李一強(qiáng)，章銀波，朱欣琰，晏晨曦，王鵬，孫桂芹，俞洪

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院， 杭州 310053； 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 杭州 310053

微生物和人類生活密切相關(guān)，人的體表以及與外界相連的腔道中存在不同種類和數(shù)量的微生物。外耳道作為特殊的皮膚表層，也有相應(yīng)的微生物生存。外耳道軟骨部皮膚具有耵聹腺，其分泌的淡黃色黏稠物稱為耵聹，按黏稠度可分為干型和濕型[1]，干濕型別由常染色體單基因遺傳決定，濕型為顯性，干型為隱性[2]。耵聹作為一種常見的外耳道分泌物，能反映耳道微環(huán)境的狀況，其中含有脫落角質(zhì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等成分，可能會影響耳道微生物的生長[3]。耳道微生物的種類與生長數(shù)量存在基線，評估其水平可為人體外耳道健康監(jiān)測提供依據(jù)。

目前，國內(nèi)外對耳道微生物的研究多集中于耳道感染性疾病的病原菌分離及其耐藥性分析[4-6]。關(guān)于健康人耳道微生物的研究，我國已有對兒童、成人和老年人3類不同年齡人群的外耳道微生物進(jìn)行分析的報道，但未區(qū)分干、濕型別[7-9]。有研究表明，正常人皮膚表面的常居菌，如表皮葡萄球菌，在免疫力低下時可能轉(zhuǎn)變?yōu)闂l件致病菌[10]。外耳道作為特殊的皮膚表層，寄居于其中的正常菌群也有可能引發(fā)機(jī)會性致病。本課題組前期已對30例干型和10例濕型健康大學(xué)生的外耳道分泌物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及藥物敏感性分析[11]，但由于濕型耳道分泌物的樣本量較少，分析存在一定局限性。本研究通過進(jìn)一步收集樣本，分析健康人濕型外耳道分泌物的菌群結(jié)構(gòu)及其藥物敏感性，為濕型外耳道微生物種類和數(shù)量的基線水平研究提供數(shù)據(jù)，同時為耳道微生物的基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

38例濕型外耳道志愿者，年齡18～71歲，男女比例為1∶1。經(jīng)純音測聽和聲導(dǎo)抗測定均無明顯中耳、外耳道疾病。采集志愿者雙耳的外耳道分泌物，共76份。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器包括恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 SPH-250)、生物安全柜(美國NUAIRE公司 NU-425-400S)、高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司 YXQ-LS-100SII)、全自動微生物鑒定儀(法國生物梅里埃股份有限公司 VITEK 2 Compact)及其配套的細(xì)菌鑒定卡(GP卡和GN卡)等。主要試劑為普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(HTWS-B442)、水解酪蛋白(Mueller-Hinton，MH)培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(012)、藥敏紙片(170922)等，均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。頭孢硝噻吩紙片購自重慶龐通醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 外耳道分泌物采集參考《臨床檢驗(yàn)標(biāo)本采集手冊》(2011年)[12]及《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)[13]，對受試者的左、右耳分別進(jìn)行采樣，使用無菌棉簽蘸取少量無菌生理鹽水后，在外耳道用力旋轉(zhuǎn)取樣，采集的分泌物置于2 mL無菌生理鹽水中。

1.3.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)將上述采集的外耳道分泌物震蕩混勻，靜置30 min，取上清液進(jìn)行10、100及 1 000 倍梯度稀釋；采用平板涂布法，將原液及不同稀釋梯度的分泌物接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，孵育24 h；再挑取平板上的不同菌落，分別進(jìn)行4區(qū)劃線接種，得到純培養(yǎng)物。

1.3.3 菌落計數(shù)按照《GB 4789.2-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》標(biāo)準(zhǔn)[14]，用肉眼觀察平板，選取菌落數(shù)在30～300 CFU、無蔓延生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)，菌落數(shù)<30 CFU的平板記錄其具體菌落數(shù)，菌落數(shù)>300 CFU的平板記錄為多不可計。分別計算左、右耳原始樣品每毫升中的菌落數(shù)，以CFU/mL為單位進(jìn)行報告。

