黃暨生, 吳淑儀, 詹錦河, 倪慶純

(1.廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心, 廣州 510240;2.南方醫(yī)科大學(xué)博士后科研流動站基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 廣州 510515;3.廣州醫(yī)藥集團(tuán)有限公司博士后科研工作站, 廣州 510130)

新藥研發(fā)過程中，傳統(tǒng)的毒理研究設(shè)計僅能提供成年動物給藥的安全性評價(安評)資料，無法充分提供兒科用藥的安全性數(shù)據(jù)[1]，目前對新生和幼齡動物非臨床發(fā)育毒性研究的需求變得越來越迫切。我國尚未發(fā)布兒科用藥非臨床安評指導(dǎo)原則，僅國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)在2014 年頒布了《化學(xué)藥物兒科人群藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，藥品審評中心分別在2015 年和2017年發(fā)布了《兒科人群藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《兒科用藥非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》征求意見稿[2-4]。近年來，國內(nèi)雖逐漸開展了幼齡SD 大鼠非臨床安評相關(guān)的研究，但有關(guān)幼齡SD大鼠自發(fā)性病變的研究還不夠深入。為此，本文研究了幼齡SPF 級SD 大鼠發(fā)育不同時間的自發(fā)性病變的發(fā)生情況，以期為提高實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量和醫(yī)藥科學(xué)研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級幼齡SD大鼠為本中心近2年開展幼齡SD大鼠藥物重復(fù)給藥毒性研究試驗(yàn)中陰性對照組動物，成年雄鼠及雌鼠均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-0011]。動物使用與管理均通過廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心IACUC 審查(IACUC號：IA-AP2017003-01M，IA-AP2017005-01M)。

1.2 飼養(yǎng)條件

SD大鼠均飼養(yǎng)于SPF級屏障設(shè)施[SYXK(粵)2018-0003]，3～5 只/籠飼養(yǎng)。環(huán)境指標(biāo)均符合GB14925-2010 屏障環(huán)境技術(shù)要求。

日常飼喂的60Co照射消毒飼料由上海普路騰生物科技有限公司提供[滬飼證(2018)04001]，購進(jìn)的飼料每年至少檢測1次, 檢查的內(nèi)容主要有粗灰分(g/kg)、粗脂肪(g/kg)、粗纖維(g/kg)、粗蛋白(g/kg)、水分和其他揮發(fā)性物質(zhì)(%)、鈣(g/kg)、總磷(g/kg)、菌落總數(shù)(CFU/g)、大腸菌群(MPN/100 g)、霉菌和酵母數(shù)(CFU/g)、沙門菌等；最近一次由廣東省微生物分析檢測中心檢測，以上各項(xiàng)檢測內(nèi)容均符合標(biāo)準(zhǔn)(檢測報告日期：2018 年08 月)。

飲用水為過濾除菌水，動物飲水由飲水瓶自由攝取，動物飲用水每年至少由第三方檢測2次。最近一次檢測由廣東省微生物分析檢測中心檢測，檢驗(yàn)合格(檢測報告日期：2019 年05 月08日)，確保動物飲用水符合國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)。飲用水檢測的內(nèi)容主要有菌落總數(shù)(C F U/mL)、pH、色度(度)、總硬度(mg/L)、砷(mg/L)、鉻(六價，mg/L)。

1.3 方法

1.3.1 合籠交配 試驗(yàn)選取檢疫合格的成年雄鼠20 只，雌鼠40 只，按照1∶2 或1∶1 的比例同籠。交配期為2 周，次日開始，每日早上09∶00前進(jìn)行陰栓和陰道涂片檢查，查到精子或陰栓確定妊娠后，將妊娠孕鼠取出，不銹鋼籠飼養(yǎng)。在妊娠鼠分娩前3～5 d，放入PVC 盒，單獨(dú)飼養(yǎng)，每日檢查2 次(上午、下午各一次)，記錄分娩時間。仔鼠出生21 d (PND21)斷乳，母仔分離飼養(yǎng)。在PND20 選取健康合格的仔鼠，按性別和體質(zhì)量隨機(jī)分組進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 動物處理 根據(jù)CFDA 藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)和ICH S11 支持兒科用藥開發(fā)的非臨床安全性評價[5-7]，于PND51(16 只)、PND65(12 只)、PND111(24 只)、PND139(14 只)分別處死部分大鼠，雌雄各半。動物處死前禁食12 h，不禁水，經(jīng)20%烏來糖麻醉，用注射器通過腹主動脈采血后放血處死。取材后置于體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液中固定。

