稅云華, 張 蘭, 雷光磊, 諸源江, 李培玉

(四川省骨科醫(yī)院麻醉科, 成都 610041)

失眠癥是以睡眠障礙為主要表現(xiàn)的一種疾病。隨著社會的發(fā)展和各方面壓力的增大，失眠癥已經(jīng)普遍存在于成年人群中[1]。最新的一項流行病學調(diào)查顯示，全世界范圍內(nèi)，有接近30%的人群受失眠癥的困擾，嚴重影響了人類的身心健康[2]。盡管睡眠對人類的意義重大，但關(guān)于睡眠和失眠的機制研究卻不甚清楚。對于失眠癥的治療方法也在逐漸探索中。目前治療失眠癥的藥物主要以鎮(zhèn)靜、催眠類藥物為主，但長期大量服用容易引起藥物成癮，且不良反應(yīng)較大[3-5]。臭氧(O3)具有極強的氧化作用和較高的能量，是構(gòu)成自然界大氣的成分之一。既往研究證實，臭氧治療局部感染有著良好的效果[6]；也有學者采用臭氧自體血回輸技術(shù)治療急性期腦梗死并取得了顯著的療效[7]。隨著對臭氧研究的深入，國內(nèi)已有報道，臭氧大自血法對于失眠癥的治療也具有益處[8]，但其機制卻在探索中。為了深入探討臭氧大自血法治療失眠癥的可能機制，本研究通過構(gòu)建睡眠剝奪大鼠模型，并用臭氧大自血法進行干預(yù)，觀察大鼠血清褪黑素和氧化應(yīng)激指標的變化。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠40 只，9 周齡，體質(zhì)量(300±30) g，購自成都達碩實驗動物有限公司[SCXK(川)2015-030]。所有大鼠均于實驗前在晝夜明暗12 h∶1 2 h(07∶00 開燈, 19∶00關(guān)燈)、通風良好、正常飲食條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察7 d，并于成都中醫(yī)藥大學中醫(yī)內(nèi)科臟腑病癥實驗室[SYXK(川)2017-179]完成實驗。

1.2 實驗材料

Hyper-Medozon comfort醫(yī)用臭氧發(fā)生器(德國赫爾曼公司)發(fā)生的臭氧，回輸專用真空注射器(上?？档氯R企業(yè)發(fā)展集團股份有限公司，批號20190200)；大鼠血清褪黑素檢測試劑盒(上海信裕生物工程有限公司，批號XY-E30014-18192)，大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司，批號ZY-SOD-Ra18057)，大鼠血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)檢測試劑盒(上海撫生實業(yè)有限公司，批號fs-E 5 8 0 9-18133)，大鼠血清丙二醛(MDA)檢測試劑盒(上海信裕生物工程有限公司，批號X Y-E 3 0 2 6 6-181072)。

1.3 實驗儀器

按文獻[9]自制睡眠剝奪箱(127 cm×44 cm×45 cm，材質(zhì)為有機玻璃)(圖1)，在箱內(nèi)底部裝有14 個直徑為6.5 cm 的平臺。實驗開始前，向箱內(nèi)加水至距離平臺1 cm 處。

1.4 造模方法

造模時，每次將10 只大鼠分別置于平臺上(圖2)，大鼠可在平臺自由活動、飲食。待大鼠進入快速眼球運動睡眠(rapid eye movement sleep,REM)相時，大鼠肌張力下降，頭部觸水驚醒，強制進行睡眠剝奪。所有大鼠睡眠剝奪72 h。

1.5 分組方法

根據(jù)隨機數(shù)字表, 將所有大鼠隨機分成2 組，每組20 只，分別設(shè)置為對照組和觀察組。

1.6 干預(yù)方法

圖1 自制睡眠剝奪箱

使用回輸專用真空注射器于造模后抽取觀察組大鼠尾靜脈血2 mL, 與臭氧(40 μg/mL)按1∶1體積比混合3～5 min，隨后從尾靜脈回輸體內(nèi)，1 次/12 h，共3d。

對照組大鼠使用空氣代替臭氧, 其余同觀察組。

1.7 觀察指標

1.7.1 睡眠時相 分別在干預(yù)前及干預(yù)結(jié)束后, 于9∶00～17∶00, 檢測各組大鼠覺醒期(wake, W)、慢波睡眠(slow-wave sleep, SWS)、快波睡眠(fast-wave sleep, FWS)，作為失眠客觀評價指標，以評價干預(yù)效果。

1.7.2 血清褪黑素水平 分別在干預(yù)0 h、24 h、48 h、72 h 時，于凌晨01:00～02:00，抽取大鼠尾靜脈血1 mL 進行檢查。血液樣本保存于4 ℃冰箱，2 500 r/mim 下離心10 min，用試劑盒進行檢測。

1.7.3 血清氧化應(yīng)激指標 分別在干預(yù)0 h、72 h時，于凌晨01∶00～02∶00，抽取大鼠尾靜脈血1 mL，其余同血清褪黑素水平檢測方法。檢測試劑購自上海信裕生物工程有限公司

1.8 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析。血清褪黑素、SOD、GSH-px、MDA 水平均為正態(tài)分布計量資料，采用均值±標準差表示。上述指標組間比較采用獨立樣本t 檢驗，組內(nèi)血清褪黑素水平比較采用雙因素方差分析，組內(nèi)SOD、GSH-px、MDA 水平比較采用配對t 檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠睡眠時相比較