1.3.4 細(xì)菌的生化反應(yīng)鑒定將分離得到的菌株，先進(jìn)行觸酶試驗(yàn)和革蘭染色初步判斷，然后使用微量生化管和全自動微生物鑒定儀鑒定，鑒定結(jié)果參考《葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定編碼冊》(TH-16S)和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)進(jìn)行判定[15]。

1.3.5 藥物敏感性試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法對外耳道分泌物分離得到的細(xì)菌進(jìn)行藥敏分析。用比濁儀調(diào)菌液至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，涂布于MH培養(yǎng)基，貼上藥敏紙片，每張紙片中心的間距≥24 mm，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，孵育24 h，用直尺測定抑菌環(huán)直徑。依據(jù)臨床及實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所制定的標(biāo)準(zhǔn)(CLSI 2017)[16]，判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.6 β-內(nèi)酰胺酶的檢測采用頭孢硝噻吩紙片法，檢測青霉素耐藥菌株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的情況。將β-內(nèi)酰胺酶測試條末端濾紙用無菌生理鹽水浸潤后，用接種環(huán)挑取可疑待測菌落，在末端濾紙上涂抹開，置37 ℃恒溫孵育1～15 min，觀察濾紙上是否顯現(xiàn)紅色。顯紅色為陽性，反之為陰性。上述操作過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌標(biāo)準(zhǔn)，避免外界微生物污染。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 25.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 濕型外耳道分泌物的菌落計數(shù)

根據(jù)菌群計數(shù)的原則，從連續(xù)稀釋梯度平板中，選擇平行性好、菌落數(shù)在30～300 CFU的平板進(jìn)行菌落計數(shù)，低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)。結(jié)果表明，88.3%的濕型外耳道分泌物菌落數(shù)處于1×102CFU/mL～1×106CFU/mL，對左、右耳各范圍的菌落數(shù)量進(jìn)行比較，P值為0.786，說明兩者差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1。

2.2 濕型外耳道分泌物細(xì)菌以葡萄球菌為主

從76份濕型外耳道分泌物中分離得到139株細(xì)菌，其中135株為球菌，占97.1%；4株為桿菌，占2.9%。135株球菌中以葡萄球菌為主，位列前4位的分別是頭葡萄球菌、耳葡萄球菌、人葡萄球菌和表皮葡萄球菌，共111株，占82.2%。詳見表2。

此外，分離得到的139株細(xì)菌中，67株來自左耳，72株來自右耳，左、右耳中均以頭葡萄球菌、耳葡萄球菌、人葡萄球菌和表皮葡萄球菌居多。對左、右耳兩組菌株種類的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，P值為0.047，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法對上述分離到的所有細(xì)菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，針對分離率前4位的球菌、其他常見的葡萄球菌以及桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果分析。

2.3.1 濕型耳道分泌物中葡萄球菌的藥物敏感性頭葡萄球菌是分離率最高的細(xì)菌，藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，濕型外耳道分泌物分離的頭葡萄球菌對青霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素耐藥率分別為10.6%、14.9%、10.6%，而對臨床上常用的萬古霉素、米諾環(huán)素、頭孢西啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟等頭孢菌素、喹諾酮類及氨基糖苷類藥物敏感率均在95%以上，見表3。

濕型外耳道分泌物中共分離到耳葡萄球菌23株，占第2位。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，耳葡萄球菌對四環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥率分別為13.0%、30.4%；對臨床上常用的青霉素、頭孢菌素、慶大霉素、米諾環(huán)素、萬古霉素、喹諾酮類藥物敏感率均在95%以上，見表3。

人葡萄球菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，其對青霉素和紅霉素的耐藥率分別為50.0%和40.9%；而對四環(huán)素類和糖肽類等臨床常用藥物的敏感率均在90.0%以上，見表3。

表1 濕型外耳道分泌物菌落計數(shù)結(jié)果[CFU/mL](n=76)

