陶凌云, 周 潔, 胡建華, 高 誠

(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心, 上海 201203)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為研究材料或研究條件，其標(biāo)準(zhǔn)化程度是至關(guān)重要的。如果缺乏優(yōu)質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，我們將很難取得準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好的科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

美國紐約科學(xué)院早在1944年就率先提出了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化問題，日本也于1952年成立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所, 專門從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化工作[1]。我國于1988年頒布第一部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理法規(guī)——《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。1994 年頒布第一套實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量國家標(biāo)準(zhǔn)，并先后于2001 年和2010 年進(jìn)行了修訂。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化的重要內(nèi)容之一，主要包括遺傳學(xué)質(zhì)量和微生物學(xué)質(zhì)量。雖然各個(gè)國家或組織制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容不完全相同，但基本要求都是一致的。由于大鼠、小鼠個(gè)體小，生產(chǎn)繁殖快，飼養(yǎng)管理方便，質(zhì)量易于控制，對(duì)其研究最為深入。本文以大鼠、小鼠為代表，介紹國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)(International Council of Laboratory Animal Science,ICLAS)、歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)聯(lián)盟(Federation of Laboratory Animal Science Associations, FELASA)、美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室(JAX)、美國查士瑞華實(shí)驗(yàn)室(Charles River Laboratories, CRL)、美國Taconic Bioscience, Inc和日本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所(Central Institute of Experimental Animals, CIEA)這6家國際知名機(jī)構(gòu)和公司的大鼠、小鼠微生物和寄生蟲檢測指標(biāo), 并與我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 14922.1-2001、GB14922.2-2011)進(jìn)行分析比較，為我國實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠質(zhì)量檢測提供借鑒。

1 國內(nèi)外大鼠、小鼠微生物和寄生蟲檢測指標(biāo)比較

一些發(fā)達(dá)國家及地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)建議實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和使用單位在制定健康監(jiān)測方案時(shí)，不僅要考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，而且應(yīng)根據(jù)自身實(shí)際情況，制定個(gè)性化的健康監(jiān)測方案[1]。

ICLAS 主要通過建立標(biāo)準(zhǔn)及資源支持，促進(jìn)高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的監(jiān)控與生產(chǎn)[2]。ICLAS 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測中心2012年所規(guī)定的微生物和寄生蟲檢測項(xiàng)目[3]，與我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測國家標(biāo)準(zhǔn)(GB14922.1-2001、GB14922.2-2011)規(guī)定項(xiàng)目[4-5]相比，有一定差別。ICLAS要求檢測的項(xiàng)目更多,其中小鼠病毒檢測項(xiàng)目14 個(gè)、大鼠6 個(gè)(表1); 小鼠病原菌檢測項(xiàng)目19 個(gè)、大鼠9 個(gè)(表2); 小鼠和大鼠寄生蟲檢測項(xiàng)目均為1 個(gè)(表3)。

FELASA 每隔幾年更新一版最新的嚙齒類、家兔繁殖和實(shí)驗(yàn)單元的健康監(jiān)測指導(dǎo)意見[6]。2014版FELASA指導(dǎo)意見涵蓋的病毒檢測項(xiàng)目小鼠13 個(gè)、大鼠12 個(gè)(表1); 病原菌檢測項(xiàng)目小鼠13 個(gè)、大鼠9 個(gè)(表2); 寄生蟲要求排除所有體內(nèi)和體外寄生蟲(表3)。FELASA強(qiáng)調(diào)其指導(dǎo)意見是健康監(jiān)測的最低要求。

美國JAX、CRL 和Taconic 公司是全球最有實(shí)力的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)供應(yīng)商之一，他們的健康監(jiān)測方案具有很高的參考價(jià)值。JAX[7]要求在飼養(yǎng)單元內(nèi)必須排除的病原體有: 病毒17項(xiàng)(表1)、病原菌10 項(xiàng)(表2)、寄生蟲8 項(xiàng)(表3);CRL[8-10]健康監(jiān)測方案涉及病毒檢測項(xiàng)目小鼠19項(xiàng)、大鼠15 項(xiàng)(表1)，病原菌項(xiàng)目分為上呼吸道微生物和胃腸道微生物檢測，大鼠、小鼠上呼吸道細(xì)菌檢測項(xiàng)目均為12項(xiàng)，胃腸道細(xì)菌檢測大鼠3項(xiàng)、小鼠8 項(xiàng)(表2), 寄生蟲檢測項(xiàng)目大鼠2 項(xiàng)，小鼠1 項(xiàng)(表3); Taconic[11]的全球健康監(jiān)測系統(tǒng)表明，無病原體小鼠必須排除病毒20 項(xiàng)、病原菌21 項(xiàng)、寄生蟲16 項(xiàng)，無病原體大鼠必須排除病毒13 項(xiàng)、病原菌20 項(xiàng)、寄生蟲16 項(xiàng)(表1、表2 和表3)。3家公司均強(qiáng)調(diào)指出要根據(jù)實(shí)際情況制定適合的健康監(jiān)測方案。

