李棟玉，時(shí)有明*，劉 剛

1. 曲靖師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，云南 曲靖 655011 2. 云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院，云南 昆明 650500

引 言

土傳病害是玉米種植中常見的病害，也是影響玉米產(chǎn)量最嚴(yán)重的病害。玉米播種后，土壤中的致病真菌、細(xì)菌病原體在種子萌發(fā)時(shí)侵入玉米胚芽，最終對(duì)植株造成嚴(yán)重的影響[1]。為了解決土傳病蟲害對(duì)玉米種植的威脅，目前常采用玉米種子包衣技術(shù)來應(yīng)對(duì)。在播種前利用包衣劑農(nóng)藥涂于玉米種子表面，對(duì)種子進(jìn)行包裹。包衣劑通常由殺菌劑和殺蟲劑混合而成[2]。雖然包衣劑阻斷了病原體和害蟲對(duì)玉米種子的侵蝕，但是隨著玉米種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)，包衣劑將逐漸被玉米根系吸收，進(jìn)入玉米莖葉，造成農(nóng)藥在植株內(nèi)的殘留[3]。目前農(nóng)藥殘留的檢測(cè)主要通過對(duì)樣品進(jìn)行萃取后使用超高效液相色譜、質(zhì)譜等進(jìn)行分析。這些檢測(cè)方法需要對(duì)樣品進(jìn)行提取、凈化等復(fù)雜程序，耗時(shí)且檢測(cè)費(fèi)用高[4]。近年也有開展表面增強(qiáng)拉曼光譜在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的研究報(bào)道，檢測(cè)靈敏度高，但光譜測(cè)試時(shí)需制作金納米棒等增強(qiáng)基底，測(cè)試過程也顯得復(fù)雜[5]。使用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)定性檢測(cè)植物中某些農(nóng)藥殘留與色譜、質(zhì)譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜相比具有快速、便捷等優(yōu)點(diǎn)，測(cè)試時(shí)無需對(duì)樣品進(jìn)行特殊處理。Xiao等[6]利用FTIR成功鑒別1∶1 000稀釋后的毒死蜱農(nóng)藥在蘋果皮中的殘留。Sharma等[7]利用FTIR對(duì)重金屬污染的玉米幼苗進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)銅使得玉米幼苗的果膠、氨基酸等含量增加。Sharma等[8]利用FTIR對(duì)線蟲侵染的秋葵根進(jìn)行研究，得到淀粉、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化規(guī)律。FTIR研究植物樣品時(shí)無需對(duì)樣品進(jìn)行萃取等過程，在定性分析方面具有經(jīng)濟(jì)、快速和便捷等優(yōu)點(diǎn)。因此利用FTIR結(jié)合主成分分析鑒別殘留包衣劑農(nóng)藥的玉米幼苗。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品采集與測(cè)試

選用同一雜交玉米品種(樂玉1號(hào)，四川豐大種業(yè)有限公司)，經(jīng)過包衣劑包裹的玉米種子作為實(shí)驗(yàn)組，未進(jìn)行包衣劑包裹的玉米種子作為對(duì)照組。兩組玉米種子在相同土壤、氣候、濕度條件下播種，進(jìn)行平行對(duì)照試驗(yàn)。播種15天后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組玉米幼苗(整株含根部器官)各5株，此后每隔10 d收取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組整株玉米苗各5株。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別獲得生長(zhǎng)期為15, 25和35 d三個(gè)時(shí)間段的15株玉米幼苗樣品。玉米幼苗采集后清洗干凈，在27 ℃下進(jìn)行干燥處理。干燥后剪取每株玉米幼苗的胚根和下層葉片分別研磨為粉末，用電子天平按3∶300 mg比例稱量樣品粉末和溴化鉀混合，研磨均勻后壓片測(cè)試。測(cè)試的紅外光譜儀為美國Thermo Nicolet公司的Avatar FTIR 360光譜儀(掃描次數(shù)： 32次，分辨率： 2 cm-1，掃描范圍： 4 000～400 cm-1)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各自獲得葉片光譜15條和根光譜15條。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