表2 76份濕型外耳道分泌物細(xì)菌分離統(tǒng)計

濕型外耳道分泌物中分離率第4位的細(xì)菌為表皮葡萄球菌，藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示其對臨床常用的紅霉素、萬古霉素、頭孢菌素、氨基糖苷類以及四環(huán)素類等藥物的敏感率均在80.0%以上，而對復(fù)方新諾明的耐藥率為42.1%，見表3。

2.3.2 濕型耳道分泌物中桿菌的藥物敏感性在濕型外耳道分泌物中共分離到成團(tuán)泛菌、大腸埃希菌、陰道加德納菌、尿放線桿菌各1例。結(jié)果顯示，陰道加德納菌和尿放線桿菌均對臨床常見的抗生素具有一定敏感性；成團(tuán)泛菌對青霉素、苯唑西林、萬古霉素和克林霉素等抗生素，以及大腸埃希菌對復(fù)方新諾明具有一定耐藥性，結(jié)果詳見表4。

2.4 部分青霉素耐藥菌株的β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)陽性

濕型外耳道分泌物中分離到的132株葡萄球菌，其中25株對青霉素耐藥，占比18.9%。采用頭孢硝噻吩紙片法檢測青霉素耐藥株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的情況，初步分析其對青霉素的耐藥機(jī)制，結(jié)果表明25株青霉素耐藥株的β-內(nèi)酰胺酶陽性率為44.0%，見表5。

3 討論

研究表明，人體皮膚微生物群隨部位不同而有一定差異[17]，而外耳道微生物是皮膚微生物群的組成部分之一。近年來，關(guān)于耳道微生物的研究多集中于針對外耳道炎、中耳炎等耳道疾病進(jìn)行的病原菌分離，而有關(guān)健康人外耳道菌群分析的報道較少。

表4 濕型耳道分泌物中桿菌的藥物敏感性分析(n=4)

表5 25株耐青霉素葡萄球菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶情況統(tǒng)計

20世紀(jì)50年代至今，國內(nèi)外針對健康人耳道微生物的研究僅有少量文獻(xiàn)報道。1956年，Nichols等[18]報道從健康成年人外耳道中主要檢出微球菌。1981年，Brook[8]從3個月～12歲(平均年齡3歲零8個月)的健康兒童外耳道中分離培養(yǎng)出表皮葡萄球菌、類白喉棒狀桿菌和α-溶血性鏈球菌等，其中以表皮葡萄球菌最多，占比78%。美國、挪威等國家也有研究報道從健康兒童、成人的外耳道分泌物中分離到凝固酶陰性葡萄球菌和類棒狀桿菌，且均以葡萄球菌的檢出率最高，占60%以上[19-20]。譚振文等[7]從健康小學(xué)生的油耵聹(即濕型外耳道分泌物)中也檢測出葡萄球菌。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)存在局限性，利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)等技術(shù)能更全面分析外耳道分泌物的菌群種類。王悅穎[9]采用PCR-變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)，對60～75歲的健康老年人和老年性耳聾患者的外耳道細(xì)菌種類進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌為表皮葡萄球菌、里昂葡萄球菌等。另有研究通過16S rRNA基因測序發(fā)現(xiàn)，外耳道含有大量的耳炎差異球菌、葡萄球菌和銅綠假單胞菌[21-22]。本研究對76例耳濕型外耳道分泌物進(jìn)行分離培養(yǎng)，94.7%的樣本來自19～22歲健康大學(xué)生志愿者，共20種細(xì)菌，其中葡萄球菌多達(dá)14種，均為凝固酶陰性，主要為頭葡萄球菌、耳葡萄球菌、人葡萄球菌和表皮葡萄球菌，約占總株數(shù)80%。同時，對左、右耳兩組菌株數(shù)量、種類的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，其中左、右耳菌群數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異，而細(xì)菌種類差異具有統(tǒng)計學(xué)差異，為耳道微生物研究選擇單耳或雙耳采集樣本提供參考依據(jù)。上述研究提示，經(jīng)分離培養(yǎng)檢測，不同國家、不同年齡段健康人群外耳道分泌物中主要存在凝固酶陰性葡萄球菌，且以表皮葡萄球菌最為常見，本研究結(jié)果與此一致。但利用PCR、16S rRNA等方法可檢測出更多種類細(xì)菌，如耳炎差異球菌、銅綠假單胞菌等。葡萄球菌作為健康人機(jī)體的正常菌群，常寄居于皮膚、口腔、腸道等部位[23]，當(dāng)宿主的衛(wèi)生狀況、免疫狀態(tài)、皮膚屏障功能等處于完好或正常的狀態(tài)時并不致病，但當(dāng)細(xì)菌集聚部位改變、機(jī)體抵抗力降低或菌群失調(diào)等狀況影響宿主時，葡萄球菌可能成為致病菌，引發(fā)靜脈導(dǎo)管感染、血流感染，甚至敗血癥等[10,24]。例如，表皮葡萄球菌對于無癥狀帶菌者來說屬于無致病性的常駐微生物，但當(dāng)皮膚屏障受到破壞且皮膚消毒不徹底時，表皮葡萄球菌可侵入血液引發(fā)血流感染[25]。另有研究表明，作為外耳道的常駐菌群，凝固酶陰性葡萄球菌在慢性化膿性中耳炎與外耳道炎患者的耳道分泌物中也常被檢出，且檢出率在革蘭陽性球菌中排第2位[26-27]，這可能與外耳道作為中耳微生物庫有關(guān)[21]。