CIEA[12]將大鼠、小鼠微生物監(jiān)測項(xiàng)目分為核心檢測項(xiàng)目和備選檢測項(xiàng)目。核心檢測項(xiàng)目列明小鼠病毒項(xiàng)目4 種、大鼠病毒項(xiàng)目4 種(表1)，小鼠病原菌項(xiàng)目11 項(xiàng)、大鼠病原菌項(xiàng)目10 項(xiàng)(表2)，大鼠、小鼠寄生蟲項(xiàng)目均為5 項(xiàng)(表3)。

我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測》(GB14922.2-2011)[4]、《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測》(GB14922.1-2001)[5]規(guī)定實(shí)驗(yàn)小鼠病毒檢測項(xiàng)目11 個(gè), 其中必檢項(xiàng)目6 個(gè),必要時(shí)檢測項(xiàng)目5 個(gè), 大鼠病毒檢測項(xiàng)目8 個(gè)，全部為必檢項(xiàng)目(表1); 小鼠病原菌檢測項(xiàng)目15 個(gè)，其中必檢項(xiàng)目8 個(gè)，必要時(shí)檢測項(xiàng)目7 個(gè)，大鼠病原菌檢測項(xiàng)目15 個(gè)，其中必檢項(xiàng)目9 個(gè)，必要時(shí)檢測項(xiàng)目6 個(gè)(表2); 大鼠、小鼠寄生蟲檢測項(xiàng)目7 個(gè)，其中必檢項(xiàng)目5 個(gè)，必要時(shí)檢測項(xiàng)目2 個(gè)(表3)。

從以上對(duì)比可以看出，一些病原體如小鼠輪狀病毒、微小病毒、諾如病毒、螺桿菌、CAR桿菌(Cilia-associated respiratory bacillus)、檸檬酸桿菌(Citrobacter rodentium, CBR)、牛棒狀桿菌(Corynebacterium bovis)等早已被國外機(jī)構(gòu)和公司列入必檢范圍，但我國的SPF 級(jí)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)中卻沒有列入。小鼠輪狀病毒能引起乳鼠流行性腹瀉，主要發(fā)生于第1 胎的哺乳小鼠，本病發(fā)病率高，病毒傳染性很強(qiáng)，而且病愈小鼠及其親代母鼠可長期帶毒，對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠群構(gòu)成嚴(yán)重威脅[13]；小鼠諾如病毒在我國的感染率很高，廣東省2010年首次檢出小鼠諾如病毒，攜帶率高達(dá)37.38%[14]，它可以導(dǎo)致一些先天性免疫缺陷小鼠發(fā)生致死性的感染；小鼠微小病毒(MPV)是鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物潛在的污染物，小鼠感染后通常無臨床表現(xiàn)，但在涉及免疫系統(tǒng)、腫瘤和移植的實(shí)驗(yàn)中，體內(nèi)外感染 MPV 可影響小鼠體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果造成嚴(yán)重偏差[15]; 嚙齒類動(dòng)物螺旋桿菌在全球范圍內(nèi)廣泛存在，該菌對(duì)不同品系的大鼠、小鼠均有感染，對(duì)雄性鼠的肝損傷略大于雌性鼠，大多以慢性感染的潛伏形式存在，但對(duì)于免疫缺陷動(dòng)物或免疫力降低的正常動(dòng)物，可表現(xiàn)為多類炎癥、腫瘤甚至死亡[16]，國外機(jī)構(gòu)和公司均將其列入必須檢測項(xiàng)目，但我國國家標(biāo)準(zhǔn)還未將其納入必須檢測項(xiàng)目; CAR桿菌多與肺支原體和病毒協(xié)同感染，引起細(xì)支氣管擴(kuò)張、化膿性支氣管炎、氣管炎、肺膿腫、肺不張，該菌不能在無活細(xì)胞的人工培養(yǎng)基上生長，因此該菌的檢測具有一定困難，菌株的差異使PCR 方法在我國也無法開展[17]。本文所列六大機(jī)構(gòu)和公司除FELASA外，其余5 家均將CAR 桿菌列入檢測方案中，而我國沒有將其列為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測項(xiàng)目，對(duì)該菌的研究基本為空白，缺乏病原學(xué)、流行病學(xué)資料。

