樊 霞 姜訓(xùn)鵬 賈 錚 肖志明 李 蘭 李 陽(yáng) 劉曉露

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京），北京100081；2.中糧飼料有限公司，北京100020）

來(lái)源于乙醇工業(yè)副產(chǎn)物的玉米干全酒精糟（即Distillers's Dried Grains with Solubles，簡(jiǎn)稱DDGS）是一種重要的蛋白質(zhì)飼料原料，每年國(guó)內(nèi)飼料消耗量可達(dá)300 萬(wàn)噸以上。確定氨基酸組成含量是判定蛋白飼料原料質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，但國(guó)內(nèi)外乙醇生產(chǎn)設(shè)備和工藝類型存在較大差異，導(dǎo)致不同來(lái)源和批次玉米DDGS 中氨基酸含量的差異較大[1-2]。快速測(cè)定玉米DDGS氨基酸含量成為飼料和養(yǎng)殖行業(yè)在高效利用玉米DDGS中的迫切需求。

眾多氨基酸含量測(cè)定方法中，高效液相色譜方法、離子交換色譜法、毛細(xì)管電泳法多作為氨基酸同步測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法和仲裁方法，雖然方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，但使用的儀器昂貴、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)能力要求高?；貧w方程法是基于常規(guī)成分（粗蛋白、粗纖維、粗灰分和干物質(zhì)等）與氨基酸含量的相關(guān)關(guān)系，建立了一元或多元的回歸預(yù)測(cè)方程，用于獲取氨基酸含量，此種間接方法快速、儀器常規(guī)，但預(yù)測(cè)誤差較大[3]。近紅外光譜法（Near Infrared Spectroscopy，NIRS）利用含氫基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)在近紅外譜區(qū)的分子振動(dòng)吸收，測(cè)定樣品中多種化學(xué)成分的一項(xiàng)高通量分析技術(shù)，具有非破壞性、綠色環(huán)保和分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。NIRS 是一種經(jīng)驗(yàn)方法，為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的檢測(cè)分析，需要研究構(gòu)建具有廣泛代表性的定量分析模型。近些年來(lái)，大量學(xué)者和機(jī)構(gòu)組織都在構(gòu)建氨基酸定量分析模型上進(jìn)行了巨大投入[4-5]。魚粉[6]、大豆粕[7]、菜籽粕[8]、動(dòng)物源性副產(chǎn)物[9-10]、油菜籽餅粕[10-11]、玉米[12]、小麥[13]、高粱[10]、米糠[10]、玉米蛋白粉[10]等飼料原料和成品[14]已見諸多報(bào)道，但尚未見玉米DDGS 的氨基酸定量分析模型構(gòu)建研究。本文采集國(guó)內(nèi)外不同工藝、不同年份和不同產(chǎn)地的具有代表性的玉米DDGS 樣品，利用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定氨基酸含量，借助光柵型近紅外光譜儀采集近紅外漫反射光譜，構(gòu)建了18 種氨基酸的定量分析模型，為玉米DDGS 中氨基酸含量的快速獲取提供了一種高效、可靠的分析方法。

1 材料與方法

1.1 代表性樣品采集與預(yù)處理

廣泛采集來(lái)源于美國(guó)及國(guó)內(nèi)（遼寧、吉林、黑龍江、山東、安徽、四川和甘肅等省份）、不同等級(jí)具有代表性的玉米DDGS樣品，共110份。其中，低脂型玉米DDGS 共11 個(gè)，包含5 個(gè)一級(jí)，6 個(gè)二級(jí)；高脂型玉米DDGS共99個(gè)，其中28個(gè)一級(jí)，71個(gè)二級(jí)。

所有樣品均密封包裝，存貯于4 ℃的恒溫藥品冷藏箱中。試驗(yàn)開始前，取出樣品，放至室溫。采用四分法分為2份，裝入自封袋中，置于干燥陰涼處保存，一份用于18 種氨基酸參考值的獲取，一份用于近紅外光譜的掃描。在近紅外光譜掃描之前，樣品需經(jīng)德國(guó)Retsch 公司ZM200 型旋風(fēng)磨粉碎處理，并過(guò)40 目試驗(yàn)篩。

1.2 參考值的獲取

18 種氨基酸含量的測(cè)定按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法《飼料中氨基酸的測(cè)定》（GB/T 18246—2000）、《飼料中含硫氨基酸的測(cè)定 離子交換色譜法》（GB/T 15399—2018）和《飼料中色氨酸的測(cè)定》（GB/T 15400—2018）進(jìn)行。18 種氨基酸分別為天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys）和色氨酸（Trp）。每個(gè)樣品平行分析2 次，取平均值作為近紅外模型構(gòu)建的參考值。

