張泓欣, 艾菊, 羅威, 高冬麗

(云南師范大學(xué) 云南省馬鈴薯生物學(xué)重點實驗室，云南 昆明 650500)

果實形狀是重要的外觀品質(zhì)和育種目標(biāo).作為研究果實形狀的模式作物，番茄具有圓形、橢圓形和梨形等多樣性的果實形狀.番茄的果實發(fā)育分為四個主要時期：坐果期、細(xì)胞分裂期、細(xì)胞體積擴展期和成熟期[1]，其中細(xì)胞分裂主要是通過有絲分裂來實現(xiàn)的.目前已經(jīng)克隆調(diào)控番茄果形的多個基因，其中OVATE和sov1(suppressor of ovate)均屬于OFP(Ouate Family Protein)家族基因[2-3].

OFP調(diào)節(jié)了植物生長和發(fā)育的很多方面.目前報道的OFP蛋白的功能包括調(diào)節(jié)果實和種子形狀[2-4]、參與調(diào)節(jié)次生細(xì)胞壁的形成[5]、參與維管束的形成[6]、參與脅迫響應(yīng)[7]以及參與激素信號途徑等[8].OFP20是調(diào)控番茄果實和馬鈴薯塊莖形狀的調(diào)控因子[3].通過酵母雙雜發(fā)現(xiàn)，SlOFP20與TONNEAU1 Recruiting Motif(TRM)家族的多個蛋白互作[3].TRM、TON1以及以FASS/TON2蛋白作為調(diào)節(jié)亞基的PP2A全酶組成了復(fù)合體[9].該復(fù)合體參與有絲分裂早前期分裂帶的形成過程，在空間上控制細(xì)胞的分裂位置，其中TRM蛋白負(fù)責(zé)將PP2A定位在微管上，TON1對于復(fù)合體的組裝起輔助作用，F(xiàn)ASS/TON2參與底物選擇及細(xì)胞定位[10].在擬南芥中，TRM家族有34個成員，但其功能可能不同.對AtTRM1的研究表明，AtTRM1的C端能夠與TON1相互作用，并將TON1定位在微管上[11].

鑒于OFP20能夠與TRM互作，而TRM又能與TON蛋白互作，那么OFP20是否有可能與TON互作仍舊是一個未知的問題.在前期研究中，我們通過圖位克隆獲得了StOFP20的序列，本研究明確了StOFP20及家族其他成員的表達模式，并利用擬南芥的TON蛋白找到了番茄和馬鈴薯的TON同源蛋白，進一步通過酵母雙雜驗證了TON是否與OFP20有互作關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 基因的表達分析

在http://bar.utoronto.ca/efp_potato/cgi-bin/efpWeb.cgi網(wǎng)站上獲得除StOFP外其他OFP基因的表達模式,單位是每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的reads(Fragments Per Kilobase Million，F(xiàn)PKM) .因為StOFP20在DM中是缺失的，因此沒有從該網(wǎng)站上獲得其表達模式.根據(jù)實驗室已有的RH89-039-16的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得StOFP20在各組織的表達模式，單位是每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的Transcripts (Transcripts Per Kilobase Million,TPM).

1.2 基因克隆

以擬南芥中TON1和FASS/TON2的蛋白序列為query，在https://solgenomics.net網(wǎng)站上進行蛋白序列比對，比對參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，在基因序列號后的括號內(nèi)表明了與query的相似度.基因的擴增采用 GXL 高保真酶(Takara),擴增引物見表1.

表1 酵母雙雜交所用引物

1.3 進化樹分析

序列多重比對和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分別采用ClustaW和Mega7.進化樹構(gòu)建采用Neighbor-joining方法，自展值設(shè)置為1 000，其他參數(shù)均為默認(rèn)參數(shù).

1.4 酵母雙雜交

分別以151高代植株的cDNA和番茄的cDNA進行PCR擴增，引物序列如表1所示.采用EcoRI和BamHI對pGBKT7和pGADT7進行雙酶切，對StOFP20也進行酶切，使用T4連接酶連接，其余的基因通過IN-fusion連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株，對得到的單克隆進行聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)(PCR)鑒定，送至昆明擎科生物進行測序.對所得的測序結(jié)果使用DNAMAN8軟件進行分析.