光譜測(cè)試時(shí)通過差譜技術(shù)處理，扣除背景吸收光譜。采用Omnic 8.0軟件進(jìn)行吸光度歸一化處理和基線校正。實(shí)驗(yàn)組(對(duì)照組)在同一生長(zhǎng)期收獲的5株樣品相當(dāng)于5次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。使用SPSS 22.0軟件對(duì)玉米葉片(根)的5次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的光譜進(jìn)行偏相關(guān)分析，偏相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明5次重復(fù)測(cè)量的光譜幾乎一致，實(shí)驗(yàn)具有重復(fù)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素和玉米種子包衣劑農(nóng)藥的傅里葉變換紅外光譜特征

玉米葉片和根的主要成分是纖維素，它們的紅外光譜在特征區(qū)呈現(xiàn)出纖維素的強(qiáng)吸收。為了便于對(duì)比研究含與不含包衣劑殘留的葉、根的光譜，測(cè)試了纖維素和包衣劑農(nóng)藥的紅外光譜，見圖1。纖維素的光譜在3 348 cm-1附近出現(xiàn)羥

圖1 玉米種子包衣劑和纖維素的傅里葉變換紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of maize seed coating agent and cellulose

基的特征吸收峰，包衣劑農(nóng)藥的光譜則在3 437 cm-1附近出現(xiàn)以氨基為主的強(qiáng)吸收，該峰可能還含有羥基吸收的疊加。羥基和氨基的吸收峰差異明顯，羥基的吸收峰較寬，而氨基的吸收峰則較為尖銳[9]。3 000～2 800 cm-1范圍內(nèi)兩者的吸收帶主要是甲基和亞甲基的吸收疊加峰。在纖維素的光譜中，1 372 cm-1附近出現(xiàn)了C—H的彎曲振動(dòng)，但在包衣劑農(nóng)藥的光譜中C—H的彎曲振動(dòng)吸收出現(xiàn)在1 383 cm-1處[10]。纖維素最為明顯的特征峰出現(xiàn)在1 162，1 114，1 060和1 030 cm-1附近，主要源于C—O鍵的振動(dòng)吸收，并且這四個(gè)特征峰疊加后形成了纖維素特有的疊加帶峰形。

2.2 包衣劑農(nóng)藥在玉米根中殘留情況的傅里葉變換紅外光譜分析

經(jīng)過包衣劑包裹和未包裹的玉米種子種植后，三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的幼苗根的紅外光譜見圖2。三個(gè)生長(zhǎng)階段的對(duì)照組(種子未經(jīng)包衣劑包裹)和實(shí)驗(yàn)組(種子經(jīng)過包衣劑包裹)的6條光譜在3 404，2 922和1 732 cm-1附近的三個(gè)吸收峰的峰形基本一致，波數(shù)位置相互偏差小于3 cm-1。玉米根光譜中3 404 cm-1的吸收峰不僅包含了羥基的吸收峰，還包含了氨基的吸收峰。2 922 cm-1吸收峰來源于亞甲基的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收，1 732 cm-1附近的吸收峰來源于羰基[11]。1 200～800 cm-1范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的光譜均在1 157，1 103和1 050 cm-1附近出現(xiàn)纖維的特征吸收峰，峰形上呈現(xiàn)三級(jí)遞增形狀，與圖1中纖維素在該范圍內(nèi)的峰形一致。纖維素的紅外光譜中(見圖1)，在1 060和1 030 cm-1位置存在吸收峰，但在玉米根的紅外光譜中，這兩個(gè)吸收峰相互疊加，導(dǎo)致疊加峰的中心頻率移至1 050 cm-1。根的紅外光譜中低于900 cm-1的吸收帶較弱且疊加嚴(yán)重，不能直接分辨出特征峰。

圖2 種子經(jīng)過包衣劑包裹和未包裹的玉米幼苗根的紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of maize seedling rootswith and without coating agent