1.3.3 組織病理學(xué)檢查 根據(jù)CFDA 藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則[5]，對心臟、肝臟、脾臟、肺臟(附主支氣管)、腎臟、腎上腺、胸腺、腦(大腦、小腦、腦干)、主動脈、唾液腺、頸部淋巴結(jié)、食道、氣管、甲狀腺(甲狀旁腺)、胰腺、腸系膜淋巴結(jié)、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、皮膚(腹部)、坐骨神經(jīng)、骨骼肌、骨(股骨，附帶一側(cè)關(guān)節(jié))、眼、哈德腺、垂體、脊髓(頸、胸、腰段)、骨髓(胸骨)、膀胱、睪丸、附睪、前列腺、精囊、子宮和子宮頸、卵巢、輸卵管、陰道、乳腺等42 個臟器進(jìn)行常規(guī)石蠟制片(ASP 300S 型脫水機(jī)、EG1160 包埋機(jī)，德國Leica 公司)，切片厚度約2～3 μm (RM2235型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、H1210型攤片機(jī)、HI1220 型烤片機(jī)，德國Leica 公司)，HE染色(ST5020/CV5030型全自動染色/封片工作站，德國Leica 公司)在光學(xué)顯微鏡(BX53+DP73型熒光生物、cellSens Standard 采圖系統(tǒng)，日本Olympus 公司)下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.3.4 病理診斷標(biāo)準(zhǔn) 病理診斷術(shù)語及標(biāo)準(zhǔn)主要參照INHAND[8-23]，HE 染色采用“1(輕微)、2(輕度)、3(中度)、4(重度)、5(嚴(yán)重)”表示組織學(xué)改變程度[8]。

2 結(jié)果

2.1 PND51 SD 大鼠自發(fā)病變

PND51 SPF級SD 大鼠自發(fā)病變見表1 和圖1。

2.1.1 肝臟 肝間質(zhì)內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等炎細(xì)胞增生浸潤形成的炎癥小灶(圖1A); 肝匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞內(nèi)見大小不等的空泡(圖1B); 肝中央小靜脈周圍有數(shù)個增生小膽管形成(圖1C)。

2.1.2 肺臟 局部肺泡間隔變寬，細(xì)支氣管周圍有炎細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張充血，肺泡腔變小(圖1D)。

2.1.3 腎臟 腎盂和腎乳頭管局部有少量炎細(xì)胞浸潤，乳頭上皮增生(圖1E)。

2.1.4 腸系膜 淋巴結(jié)皮質(zhì)比例減少，髓質(zhì)比例增多，淋巴小結(jié)淋巴細(xì)胞發(fā)生中心淋巴細(xì)胞增生(圖1F)。

2.1.5 盲腸 腸道黏膜出血伴有炎細(xì)胞浸潤，局部上皮細(xì)胞排列紊亂，壞死脫落，黏膜下血管擴(kuò)張充血，肌層及漿膜層結(jié)構(gòu)完整(圖1G)。

2.1.6 胰腺 胰腺間質(zhì)有大量淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞增生浸潤，伴有少量出血及纖維素樣滲出(圖1H)。

表1 PND51 SD 大鼠自發(fā)病變發(fā)生率 (n=16)Table 1 The incidence of spontaneous histopathological lesions of SD rat in PND51 (n=16)

圖1 PND51 SD 大鼠自發(fā)病變 (HE 染色)

