAG;

RB2: ATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTA;

RB3: TGACTCCCTTAATTCTCCGCTCAT.

簡(jiǎn)并引物為

AD1: TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA;

AD2: (A/T)AGTGNAG(A/T)ANCANAGA.

TAIL-PCR反應(yīng)程序和反應(yīng)參數(shù)參考文獻(xiàn)[4].通過(guò)玉米大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.jgi-psf.org/Settu1/Settu1.home.html)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)做BlastN算法比對(duì), 進(jìn)行核苷酸同源性搜索, 確定插入位點(diǎn).

1.2.4 目的基因敲除與突變體驗(yàn)證 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化敲除玉米大斑病菌StNPS6基因[5].設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增StNPS6基因上下游各800 bp的片段, 并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化.將上下游片段構(gòu)建到入門載體pOSCAR上, 并進(jìn)行驗(yàn)證, 將驗(yàn)證正確的載體命名為pOSCARNPS6.先用熱激法將pOSCARNPS6轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL-1中, 再將含有質(zhì)粒pOSCARNPS6的AGL-1轉(zhuǎn)化為玉米大斑病菌, 并用PCR方法對(duì)具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證.

1.2.5 熒光定量分析 為進(jìn)一步鑒定StNPS6基因的表達(dá)量, 分別從培養(yǎng)5 d的野生型和突變體菌絲中提取RNA, 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 用ABI7500熒光定量PCR儀測(cè)定StNPS6基因的表達(dá)量, 用2-ΔCt方法分析數(shù)據(jù), 以Tub2和GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因.

1.2.6 RNA提取 收集在添加2,2-聯(lián)吡啶的MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的野生型與突變體菌絲, 液氮迅速冷凍后, 用RNA提取試劑盒提取RNA.用Nanodrop檢測(cè)RNA的純度和濃度.最后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA, 由北京百邁克公司進(jìn)行基因測(cè)序.

1.2.7 菌絲蛋白質(zhì)提取 用TCA-丙酮法提取野生型玉米大斑病菌與突變體菌絲的蛋白質(zhì), 并進(jìn)行定量分析.稱取約1 g菌絲于液氮中研磨.將粉末轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中, 加入500 μL TCA-丙酮溶液, 充分混合后于-20 ℃沉淀過(guò)夜, 并于4 ℃, 20 000 r/min離心30 min, 棄上清液, 向沉淀中加入等體積的冷丙酮(含體積分?jǐn)?shù)為0.07%的β-巰基乙醇), 充分混勻, 于4 ℃, 20 000 r/min離心15 min, 棄上清液, 室溫干燥5 min, 加入300 μL裂解液, 室溫溶解30 min, 保存?zhèn)溆?

1.2.8 蛋白質(zhì)雙向電泳 每個(gè)樣品取200 μg進(jìn)行雙向電泳分析, 第一向電泳選擇17 cm、pH3-10的非線性IPG膠條進(jìn)行等點(diǎn)聚焦, 其程序?yàn)?0 V 12 h,500 V 1 h,1 000 V 1 h,10 000 V 1 h,10 000 V 11 h.第二向電泳在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS-PAGE分離膠進(jìn)行.電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色， 將所得2-DE凝膠圖像用PDquest 8.0軟件分析.篩選差異表達(dá)量在2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行下一步分析.

1.2.9 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定 用MALDI-TOF-TOF/MS/MS分析差異蛋白質(zhì)點(diǎn).用Mascot 2.3軟件分析質(zhì)譜結(jié)果, 并與NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)以及玉米大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://genome.jgi.doe.gov/Settu3/Settu3.home.html)進(jìn)行比對(duì), 對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定.

