段思凡， 唐飛， 楊慧芹， 楊玉玲， 馬玲

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,馬鈴薯科學(xué)研究院，云南 昆明 650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界上繼水稻和小麥后的第三大糧食作物[1-2].馬鈴薯塊莖中淀粉含量在植物淀粉中位居第二位[3]，淀粉是構(gòu)成馬鈴薯塊莖干物質(zhì)的主要成分.馬鈴薯淀粉具有粉質(zhì)白凈、黏度高、糊化溫度低及支鏈淀粉含量高等特點(diǎn)[4]，因此目前市場上馬鈴薯淀粉的消費(fèi)量僅次于玉米淀粉[5]，被廣泛應(yīng)用于食品、化工、紡織、醫(yī)藥和飼料等行業(yè)，具有巨大的商業(yè)價(jià)值[6].我國馬鈴薯加工業(yè)中存在淀粉提取率低和品質(zhì)不良等方面的不足，制約了我國馬鈴薯淀粉加工業(yè)的發(fā)展.

關(guān)于植物淀粉的提取方法國內(nèi)外已有相應(yīng)的報(bào)道，主要的提取方法有酸液浸泡法[7]、表面活性劑法、酶提法[4,8-9]、超聲波輔助提取[10]、水提法[11-12]和堿提法[13-14]等.許力等[15]研究了實(shí)驗(yàn)室馬鈴薯淀粉提取工藝及其影響因素，王國扣[16]研究了影響馬鈴薯淀粉提取率的主要因素，認(rèn)為淀粉提取率不僅與工藝條件有關(guān)，而且與馬鈴薯淀粉含量有關(guān)；陳立勝等[17]研究了粉碎方法對淀粉提取率的影響.

以上提取方法主要針對傳統(tǒng)四倍體栽培種馬鈴薯，二倍體馬鈴薯與四倍體馬鈴薯相比，其淀粉含量、直鏈淀粉含量及淀粉顆粒特性等方面均存在明顯差異.已有的淀粉提取方法在提取二倍體馬鈴薯淀粉時存在成本高且效率低等弊端.為了探索二倍體馬鈴薯淀粉的提取工藝，參考文獻(xiàn)方法[18-20]，對乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉工藝條件及淀粉顆粒進(jìn)行了研究，以期縮減大批量淀粉提取測定的時間與工作量，為在淀粉工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從國際馬鈴薯中心引入的二倍體馬鈴薯材料C系列編號的組培苗，擴(kuò)繁后，于2019年3月種植于云南省昆明市尋甸縣六哨鄉(xiāng)，7月收獲薯塊.從中挑選無病害、無發(fā)芽且無腐爛的新鮮薯塊用于優(yōu)化二倍體馬鈴薯的淀粉提取工藝；馬鈴薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品S11003(上海源葉生物科技有限公司)，碘化鉀(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，碘(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，氫氧化鉀(上海埃彼化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，95%乙醇(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)(coolsafe 110-4型,丹麥Labogene公司)，酶標(biāo)儀(VersaMax型,Molecular Devices公司)，pH計(jì)(S220-K型,上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)，磁力攪拌器(MYP11-2型,上海右一儀器有限公司)，電子分析天平(JD200-3型,沈陽龍騰電子有限公司)，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS-bx43f型,南京貝登電子商務(wù)有限公司)，組織破碎儀(DS-1型,上海右一儀器有限公司)，榨汁機(jī)(WJE2802D型,Midea公司).