國內(nèi)外寄生蟲檢測項(xiàng)目總體一致，但國外標(biāo)準(zhǔn)的要求更高，F(xiàn)ELASA 要求排除所有體外寄生蟲和體內(nèi)寄生蟲(追溯到“屬”); JAX 也要求排除小鼠的體外寄生蟲(跳蚤、虱子、皮毛螨)和體內(nèi)寄生蟲(絳蟲、蟯蟲、其他蠕蟲)，還有機(jī)會(huì)性原生動(dòng)物例如賈第鞭毛蟲、錐蟲。國外的標(biāo)準(zhǔn)也更為細(xì)化, 有些機(jī)構(gòu)特指需要排除四翼無刺線蟲、艾美爾球蟲、膜殼絳蟲屬、鼠肉螨、鼠癬螨等。

表1 SPF 級(jí)嚙齒類實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠病毒學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比Table 1 Comparison of virological standards for SPF rats and mice

2 國內(nèi)外大鼠、小鼠微生物和寄生蟲檢測方法比較

國內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的檢測方法主要有: 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、血凝試驗(yàn)(HA)、血凝抑制試驗(yàn)(HAI)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)、免疫酶染色試驗(yàn)(IEA)、斑點(diǎn)免疫試驗(yàn)(DIA)、放射免疫診斷實(shí)驗(yàn)(RID)、培養(yǎng)法(Culture test)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR test)、鏡檢法(Microscopy)等，其中病毒項(xiàng)目首次檢測多選用E LISA 和IEA，驗(yàn)證多選用IFA 和HAI 等方法。國外機(jī)構(gòu)和公司采用的方法包括多重?zé)晒饷庖叻治?MFIA)、ELISA、IFA、HAI、乳酸脫氫酶血液生化分析方法或生物化學(xué)方法(CHEM)、雜交免疫印跡試驗(yàn)(WB)、PCR、培養(yǎng)法和鏡檢法等。其中，病毒項(xiàng)目首次檢測多選用MFIA或ELISA，對(duì)可疑或陽性結(jié)果會(huì)采用其他方法，如IFA、WB、PCR 等進(jìn)行驗(yàn)證。2000 年Notomi 等建立了一種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)的核酸擴(kuò)增新技術(shù)[18]，短短幾年，該技術(shù)在病毒的快速檢測方面發(fā)展迅速，可對(duì)多種病毒進(jìn)行檢測和鑒定，已經(jīng)發(fā)展成為最有前景的快速診斷手段，例如：鼠痘病毒、仙臺(tái)病毒、小鼠肝炎病毒等的LAMP 檢測方法均已建立[19-21]。

表2 SPF 級(jí)嚙齒類實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠病原菌標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比Table 1 Comparison of bacteriological standards for SPF rats and mice

表3 SPF 級(jí)嚙齒類實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠寄生蟲學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比Table 1 Comparison of parasitological standards for SPF rats and mice

3 國內(nèi)外大鼠、小鼠微生物和寄生蟲檢測頻率比較

我國國家標(biāo)準(zhǔn)中SPF級(jí)動(dòng)物的檢測頻率為每3 個(gè)月一次, 檢測項(xiàng)目是固定的。而國外機(jī)構(gòu)和公司在檢測頻率上的設(shè)定更為合理、細(xì)致。JAX根據(jù)所檢病原體的流行性和多發(fā)性確定檢測頻率[22], 大部分病原體都是6 周檢測一次， K 病毒和乳酸脫氫酶病毒(LDHV)是一年一次，梭狀桿菌(Clostridium piliforme)是一個(gè)季度一次；CRL則按照所檢病原體的特性制定檢測頻率，更為靈活，每13 周就會(huì)對(duì)3 個(gè)不同年齡段的12～16 只動(dòng)物進(jìn)行血清學(xué)、細(xì)菌學(xué)、寄生蟲學(xué)的檢測，每4 周從屏障房間內(nèi)的排風(fēng)口和墊料中搜集樣品進(jìn)行檢測；在野生嚙齒類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中都很常見的螺桿菌屬，每個(gè)季度所有的種群都會(huì)采用PCR的方法檢測。

4 討論

李靈恩等[23]對(duì)2016 年1 月—2016 年12 月來自于美國、德國、日本的170批次不同品系的340只實(shí)驗(yàn)小鼠，以及來自國內(nèi)各科研單位119 批次不同品系的232 只實(shí)驗(yàn)小鼠，進(jìn)行LCMV、HV、ECT、SV、MHV、MVM、MPV 和TMEV 共8種常見病毒的檢測；結(jié)果表明，來自國外的實(shí)驗(yàn)小鼠檢測結(jié)果均是陰性，國外引進(jìn)的小鼠檢出率低，而來自國內(nèi)的小鼠MH V、SV、TME V、MPV、MVM 均有一定程度的檢出率。該研究結(jié)果說明美國、德國、日本等發(fā)達(dá)國家在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方面擁有較為完善的組織機(jī)構(gòu)和管理應(yīng)用體系，按照要求定期對(duì)動(dòng)物質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格的檢測，且對(duì)動(dòng)物健康及標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)有明確規(guī)定; 國內(nèi)來源的小鼠背景復(fù)雜, 質(zhì)量管理水平參差不齊，存在隱性感染的情況。