1.2.10 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)去除接頭序列和低質(zhì)量序列, 用TopHat v2.0.12 軟件將所得序列與玉米大斑病菌基因組序列(http://genome.jgi-psf.org/Settu1/Settu1.home.html)進(jìn)行對(duì)比.用FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)方法計(jì)算基因表達(dá)水平.以FDR≤0.001, 且表達(dá)量≥2倍為標(biāo)準(zhǔn)確定差異表達(dá)基因.將篩選獲得的差異基因進(jìn)行GO(gene ontology)功能注釋和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 致病力下降突變體相關(guān)基因的鑒定

以1×106個(gè)/mL的分生孢子濃度進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化, 潮霉素為抗性篩選標(biāo)記, 建立玉米大斑病菌的突變體庫(kù).通過(guò)提取玉米大斑病菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA以及PCR方法證明帶有hph抗性標(biāo)記的T-DNA片段是否插入到玉米大斑病菌基因組內(nèi).對(duì)獲得的約2 000個(gè)T-DNA插入突變體進(jìn)行致病力分析, 結(jié)果如圖1所示.由圖1可見(jiàn), 與野生型相比, 9株突變體菌株的致病力明顯下降, 其中突變體AMT69的致病力下降最明顯.通過(guò)分析T-DNA側(cè)翼序列, 并與玉米大斑病菌基因組進(jìn)行比對(duì), 確定T-DNA在AMT69突變體中的插入位點(diǎn)為非核糖體肽合成酶6基因(StNPS6).

圖1 轉(zhuǎn)化子致病力檢測(cè)Fig.1 Detection of pathogenicity of transformants

2.2 StNPS6敲除突變體的驗(yàn)證

用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)玉米大斑病菌中的StNPS6基因進(jìn)行敲除.通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證, 獲得3株StNPS6基因敲除突變體(Δnps6), 結(jié)果如圖2所示.

WT為野生型菌株； 1,2,3為突變體菌株.圖2 StNPS6基因突變體PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification results of StNPS6 gene mutants

2.3 StNPS6基因?qū)χ虏×Φ挠绊?/h3>

圖3 野生型菌株和突變體菌株致病力差異比較Fig.3 Comparison of pathogenicity between wild type and mutant strains

為驗(yàn)證StNPS6基因敲除后對(duì)致病力的影響, 對(duì)生長(zhǎng)14 d的玉米葉片進(jìn)行接種, 7 d后觀察, 結(jié)果如圖3所示.由圖3可見(jiàn), 與野生型相比, T-DNA插入突變體與StNPS6敲除突變體的致病力均明顯下降, 表明StNPS6基因?qū)τ衩状蟀卟【闹虏×τ绊戄^大.

2.4 差異蛋白質(zhì)鑒定

為明確StNPS6基因敲除后對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響, 用雙向電泳對(duì)野生型和StNPS6基因敲除突變體進(jìn)行分析, 用MALDI-TOF-TOF/MS/MS鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Mascot(http://www.MatrixScience.com)分析.第一次選取在突變體中差異表達(dá)變化最顯著的30個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn), 其中8個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá), 22個(gè)下調(diào)表達(dá), 結(jié)果列于表1.與轉(zhuǎn)錄組差異分析比較, 在30個(gè)鑒定的蛋白質(zhì)中, 下調(diào)表達(dá)蛋白占比大于70%, 主要原因可能是StNPS6為次生代謝產(chǎn)物合成基因, 當(dāng)其缺失后, 下游相關(guān)基因表達(dá)受到抑制, 導(dǎo)致下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)占比較大.

表1 差異蛋白鑒定結(jié)果

續(xù)表1

2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)分析

將野生型玉米大斑病菌及StNPS6基因突變體菌株轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的reads與玉米大斑病菌基因組進(jìn)行比對(duì), 共有1.71×108個(gè)reads比對(duì)到參考基因組上, 約占總有效reads的80%(總有效reads共2.14×108個(gè)).其中, 80.82%比對(duì)到外顯子區(qū), 1.41%比對(duì)到內(nèi)含子區(qū), 17.77%比對(duì)到轉(zhuǎn)錄間隔區(qū).