1.3 方法

1.3.1 乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉

按照新鮮二倍體馬鈴薯→清洗→破碎→汁渣分離→乙醇沉降→干燥→淀粉成品的技術(shù)流程，進(jìn)行二倍體馬鈴薯淀粉的提取.具體的操作如下：將二倍體馬鈴薯鮮薯洗凈削皮切塊混勻后稱重，記錄.利用組織破碎儀對塊莖進(jìn)行頻率為50 Hz的組織破碎5 min，塊莖初步破碎后轉(zhuǎn)入榨汁機(jī)進(jìn)行汁渣分離處理，收集汁液.所得的粗渣用50 mL蒸餾水進(jìn)行2遍濾洗得到濾洗液.將濾洗液和收集的汁液進(jìn)行混合，得到淀粉粗提液.調(diào)節(jié)淀粉粗提液的pH至6.0，靜置10 min后加入95%乙醇加速淀粉沉淀.棄上清液，沉淀即為淀粉，濕淀粉用20 mL蒸餾水進(jìn)行洗滌，共洗滌三次，棄洗液.洗滌完后將淀粉沉淀置于-80 ℃冰箱12 h后，對濕淀粉進(jìn)行冷凍干燥處理48 h，獲得淀粉制品.

1.3.2 乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉單因素試驗(yàn)

鮮薯重量、乙醇終濃度和蒸餾水洗滌次數(shù)影響了二倍體馬鈴薯淀粉的提取率.對鮮薯重量、乙醇終濃度和蒸餾水洗滌次數(shù)分別設(shè)置三個參數(shù)，按照1.3.1中列出的二倍體馬鈴薯淀粉提取方法，分別確定淀粉提取率的最佳參數(shù).

1.3.3 淀粉提取正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)確定上述三個因素的最佳參數(shù)后，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行3因素3水平L9正交試驗(yàn).見表1，確定乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉的最佳工藝參數(shù).

根據(jù)二倍體馬鈴薯淀粉性質(zhì)與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇終濃度(A)、鮮薯重量(B)和洗滌次數(shù)(C)三個因素，分別設(shè)立三個水平，利用L9正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取二倍體馬鈴薯淀粉的工藝參數(shù).

表1 L9因素水平

1.3.4 直鏈淀粉含量的測定

采用雙波長比色法測定直鏈淀粉含量[18,21-24].

樣品直鏈淀粉含量的測定：稱取樣品0.100 0 g至50 mL離心管中，加入10 mL 0.5 mol/L KOH，沸水浴20 min混勻反應(yīng)，雙蒸水50 mL進(jìn)行定容.吸取定容后的樣品液2.5 mL至新的50 mL離心管中，加入雙蒸水25 mL混勻，0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.5，加入0.5 mL的碘—碘化鉀，雙蒸水定容至50 mL刻度線.定容后的混合液常溫靜置25 min(三次重復(fù)).每一個編號取反應(yīng)液250 μL重復(fù)于96孔微型板中，進(jìn)行雙波長535～570 nm的測定(三次重復(fù)求平均值)，利用公式計(jì)算出直鏈淀粉含量的百分比.

W：直鏈淀粉含量/%；M為樣品質(zhì)量/g；X為淀粉含水量/g；10為單位換算系數(shù)，A570nm為570 nm波長處混合液的吸光度值，A535nm為534 nm波長處混合液的吸光度值.

1.3.5 淀粉顆粒的觀察

利用光學(xué)顯微鏡對與碘-碘化鉀結(jié)合的淀粉顆粒進(jìn)行形態(tài)大小觀察.將二倍體馬鈴薯淀粉樣品0.1 g與1 mL雙蒸水混合調(diào)成淀粉乳，取一滴淀粉乳滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于光學(xué)顯微鏡的載物臺，選擇適宜的光亮度，在10×的目鏡及20×和40×的物鏡下進(jìn)行觀察并拍照.

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0和Excel進(jìn)行處理及分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對二倍體馬鈴薯淀粉提取率的影響

2.1.1 乙醇終濃度對二倍體馬鈴薯淀粉提取率的影響

為確定乙醇終濃度對淀粉提取率的影響，稱取50 g去皮清洗干凈的新鮮二倍體馬鈴薯薯塊按1.3.1的提取工藝進(jìn)行提取.將蒸餾水洗滌次數(shù)設(shè)置為3次,分別計(jì)算不同乙醇終濃度條件下，二倍體馬鈴薯淀粉提取率的變化，結(jié)果見圖1.可以看出隨著淀粉粗提取液中乙醇終濃度的增加，淀粉提取率增高，但是超過30%后，淀粉提取率快速降低，乙醇終濃度為30%時，獲得的淀粉提取率較高.