在日常工作中，要求管理者采用最嚴(yán)格的微生物控制標(biāo)準(zhǔn)排除所有病原體，使用者使用最高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不一定是最合適的。因?yàn)椋瑢?duì)于動(dòng)物飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)而言，采用最嚴(yán)格的控制措施會(huì)浪費(fèi)很多資源，完全消除這些病原體也是不現(xiàn)實(shí)的。對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用者而言，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康監(jiān)測方案如能根據(jù)研究目的來制定，而不是不同的研究項(xiàng)目使用同一種健康監(jiān)測方案，更為簡單有效[1]。通過健康監(jiān)測可以防止直接接觸的感染，但病原體感染易感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較難以控制的是間接傳播，即空氣、飼料、水、用具、節(jié)肢動(dòng)物、野生動(dòng)物和人；在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境與設(shè)施國家標(biāo)準(zhǔn)中，技術(shù)指標(biāo)多為物理參數(shù)，如溫度、壓差和潔凈度等等，化學(xué)參數(shù)僅有一個(gè)氨濃度，生物學(xué)參數(shù)僅為沉降菌。最近有報(bào)道[24-25]采用PCR方法檢測IVC 排風(fēng)口碎片和蓋子過濾材料進(jìn)行小鼠種群和嚙齒類微生物病原體檢測比較，檢測參數(shù)包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲(線蟲和螨)。采用宏基因組方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施進(jìn)行生物學(xué)參數(shù)檢測可以反映和評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施狀況，預(yù)警動(dòng)物種群的健康。

隨著腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品與生物制品的安全性評(píng)價(jià)及有效藥品的篩選等實(shí)驗(yàn)推廣，裸小鼠以及轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用越來越多，對(duì)其質(zhì)量檢測要求也越來越高。而傳統(tǒng)的間接 ELISA 方法檢測血清抗體并不適用這類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因裸小鼠有免疫缺陷，因此感染病毒后不易產(chǎn)生抗體，用ELISA 方法檢測裸鼠的病毒抗體易產(chǎn)生假陰性。在我們?nèi)粘z測工作中還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠存在非特異性抗體增高的現(xiàn)象，即特異性抗原孔吸光度(A)值增高的同時(shí)，對(duì)照孔的 A 值也同時(shí)增高，說明用間接 ELISA 方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠病毒抗體的本底值較高，易產(chǎn)生假陽性。作者單位實(shí)驗(yàn)室建立的幾種小鼠易感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增可視化檢測方法就是一種高效、便捷、穩(wěn)定的直接檢測抗原的方法[20]，相比較傳統(tǒng) PCR 而言有著檢測更迅速、靈敏，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件(尤其是縣市基層) 的快速檢測使用等優(yōu)點(diǎn)，因而有很大應(yīng)用潛力。

我國國家標(biāo)準(zhǔn)與ICLAS以及歐洲、美國和日本的相關(guān)機(jī)構(gòu)相比，涉及的檢測項(xiàng)目相對(duì)較少，近年來流行的影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的一些病原體未能涉及，檢測的頻率也過于固定(3 個(gè)月一次)，不夠靈活；一些陽性率極低的檢測項(xiàng)目，例如大鼠HV 病毒、小鼠Ect 病毒，可以適時(shí)減少檢測頻次，根據(jù)不同病原體的特性調(diào)整監(jiān)測計(jì)劃，既能保證動(dòng)物質(zhì)量，又可節(jié)省經(jīng)費(fèi)，使質(zhì)量檢測工作在確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量方面起到應(yīng)有作用。為使我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)盡快與國際接軌，保證我國生物醫(yī)藥領(lǐng)域中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在國際上具有可比性、得到公認(rèn)，現(xiàn)有檢測標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)參照國際知名機(jī)構(gòu)和公司拓展更多項(xiàng)目，檢測方法也應(yīng)更加多樣化，只有采用幾種方法聯(lián)合應(yīng)用，取長補(bǔ)短，才能提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

[感謝上海潤諾生物科技有限公司王娛、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院李垚博士、 諾華(中國)生物醫(yī)學(xué)研究有限公司黎明、 迪哲(上海)醫(yī)藥有限公司盧曉博士、上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司賈敏為本文提供的資料支持]。