2.6 差異表達(dá)基因與功能注釋

圖4 差異表達(dá)基因的GO聚類分析結(jié)果Fig.4 Cluster analysis results of GO of differently expressed genes

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后的基因注釋及表達(dá)量分析, 共得到野生型菌株與突變體菌株差異表達(dá)基因1 767個(gè), 其中上調(diào)表達(dá)基因903個(gè), 下調(diào)表達(dá)基因864個(gè).差異表達(dá)基因的GO富集聚類分析結(jié)果如圖4所示, 共涉及50種生物功能, 其中生物學(xué)過(guò)程21個(gè), 細(xì)胞組分14個(gè), 分子功能15個(gè).生物學(xué)過(guò)程主要包括代謝過(guò)程(25.8%)、細(xì)胞進(jìn)程(23.7%)和單個(gè)體進(jìn)程(19.0%); 細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞(22.7%)、細(xì)胞器(15.9%)和細(xì)胞組分(24.5%); 分子功能主要包括催化活性(47.7%)和結(jié)合(38.8%).對(duì)1 767個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集聚類分析, 結(jié)果如圖5所示.由圖5可見(jiàn), 342個(gè)差異表達(dá)基因比對(duì)到4條大的信號(hào)通路上.其中, 最主要的信號(hào)通路為代謝和遺傳信息過(guò)程, 各占45.6%, 細(xì)胞過(guò)程和環(huán)境信息過(guò)程分別占7%和1.8%.將342個(gè)差異表達(dá)基因比對(duì)到50個(gè)信號(hào)途徑上, 主要包括剪接體(27)、真核生物核糖體生物源(25)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(22)、核糖體(17)、嘧啶代謝(16)和嘌呤代謝(15).

圖5 差異表達(dá)基因的KEGG聚類分析結(jié)果Fig.5 Cluster analysis results of KEGG of differently expressed genes

用GO組分注釋、GO功能注釋和GO過(guò)程注釋對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行劃分, 結(jié)果分別列于表2～表4.

表2 差異表達(dá)基因的GO組分注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由表2～表4可見(jiàn), 某些差異表達(dá)基因在GO功能注釋中明顯上調(diào)表達(dá), 如三磷酸腺苷結(jié)合、金屬離子結(jié)合和運(yùn)轉(zhuǎn)活性等.在氧化還原酶活性和鐵離子結(jié)合中的差異表達(dá)基因大多數(shù)呈下調(diào)表達(dá).此外, 在逆境響應(yīng)、氧化還原進(jìn)程、致病力與寄主相互作用中的某些基因呈下調(diào)表達(dá), 這可能與StNPS6突變體的致病力下降有關(guān).其中, 與鐵同化及鐵氧化還原相關(guān)基因(基因68、基因2749、基因4360和基因10397)呈明顯下調(diào)表達(dá).這些基因與鐵吸收和同化密切相關(guān), 并間接影響致病力.在較多植物病原真菌中, 鐵元素在病原菌的生長(zhǎng)及致病力中具有重要作用[6].此外, 基因669被鑒定為三磷酸腺苷結(jié)合運(yùn)轉(zhuǎn)子(ABC運(yùn)轉(zhuǎn)子), 在突變體中下調(diào)表達(dá)11倍.研究表明， ABC 運(yùn)轉(zhuǎn)子在植物病原真菌中對(duì)殺菌劑的抗性及植物病原真菌的致病力均有影響.如在稻瘟菌中, 3個(gè)ABC運(yùn)轉(zhuǎn)子(MoABC5,MoABC6,MoABC7)對(duì)稻瘟菌致病力及非生物脅迫耐受力以及孢子產(chǎn)生均有顯著影響[7].在灰霉病菌中, ABC運(yùn)轉(zhuǎn)子基因突變體的致病力明顯下降[8].

表4 差異表達(dá)基因的GO過(guò)程注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果