圖1 不同乙醇終濃度對淀粉提取率的影響

2.1.2 鮮薯重量對二倍體馬鈴薯淀粉提取率的影響

為了確定鮮薯重量對淀粉提取率的影響，在乙醇終濃度為30%，蒸餾水洗滌次數(shù)設(shè)置為3次的前提下，考察鮮薯重量分別為30、40 g和50 g時，二倍體馬鈴薯淀粉提取率的變化.結(jié)果見圖2，二倍體馬鈴薯淀粉的提取率隨著薯塊鮮重的減少，緩慢降低，當(dāng)二倍體馬鈴薯鮮重為50 g時，淀粉的提取率最高.

圖2 不同鮮薯重對淀粉提取率的影響

Fig.2 Influence of different fresh potato weights on starch yield

2.1.3 淀粉洗滌次數(shù)對二倍體馬鈴薯淀粉提取率的影響

為了確定蒸餾水洗滌次數(shù)對淀粉提取率的影響，在鮮薯重量為50 g，乙醇終濃度為30%的前提下，考察不同洗滌次數(shù)對淀粉提取率的影響.如圖3所示，隨著蒸餾水洗滌次數(shù)的增高，淀粉提取率顯著降低，因此為了獲得最高的二倍體馬鈴薯淀粉提取率，蒸餾水的洗滌次數(shù)應(yīng)為3次.

圖3 不同洗滌次數(shù)對淀粉提取率的影響

Fig.3 Influence of different washing times on starch yield

2.2 二倍體馬鈴薯淀粉提取工藝影響因素的優(yōu)化研究

為了確定乙醇終濃度、鮮薯重量和蒸餾水洗滌次數(shù)這三個因素之間對二倍體馬鈴薯淀粉提取率是否存在相互影響，并確定乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉的最適提取參數(shù)，設(shè)計(jì)了三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示.其中A因素代表乙醇終濃度，分別設(shè)置為20%、30%和50%；B因素代表用于提取淀粉的鮮薯重量，設(shè)置30、40 g和50 g三個參數(shù)；C因素代表淀粉提取過程中，蒸餾水的洗滌次數(shù)，分別設(shè)置3、4次和5次.通過對淀粉提取率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果評價(jià)，得出淀粉提取率的最佳條件組合為A2B2C1.即乙醇終濃度為30%，鮮薯重為50 g，洗滌次數(shù)為3次時，二倍體馬鈴薯淀粉提取率為10.94%.從極差R的大小可見，各因素對淀粉提取的影響作用順序?yàn)橐掖冀K濃度>洗滌次數(shù)>鮮薯重量.

表2 正交實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

從表3可知，乙醇終濃度的F=396.94，P=0.003<0.01，差異極顯著；鮮重的F=75.43，P=0.013<0.05，差異顯著；洗滌次數(shù)的F=89.07，P=0.011<0.05，差異顯著.F檢驗(yàn)結(jié)果表明，二倍體馬鈴薯淀粉在提取過程中，乙醇終濃度、鮮重及洗滌次數(shù)三個因素均對二倍體馬鈴薯淀粉提取率有顯著影響.

表3 淀粉提取率方差分析

a:R2= 0.998

2.3 馬鈴薯淀粉顆粒形態(tài)與大小

不同馬鈴薯的淀粉顆粒形態(tài)差異可通過染色后在光學(xué)顯微鏡下清晰辨別.馬鈴薯淀粉顆粒形態(tài)上大多數(shù)為橢圓形，大小范圍在20～100 μm[25-26].不同植物來源的淀粉顆粒因其遺傳性和生長環(huán)境條件的差異而具有不同的大小、形狀(球形、橢圓形、多面體和不規(guī)則形)及粒徑分布[27].