干預(yù)0 h 時，兩組大鼠W、SWS、FWS 比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 干預(yù)72 h 時，觀察組大鼠W 時間短于對照組，SWS、FWS 時間長高于對照組(P<0.05)(表1)。

圖2 睡眠剝奪實驗

2.2 兩組大鼠血清褪黑素水平比較

干預(yù)0 h、24 h 時，兩組大鼠血清褪黑素水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 干預(yù)48 h、72 h 時，觀察組大鼠血清褪黑素水平均高于對照組(P<0.05)(表2)。

2.3 兩組大鼠血清氧化應(yīng)激指標比較

干預(yù)0 h 時, 兩組大鼠SOD 水平、GSH-px 水平、MDA 水平比較, 差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);干預(yù)72 h 時，觀察組大鼠SOD 水平、MDA 水平低于對照組，GSH-px 水平高于對照組(P<0.05)(表3)。

表1 兩組大鼠睡眠時相比較 (min)

表2 兩組大鼠血清褪黑素水平比較 (ng/L)

表3 兩組大鼠血清氧化應(yīng)激指標比較

3 討論

失眠癥是影響人們身心健康的常見疾病之一。鎮(zhèn)靜、催眠類藥物是治療失眠癥的主要藥物，但受副作用和成癮性影響，臨床應(yīng)用受到限制。臭氧大自血法最早被用于治療腦梗死，隨著研究的深入，其逐漸被應(yīng)用于治療包括失眠在內(nèi)的多種疾病。國內(nèi)學者王曉平等[10]指出，臭氧大自血法治療失眠效果優(yōu)于阿普唑侖，且安全性較好；郭明遠等[11]利用臭氧大自血法聯(lián)合電項針治療高血壓伴失眠癥，可有效改善患者睡眠質(zhì)量，無明顯不良反應(yīng)。然而，目前關(guān)于失眠癥治療的研究主要集中在心理水平改變[12]、神經(jīng)行為學水平改變[13]等方面，對于其機制的研究尚處在起步階段。近年來，關(guān)于失眠機制的可能學說主要集中在下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)軸功能失調(diào)[14]、迷走神經(jīng)張力改變[15]以及褪黑素水平改變[16]等方面。

本研究選取睡眠時相作為觀察指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用臭氧大自血法干預(yù)72 h 的觀察組大鼠W期短于對照組，SWS、FWS 時間長于對照組。這一結(jié)果提示, 臭氧大自血法對于調(diào)節(jié)睡眠剝奪大鼠睡眠時相具有積極的意義。這與賀丹等[8]、王曉平等[10]的臨床研究結(jié)果相一致。本研究從動物實驗上進一步證實了臭氧大自血法治療失眠的效果。

由于褪黑素具有鎮(zhèn)靜催眠和調(diào)節(jié)睡眠周期的作用，正常情況下，褪黑素受光照調(diào)節(jié)，光照通過視網(wǎng)膜和視神經(jīng)將信號轉(zhuǎn)導至松果體，松果體內(nèi)的色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥色氨酸，5-羥色氨酸逐步轉(zhuǎn)化合成為褪黑素。失眠患者體內(nèi)褪黑素水平降低，試驗性睡眠剝奪模型也具有相似的改變。由此可見，褪黑素不僅是失眠的分子標志物，同時也是失眠的重要誘因之一。由于褪黑素是內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，其調(diào)控受眾多因素影響，其在失眠中的具體機制還尚未闡明。有研究證實，褪黑素除了與失眠關(guān)系密切外，也在神經(jīng)功能受損[17]、焦慮抑郁[18]、肝硬化[19]等疾病中發(fā)揮著重要的作用，在這些疾病中，褪黑素又與氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切?；谝陨辖Y(jié)果，本研究選取褪黑素和氧化應(yīng)激指標(SOD、GSH-px、MDA)作為觀察指標，探討臭氧大自血法對睡眠剝奪大鼠血清中上述指標的影響。

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)早期(0 h、24 h 時)，兩組大鼠血清褪黑素水平差異不顯著; 而在干預(yù)48 h、72 h 時，觀察組大鼠血清褪黑素水平均高于對照組。如前所述，機體褪黑素水平的高低可在一定程度上反映失眠的程度，也是誘發(fā)失眠發(fā)生的使動因素。因此，有理由認為，臭氧大自血法可阻斷失眠發(fā)展的誘因，從而對失眠起到治療作用。隨后，本研究觀察了兩組大鼠SOD、GSH-px、MDA 水平的變化，結(jié)果顯示，干預(yù)0 h 時，兩組大鼠SOD、GSH-px、MDA 水平比較，差異不顯著; 在干預(yù)72 h 時, 觀察組大鼠SOD、MDA 水平明顯低于對照組，GSH-px 水平明顯高于對照組。既往研究認為，機體氧化應(yīng)激水平的改變參與了失眠的發(fā)生發(fā)展[20]，針灸及部分藥物均可在改善睡眠質(zhì)量的同時減輕機體氧化應(yīng)激反應(yīng)[21-22]。由此可見，氧化應(yīng)激水平也可能是失眠發(fā)展的重要影響因素。

綜上所述，臭氧大自血法可促進睡眠剝奪大鼠褪黑素釋放，降低大鼠血清SOD 水平、MDA水平，提高大鼠血清GSH-px 水平。但在臭氧干預(yù)下的褪黑素與氧化應(yīng)激水平之間的關(guān)系還需進一步探索。