2.2 PND65 SD 大鼠自發(fā)病變

PND65 大鼠自發(fā)病變見表2 和圖2。

2.2.1 心臟 局部心肌纖維斷裂，伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤(圖2A)。

2.2.2 肺臟 局部肺泡間隔變寬伴炎細(xì)胞浸潤，肺泡腔變小甚至閉塞融合成片，伴有大量巨噬細(xì)胞增生，形成肉芽腫性病變(圖2B)。

2.2.3 腎臟 腎小管腔內(nèi)有一些顆粒狀物質(zhì)(圖2C);局部腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，有些脫落至管腔(圖2D)。

2.2.4 胸腺 皮髓質(zhì)中充滿紅細(xì)胞(圖2E)。

2.2.5 前列腺 局部前列腺間質(zhì)內(nèi)有一些炎細(xì)胞浸潤(圖2F)。

2.2.6 肝臟 肝細(xì)胞空泡變性，肺臟單核細(xì)胞浸潤，同2.1 節(jié)相關(guān)內(nèi)容。

2.3 PND111 SD 大鼠自發(fā)病變

PND111 大鼠自發(fā)病變見表3 和圖3。心臟心肌炎細(xì)胞浸潤，肝臟肝細(xì)胞空泡變性、單核細(xì)胞浸潤，肺臟單核細(xì)胞浸潤，腎臟腎小管上皮細(xì)胞壞死，胸腺出血，同2.1、2.2 節(jié)相關(guān)內(nèi)容。

表2 PND65 SD 大鼠自發(fā)病變發(fā)生率 (n=12)Table 2 The incidence of spontaneous histopathological lesions of SD rat in PND65 (n=12)

圖2 PND65 SD 大鼠自發(fā)病變(HE 染色)

表3 PND111 SD 大鼠自發(fā)病變發(fā)生率 (n=24)Table 3 The incidence of spontaneous histopathological lesions of SD rat in PND111 (n=24)

2.3.1 胸腺 胸腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，纖維組織增生(圖3A)。

2.3.2 哈德腺 哈德腺細(xì)胞間有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞增生浸潤，形成多個炎癥灶(圖3B)。

2.4 PND139 SD 大鼠自發(fā)病變

PND139 大鼠自發(fā)病變見表4 和圖4。肝臟中肝細(xì)胞空泡變性同2.1 節(jié)；肺臟單核細(xì)胞浸潤同2.1 節(jié)；腎臟局部腎間質(zhì)中有大量炎細(xì)胞浸潤(圖4A)，腎集合管管腔內(nèi)有大量紅細(xì)胞(圖4B)。

3 討論

SD大鼠作為醫(yī)學(xué)研究最常應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動物之一，對幼齡SPF 級SD 大鼠發(fā)育不同時間的自發(fā)性病變的發(fā)生情況的總結(jié)可以幫助我們更好地判別醫(yī)學(xué)研究中大鼠病理變化是自發(fā)還是某醫(yī)學(xué)研究過程引起的，對正確評價研究結(jié)果起到了重要作用[24-27]。大鼠壽命為2.5～3 年，一般20～21 d離乳，6～8 周齡性成熟[28-29]。本文總結(jié)了SPF 級幼齡SD大鼠藥物重復(fù)給藥毒性研究中陰性對照大鼠在發(fā)育不同時間的自發(fā)性病變，有心臟心肌炎細(xì)胞浸潤、肝臟單核細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞空泡變性、膽管增生、肺臟單核細(xì)胞浸潤、壞死性肉芽腫性炎、腎臟腎盂單核細(xì)胞浸潤、紅細(xì)胞管型、腎小管上皮細(xì)胞壞死、單核細(xì)胞浸潤、腎臟出血、腸系膜淋巴細(xì)胞減少、盲腸出血、胰腺單核細(xì)胞浸潤、胸腺皮質(zhì)/髓質(zhì)比例減少、胸腺出血、前列腺間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤、哈德腺單核細(xì)胞浸潤等，其中肝臟、心臟、腎臟自發(fā)性病變發(fā)生率及程度隨著大鼠的發(fā)育有所提高和加深。