對(duì)比試驗(yàn)組和對(duì)照組玉米幼苗根的光譜，兩者最大的差異處于1 488～1 295 cm-1吸收帶(圖2陰影帶范圍)，無需對(duì)光譜進(jìn)行處理就可以明顯分辨出兩者的差異。在該范圍內(nèi)對(duì)照組的相對(duì)吸收強(qiáng)度比實(shí)驗(yàn)組弱。實(shí)驗(yàn)組在1 384 cm-1附近的吸收峰較為尖銳，從吸收帶的形狀上可區(qū)別于對(duì)照組。三個(gè)生長(zhǎng)階段，實(shí)驗(yàn)組在該范圍內(nèi)的吸收峰都出現(xiàn)在1 384 cm-1位置，而對(duì)照組分別出現(xiàn)在1 375，1 375和1 372 cm-1位置。在纖維素和包衣劑農(nóng)藥的紅外光譜中，纖維素C—H的彎曲振動(dòng)在1 375 cm-1，包衣劑農(nóng)藥C—H彎曲振動(dòng)在1 384 cm-1。通過對(duì)比可以確定實(shí)驗(yàn)組根的紅外光譜中1 384 cm-1尖銳的吸收峰是由于玉米包衣劑農(nóng)藥的殘留引起。該峰可以作為包衣劑農(nóng)藥殘留檢驗(yàn)的目標(biāo)對(duì)象。光譜經(jīng)過縱坐標(biāo)歸一化后，對(duì)照組1 375 cm-1吸收峰的相對(duì)強(qiáng)度隨著植株生長(zhǎng)有增強(qiáng)的趨勢(shì)，說明隨著植株生長(zhǎng)纖維素含量在增加。而實(shí)驗(yàn)組1 384 cm-1吸收峰的相對(duì)強(qiáng)度隨著植株生長(zhǎng)逐漸減弱，這是由于農(nóng)藥殘留由根運(yùn)輸進(jìn)入玉米地上器官，導(dǎo)致根中的農(nóng)藥殘留濃度逐漸降低。

2.3 包衣劑農(nóng)藥在玉米葉片中殘留情況的傅里葉變換紅外光譜分析

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組幼苗的三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期葉片的紅外光譜見圖3。對(duì)比對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的光譜，兩者差異最大的吸收峰在1 565 cm-1附近的酰胺Ⅱ帶和1 375 cm-1附近的C—H彎曲振動(dòng)吸收帶。實(shí)驗(yàn)組玉米幼苗葉片光譜中在酰胺Ⅱ帶位置均出現(xiàn)明顯的肩峰，而在對(duì)照組玉米幼苗葉片光譜中該肩峰則未能觀察到。經(jīng)過包衣劑農(nóng)藥包裹種子的幼苗葉片，隨著植株的生長(zhǎng)，酰胺Ⅱ帶呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì)，肩峰逐漸消失。未經(jīng)過包衣劑農(nóng)藥包裹種子的幼苗葉片光譜中，酰胺Ⅱ帶位置均沒有出現(xiàn)肩峰。對(duì)照組玉米幼苗光譜C—H的彎曲振動(dòng)吸收峰均出現(xiàn)在1 375 cm-1附近，而實(shí)驗(yàn)組的玉米幼苗均出現(xiàn)在1 384 cm-1附近。結(jié)合圖1，可以再次確定1 375 cm-1吸收峰主要來自于纖維素，1 384 cm-1吸收峰主要來源于玉米包衣劑農(nóng)藥的殘留。

圖3 種子經(jīng)過包衣劑包裹和未包裹的玉米幼苗葉片的紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of maize seedling leaves ofseeds with and without coating agent

在含有包衣劑農(nóng)藥殘留的葉片光譜中，導(dǎo)致1 375 cm-1吸收峰沒有被觀察到的原因是1 384 cm-1的吸收帶強(qiáng)于1 375 cm-1的吸收帶，兩者相互疊加，導(dǎo)致1 375 cm-1的吸收峰被掩蓋，最終呈現(xiàn)1 384 cm-1的吸收峰。對(duì)殘留包衣劑葉片光譜的1 384 cm-1疊加帶進(jìn)行傅里葉自去卷積(Fourier self-deconvolution, FSD)，見圖4，可剝離出1 375 cm-1的吸收子峰，進(jìn)一步證實(shí)了上述的分析。

2.4 玉米幼苗根和葉紅外光譜的主成分分析

為了便于清楚地對(duì)比含農(nóng)藥殘留和未含農(nóng)藥殘留的玉米葉片、根部器官的光譜規(guī)律，對(duì)其傅里葉變換紅外光譜中的主要吸收帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和歸屬[12-15]，見表1。