使用聚乙二醇/醋酸鋰(PEG/LiAc)法轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold菌株.實驗組為pGBKT7-StOFP20和pGADT7-AD-StTON1,pGBKT7-SlOFP20和pGADT7-AD-TRM5，pGADT7-AD-SlTON1，pGADT7-AD-SlTON2，pGADT7-AD-SlTON3，以pGADT7+ pGBKT7-53共轉(zhuǎn)化作正對照，以pGADT7和pGBKT7-Lam共轉(zhuǎn)化作負(fù)對照.為了檢測誘餌蛋白基因的自激活活性，以pGBKT7-StOFP20、 pGBKT7-SlOFP20載體與pGADT7-AD空載體共轉(zhuǎn)化.將轉(zhuǎn)化后的酵母分別取100 μL和200 μL涂布在SD-Leu-Trp(二缺)和SD-Leu-Trp-His(三缺)平板培養(yǎng)基上，放置30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d.如果在SD-Leu-Trp-His三缺平板上有菌落，挑取單菌落至YPDA+ABA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)約24 h，取2 μL菌液并分別劃在SD-Leu-Trp-His+ABA平板培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，相機拍照后記錄結(jié)果.實驗重復(fù)2次.

2 研究結(jié)果

2.1 StOFP20的表達分析

RH89-039-16是一個二倍體馬鈴薯材料，其基因組和轉(zhuǎn)錄組均可在馬鈴薯的公共數(shù)據(jù)庫中查詢得到,但是由于StOFP20在DM中是缺失的，所以該基因在DM和RH89-039-1的公共數(shù)據(jù)庫中都查詢不到.根據(jù)實驗室已有的RH89-039-16轉(zhuǎn)錄組，獲得了StOFP20的表達模式(圖1).StOFP20在根、莖、葉、花、匍匐莖及薯塊中都有表達，其中在花藥中的表達量最高.此外，由于OFP成員廣泛參與植物的生長發(fā)育，因此也調(diào)查了其他成員的表達模式.Liu等的文章中提供了25個含有OVATE結(jié)構(gòu)域的基因序列號[12]，其中有2個序列號是基因的不同轉(zhuǎn)錄本，去掉這2個序列號，對剩下的23個基因在根、葉、花、匍匐莖、早期薯塊及成熟薯塊的表達量進行了分析(圖2).結(jié)果表明，大部分基因的表達量都較低，其中有4個基因在各個組織的FPKM值均為0，部分基因傾向于在個別組織高表達，如PGSC0003DMT400011286在根中高表達，PGSC0003DMT400050511在葉中高表達，PGSC0003DMT400033048在花中高表達，PGSC0003DMT400042334 和PGSC0003DMT400072347在匍匐莖中高表達.

圖1StOFP20的表達模式 圖2 二倍體馬鈴薯RH89-039-16中OFP成員的表達模式

Fig.1 The expression pattern ofStOFP20 Fig.2 The expression pattern ofOFPgene family members in diploid potato material RH89-039-16

2.2 馬鈴薯和番茄TON基因的克隆

圖3 四個物種中TON蛋白的聚類分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TON proteins in four species

擬南芥中有3個TON基因，分別是TON1A(At3g55000)、TON1B(At3g55000)和TON2(At5g18580).通過在Sol Genomics Network搜索，在番茄中找到5個同源基因，分別為Solyc04g049710(70.23%)、Solyc04g009550(68.58%)、Solyc01g067500(91.67%)、Solyc04g010070(26.06%)和Solyc05g054980(24.86%)，其中后兩個基因的同源性低，沒有進行后續(xù)分析.在馬鈴薯中找到一個同源基因Sotub04g009490(69.73%).玉米中TON的同源基因add1和dcd1功能已經(jīng)明確[13].對擬南芥、馬鈴薯、番茄和玉米中的TON蛋白進行聚類(圖3)，可分為TON1和TON2兩類.根據(jù)聚類結(jié)果，分別將Solyc04g049710、Solyc04g009550、Solyc01g067500和Sotub04g009490命名為SlTON1A、SlTON1B、SlTON2和StTON1.