藥物敏感性試驗(yàn)可幫助臨床合理使用抗菌藥物，也是監(jiān)測細(xì)菌耐藥性的重要手段。從濕型耳道分泌物中分離細(xì)菌并對其進(jìn)行藥物敏感性分析，結(jié)果顯示，分離率排前4位的葡萄球菌對臨床常用的頭孢吡肟、妥布霉素、米諾環(huán)素和氧氟沙星等抗生素的敏感率在90.0%以上，對青霉素和復(fù)方新諾明具有一定耐藥性，但低于50.0%。然而在對慢性化膿性中耳炎患者的研究報道中提示，從耳道分泌物分離到的表皮葡萄球菌對青霉素的耐藥率均高于80.0%，且對紅霉素、克林霉素耐藥率高于50.0%[28-29]。這與從健康人中分離到的表皮葡萄球菌耐藥率存在一定差異，可能與臨床上長期使用抗生素導(dǎo)致其耐藥性提高有關(guān)。

青霉素常用于治療敏感菌所致的感染。近年來隨著抗生素的大量使用，青霉素耐藥率呈上升趨勢。有研究報道，在醫(yī)院感染的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌中，其耐藥率常高于70.0%[30-32]。目前導(dǎo)致青霉素耐藥的機(jī)制主要涉及β-內(nèi)酰胺酶、青霉素結(jié)合蛋白、mecA基因、mecC基因、主動外排系統(tǒng)等[33-35]，其中β-內(nèi)酰胺酶可水解青霉素類使其滅活，為最常見的耐藥機(jī)制。據(jù)文獻(xiàn)報道，從臨床標(biāo)本分離的葡萄球菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶率可達(dá)80.0%，從化膿性中耳炎的耳膿液中分離的金黃色葡萄球菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶率為84.6%[36-38]。本研究從健康人耳道分離的葡萄球菌對青霉素的耐藥率較高，但通過頭孢硝噻吩紙片測得青霉素耐藥株β-內(nèi)酰胺酶的陽性率為44.0%，提示β-內(nèi)酰胺酶陰性菌株可能由其他機(jī)制介導(dǎo)耐藥，有待進(jìn)一步研究。分離到的4株桿菌中，陰道加德納菌和尿放線桿菌均對臨床常見的抗生素具有一定敏感性，而成團(tuán)泛菌對苯唑西林、萬古霉素和克林霉素等抗生素，以及大腸埃希菌對復(fù)方新諾明具有一定耐藥性。由于菌株數(shù)量較少，需擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步分析。本研究對健康人濕型外耳道分泌物的細(xì)菌數(shù)量、種類及其藥物敏感性進(jìn)行了初步探討，為濕型耳道微生物數(shù)量和種類的基線研究提供依據(jù)。但因樣本數(shù)量較少，存在一定局限性，仍需擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步的深入研究，以期為健康人外耳道微生物組研究奠定基礎(chǔ)。