紅外光譜可視為高維度數(shù)據(jù)，往往存在一定的數(shù)據(jù)冗余，冗余數(shù)據(jù)會(huì)干擾有用信息的獲取。為了快速區(qū)別包衣劑農(nóng)藥殘留的玉米植株，主成分分析(principal component analysis，PCA)方法用于對(duì)根、葉的紅外光譜進(jìn)行降維處理?？紤]到基線漂移的影響和提高光譜疊加帶的分辨率，先對(duì)紅外光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，再使用二階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行降維運(yùn)算。分別對(duì)葉、根的30個(gè)樣本的二階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行單因素方差分析，顯著性(p值)小于0.01，表明樣品的光譜具有顯著的統(tǒng)計(jì)意義。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組玉米幼苗根的二階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行主成分分析降維后，提取的前兩個(gè)主成分累計(jì)已經(jīng)包含了92%的光譜信息。同樣的處理方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組玉米幼苗葉片的二階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行降維，前兩個(gè)主成分累計(jì)已經(jīng)包含了96%的光譜信息。根、葉的二階導(dǎo)數(shù)光譜前兩個(gè)主成分的得分圖見圖5(g1—g15是根對(duì)照組樣本，a1—a15是根實(shí)驗(yàn)組樣本； y1—y15是葉片對(duì)照組樣本，b1—b15是葉片實(shí)驗(yàn)組樣本)。從圖5可看出，根的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的聚類圖中樣本散點(diǎn)沒有重疊，表明實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組玉米幼苗根的光譜存在差異，通過光譜可以將兩者區(qū)分開。葉片實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組雖然也分為兩類，但類間距離較近，y13和b14兩個(gè)樣品不能準(zhǔn)確判定，鑒別準(zhǔn)確率為93%。隨著幼苗生長(zhǎng)時(shí)間的增加，包衣劑農(nóng)藥在葉片內(nèi)的殘留逐漸降低，導(dǎo)致1 384 cm-1吸收峰的強(qiáng)度減弱，光譜中主要以1 375 cm-1吸收峰呈現(xiàn)出來，在FSD光譜中也證實(shí)了該變化規(guī)律。b14屬于生長(zhǎng)時(shí)間為35 d的樣本，包衣劑殘留相對(duì)生長(zhǎng)前期濃度降低，1 384 cm-1吸收峰強(qiáng)度減弱，導(dǎo)致b14和y13之間的類間距離減小，出現(xiàn)散點(diǎn)的交叉，而未能準(zhǔn)確鑒別。

圖4 種子經(jīng)過包衣劑包裹的玉米幼苗葉片的傅里葉自去卷積紅外光譜Fig.4 FSD infrared spectra of maize seedling leaves of seeds with coating agent

3 結(jié) 論

通過傅里葉變換紅外光譜對(duì)包衣劑包裹種子的玉米幼苗進(jìn)行研究，并與未經(jīng)過包衣劑包裹種子的玉米幼苗的光譜進(jìn)行對(duì)比。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過包衣劑包裹種子的玉米幼苗，其根和葉片的紅外光譜中均在1 384 cm-1附近出現(xiàn)C—H彎曲振動(dòng)的特征吸收峰，而未經(jīng)過包衣劑包裹種子的玉米幼苗的根和葉的紅外光譜中C—H彎曲振動(dòng)吸收峰均出現(xiàn)在1 375 cm-1附近。對(duì)比包衣劑的紅外光譜，證實(shí)1 384 cm-1的特征峰來自農(nóng)藥殘留的吸收。尤其在根的紅外光譜中，農(nóng)藥殘留在1 384 cm-1的特征峰較為尖銳，特征明顯。因此1 384 cm-1吸收帶可作為玉米幼苗植株中包衣劑殘留檢測(cè)的目標(biāo)對(duì)象。對(duì)玉米幼苗根和葉片的二階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行主成分分析后，前兩個(gè)主成分的得分圖顯示含農(nóng)藥殘留和不含農(nóng)藥殘留的根樣品散點(diǎn)圖沒有重合，含農(nóng)藥殘留和未含農(nóng)藥殘留的根被全部鑒別出來，正確識(shí)別率為100%。但含農(nóng)藥殘留和不含農(nóng)藥殘留的葉片樣品散點(diǎn)有交叉，正確識(shí)別率為93%。傅里葉變換紅外光譜技術(shù)具有便捷、快速等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合主成分分析可有效識(shí)別含有包衣劑農(nóng)藥殘留的玉米幼苗植株。該研究為農(nóng)作物植株內(nèi)農(nóng)藥殘留的鑒別提供一種便捷方法。

表1 玉米幼苗葉片和根的傅里葉變換紅外光譜主要吸收帶歸屬Table 1 General band assignments of the FTIR spectra of maize seedling root and leaf

圖5 玉米幼苗根和葉片二階導(dǎo)數(shù)光譜的主成分分析 Fig.5 PCA of secondary derivative spectra from corn seedling roots and leaves