表4 PND139 SD 大鼠自發(fā)病變發(fā)生率 (n=14)Table 4 The incidence of spontaneous histopathological lesions of SD rat in PND139 (n=14)

圖3 PND111 SD 大鼠自發(fā)病變 (HE 染色)

圖4 PND139 SD 大鼠自發(fā)病變 (HE 染色)

本研究發(fā)現(xiàn)，肝臟自發(fā)性病變主要為肝細(xì)胞空泡變性，其病變發(fā)生率及程度隨著大鼠發(fā)育時間有較明顯的提高和加深，其發(fā)生主要是甘油三酯在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積有關(guān)，可能由營養(yǎng)過?；驙I養(yǎng)不良引起：①肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪酸增多，如高脂飲食或營養(yǎng)不良時，體內(nèi)脂肪組織分解，過多的游離脂肪酸經(jīng)由血液入肝；②脂蛋白、載脂蛋白減少，如營養(yǎng)不良時，肝細(xì)胞中脂蛋白、載脂蛋白合成減少，細(xì)胞輸出脂肪受阻而堆積于細(xì)胞內(nèi)[30]。少量脂肪沉積肝細(xì)胞內(nèi)時，線粒體因存在一定代償功能而沒有明顯損傷，在肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性后，則存在明顯的線粒體能量代謝障礙，且能量代謝障礙程度與脂肪變性程度密切相關(guān)。肝細(xì)胞線粒體能量代謝障礙越嚴(yán)重，肝細(xì)胞對脂肪的處理、轉(zhuǎn)運(yùn)能力越低，肝臟脂肪的沉積也越多，形成惡性循環(huán)[31-32]。本研究還發(fā)現(xiàn)其余肝臟自發(fā)性病變還包括肝臟單核細(xì)胞浸潤、膽管增生。

其次是心臟自發(fā)炎性病變，心肌炎細(xì)胞浸潤有一定程度加深，鏡下可見伴隨心肌細(xì)胞壞死后白細(xì)胞浸潤和細(xì)胞質(zhì)碎片的吞噬，尤其是年齡大者，一般3～4 月齡的大鼠可見其早期病變，發(fā)病的原因不明確，可能與感染或飲食等因素有關(guān)。有報道[33-34]稱，在大多數(shù)品種的大鼠中，可偶爾見到小的壞死灶、局灶性炎癥和纖維化，且隨年齡增長而加重。有研究者認(rèn)為這些病灶可能與心臟血管功能障礙引起的灶性缺血有關(guān)[35]，支持這種假設(shè)的事實(shí)是這些病變主要位于心內(nèi)膜下和乳頭肌，是最易于缺血的區(qū)域。

隨著大鼠年齡的增長，自發(fā)性病變逐漸增多。已有研究報道8 周齡大鼠的各種自發(fā)性病變發(fā)生率基本小于5%[36]; 而SD 大鼠在試驗(yàn)期12 個月后，對照組雄性和雌性大鼠慢性間質(zhì)性腎炎的發(fā)生率均為100% (10/10)，雄性大鼠心肌病的發(fā)生率為30% (3/10)，雌性大鼠胰腺局部萎縮的發(fā)生率為50% (5/10)[37]。在不同實(shí)驗(yàn)室，大鼠各種自發(fā)性病變的發(fā)生率會有一定差別，這可能與所采用的大鼠的品系、批次、動物飼養(yǎng)環(huán)境條件、動物管理、試驗(yàn)人員態(tài)度和技術(shù)水平、病理診斷標(biāo)準(zhǔn)等因素有關(guān)。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注意建立自己的歷史對照值，為進(jìn)一步開展大鼠重復(fù)給藥毒性研究提供技術(shù)支撐。本文報告了4.5 月齡前用于藥物重復(fù)給藥毒性研究的SPF級幼齡SD大鼠在發(fā)育不同時間的自發(fā)性病變發(fā)生情況，以期為有關(guān)技術(shù)人員提供參考。