在光學(xué)顯微鏡下，觀察四倍體和二倍體馬鈴薯的淀粉顆粒，如圖4所示，淀粉顆粒經(jīng)碘-碘化鉀染液染色后呈藍(lán)紫色，二倍體馬鈴薯的淀粉顆粒相比于四倍體，其顆粒分布更為松散，直徑較小，且不規(guī)則形狀的淀粉顆粒比例增高.

A:200×放大倍數(shù)下四倍體馬鈴薯淀粉顆粒;B:200×放大倍數(shù)下二倍體馬鈴薯淀粉顆粒;C:400×放大倍數(shù)下四倍體馬鈴薯淀粉顆粒;D:400×放大倍數(shù)下二倍體馬鈴薯淀粉顆粒

圖4 光學(xué)顯微鏡下淀粉顆粒的形態(tài)與大小

Fig.4 Morphology and size of starch granules under optical microscope

3 討 論

馬鈴薯淀粉深加工產(chǎn)品的開發(fā)是提高馬鈴薯在產(chǎn)業(yè)鏈中價(jià)值的重要環(huán)節(jié)，建立有效的淀粉提取工藝對于發(fā)展馬鈴薯淀粉產(chǎn)業(yè)至關(guān)重要.對馬鈴薯淀粉提取工藝的研究一直是工業(yè)研究的熱點(diǎn)，王大為[10]、許力[15]及陳立勝[17]等人研究了馬鈴薯淀粉的提取工藝及其影響因素，但未對提取到的馬鈴薯淀粉顆粒形態(tài)做進(jìn)一步觀察.淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)形態(tài)是研究淀粉加工性能的基礎(chǔ)，淀粉顆粒的差異影響著淀粉的加工[28].因此，提高淀粉提取效率的同時也要注重觀察淀粉顆粒的形態(tài)變化.傳統(tǒng)的馬鈴薯淀粉提取工藝主要針對四倍體馬鈴薯，且易造成淀粉顆粒形態(tài)發(fā)生改變.研究采用乙醇沉淀法進(jìn)行二倍體馬鈴薯淀粉的提取，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9確定乙醇沉淀法的三個工藝參數(shù)(乙醇終濃度、鮮薯重量和洗滌次數(shù))的最優(yōu)條件組合.采用乙醇沉淀法提取的淀粉顆粒經(jīng)碘染后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒的形態(tài)正常，無破損，說明乙醇沉淀法具有穩(wěn)定淀粉顆粒形態(tài)的優(yōu)點(diǎn).

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合具有代表性的9組試驗(yàn)進(jìn)行分析，得出乙醇沉淀法提取二倍體馬鈴薯淀粉的最佳工藝參數(shù)組合為：乙醇終濃度為30%，鮮薯重為50 g，洗滌次數(shù)為3次.乙醇終濃度的高低對淀粉提取率影響較大.適宜的乙醇終濃度能夠提高二倍體馬鈴薯淀粉的提取效率，材料重量對淀粉提取率具有一定的影響；利用碘-碘化鉀染色法對不同倍性馬鈴薯顆粒進(jìn)行觀察，淀粉顆粒形態(tài)正常無破損，二倍體馬鈴薯淀粉顆粒與四倍體馬鈴薯淀粉顆粒相比直徑較小.

綜上所述，研究篩選出了適合二倍體馬鈴薯淀粉提取的最適乙醇終濃度、鮮薯重量及洗滌次數(shù)，并發(fā)現(xiàn)二倍體馬鈴薯淀粉顆粒與四倍體的相比存在明顯區(qū)別，研究結(jié)果可為針對二倍體馬鈴薯淀粉的生物學(xué)研究提供有益參考.