2.3 酵母雙雜交

Wu等的研究表明，SlOFP20與SlTRM5互作[3].研究以這2個互作蛋白為對照，驗證OFP20與TON的互作關(guān)系.實驗結(jié)果表明，SlOFP20與SlTRM5能夠在SD-Leu-Trp-His+ABA平板上生長，即SlOFP20與SlTRM5互作，但SlOFP20與SlTON1A、SlTON1B、SlTON2共轉(zhuǎn)化后均不能在SD-Leu-Trp-His平板上生長，StOFP20與StTON1共轉(zhuǎn)化后也不能在三缺板上生長，說明在番茄和馬鈴薯中，OFP20與鑒定出的TON基因沒有互作關(guān)系(圖4).

A為SlOFP20與SlTRM5的共轉(zhuǎn)化;B為SlOFP20與 SlTON1A的共轉(zhuǎn)化,其中左圖為共轉(zhuǎn)化在二缺板上的生長，右圖為共轉(zhuǎn)化在三缺板上的生長.OFP20與其他TON蛋白的共轉(zhuǎn)化情況與B圖類似，沒有展示

圖4 OFP20與TON的酵母雙雜交

Fig.4 Yeast two-hybrid assay between OFP20 and TON

3 討 論

OFP20不僅調(diào)控番茄果實形狀，同時也是馬鈴薯塊莖形狀的調(diào)控因子，因此解析OFP20的調(diào)控機理具有非常重要的意義.在番茄中，SlOFP20在各個組織都有表達，在梨形果實植株中的表達高于圓形果實植株中的表達[3].不同于SlOFP20表達量的差異，StOFP20在圓形薯形的植株中能夠擴增，在長形薯形的植株中缺失[3].StOFP20在各組織都表達，與SlOFP20的表達模式一致(圖1).馬鈴薯OFP家族的其他成員表達水平存在著不同的轉(zhuǎn)錄表達形式，暗示著OFP基因可能具有不同的功能(圖2).

TRM與TON組成的復(fù)合體調(diào)控細(xì)胞的分裂位置.擬南芥TRM基因過表達后導(dǎo)致葉片、花器官及角果均變長[14].擬南芥TON突變后導(dǎo)致幼苗發(fā)育不良，細(xì)胞伸長異常，該表型主要是由于早期分裂帶消失造成的[9]. 對SlOFP20突變體的子房進行細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)子房的細(xì)胞數(shù)量發(fā)生了變化，可能是由于子房發(fā)育過程中細(xì)胞分裂異常導(dǎo)致的.由于SlOFP20與TRM互作時會發(fā)生定位轉(zhuǎn)移，因此，Wu等推測OFP-TRM蛋白復(fù)合體在細(xì)胞質(zhì)和微管的動態(tài)定位調(diào)控了細(xì)胞分裂，進而影響了番茄果實形狀[3].本研究發(fā)現(xiàn)OFP20與TON沒有互作，暗示著TON不參與SlOFP20-TRM復(fù)合體的形成以及該復(fù)合體對果實形狀或塊莖形狀的調(diào)控.

馬鈴薯塊莖的發(fā)育受赤霉素和細(xì)胞分離素等多種激素的調(diào)控[15]，同時OFP蛋白參與激素信號途徑也得到證實.Xiao等發(fā)現(xiàn)OsOFP1參與油菜素內(nèi)酯的信號途徑[8].Wang等利用染色質(zhì)沉淀發(fā)現(xiàn)AtGA20ox1受AtOFP1的直接調(diào)控，AtGA20ox1是赤霉素合成的一個關(guān)鍵基因[16].因此StOFP20是否也通過激素信號途徑調(diào)控薯形還需進一步研究.