1.3 近紅外光譜的掃描

利用丹麥FOSS公司的DS2500F光柵型近紅外光譜儀采集樣品的近紅外漫反射光譜，檢測(cè)器為硅（850～1 100 nm）和硫化鉛（1 100～2 500 nm），單臺(tái)儀器的波長(zhǎng)精確度＜0.005 nm，多臺(tái)儀器間波長(zhǎng)精確度＜0.02 nm。光譜掃描參數(shù)設(shè)置為：光譜掃描范圍850～1 099 nm和1 100～2 499 nm，光譜分辨率0.5 nm,采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)3 300個(gè)，掃描速度約60 s/次。樣品重復(fù)裝樣掃描2 次，取2 次掃描光譜的平均值作為樣本的原始光譜。

1.4 近紅外定標(biāo)模型的建立與驗(yàn)證

采用Kenard-Stone（KS）法[15]，以樣品間歐式距離為劃分依據(jù)，按3∶1的數(shù)目比例，分為校正集和驗(yàn)證集，并保障驗(yàn)證集樣品參考值均在校正集樣品參考值的范圍內(nèi)。所選出的校正樣本能夠均勻地覆蓋整個(gè)樣本集的實(shí)驗(yàn)區(qū)域。

為消除樣品均勻度、樣品粒度、基線漂移和偏移、隨機(jī)噪音及周圍環(huán)境等非目標(biāo)因素對(duì)近紅外光譜造成的干擾，采用了導(dǎo)數(shù)處理、變量標(biāo)準(zhǔn)化、多元去散射校正等單一或組合方法預(yù)處理光譜。選擇偏最小二乘回歸法（Partial Least Squares Regression，PLS），在全波長(zhǎng)范圍內(nèi)，構(gòu)建不同氨基酸的定量分析模型。根據(jù)交互驗(yàn)證均方差最?。≧MSECV）的方法確定偏最小二乘方法的建模潛變量數(shù)（Latent Variables，LVs）。衡量模型定標(biāo)效果的參數(shù)為：校正集、全交互驗(yàn)證集、驗(yàn)證集的決定系數(shù)和均方差，分別用R2C、R2CV、R2P、RMSEC、RMSECV、RMSEP 縮寫表示。為預(yù)測(cè)模型的實(shí)際應(yīng)用效果，選用驗(yàn)證集的相對(duì)分析誤差RPD[16]作為參考指標(biāo)。所有的數(shù)據(jù)處理均在Matlab 7.0 軟件（The Math-Works, 美國(guó)）配合PLS_toolbox 6.7（Eigenvector research, 美國(guó)）工具包中實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米DDGS的18種氨基酸含量統(tǒng)計(jì)分析(見表1、圖1)

表1 樣本集與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中玉米DDGS氨基酸含量的對(duì)比(%)

圖1 玉米DDGS 18種氨基酸含量的箱線圖

玉米DDGS 18 種氨基酸含量的統(tǒng)計(jì)箱線圖如圖1 所示。谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸的含量相對(duì)較高，中位值分別為4.60%、3.13%和2.22%。蛋氨酸、胱氨酸和色氨酸含量相對(duì)較低，中位值分別為0.62%，0.49%和0.16%。18 種氨基酸的變異系數(shù)在6%～22%，均高于5%，且賴氨酸的變異系數(shù)最高為22%，與相關(guān)研究報(bào)道也一致[17]。玉米DDGS 由干酒精糟（Distillers Dried Grains，DDG）及可溶性酒精糟濾液（Distillers Dried Souble，DDS）組成。DDG 是玉米發(fā)酵提取酒精后的固態(tài)剩余物，主要包括蛋白、纖維、脂肪等；DDS 是可溶性酒精糟濾液，包括如發(fā)酵中產(chǎn)生的酵母、糖化物和未知的生長(zhǎng)因子等可溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。這兩種成分組成差異很大，且不同工藝、不同批次下組成比例變化大，顯著影響著玉米DDGS 中氨基酸的組成。

表1 為樣本集與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中高、低脂玉米DDGS 氨基酸含量的對(duì)比。樣本集中包含了110 份玉米DDGS 樣品，其中，低脂型和高脂型玉米DDGS，分別為11 個(gè)和99 個(gè)。表中樣本集數(shù)據(jù)為各類型玉米DDGS 不同氨基酸含量的中位值。參考數(shù)據(jù)庫(kù)分別為美國(guó)NRC2012[18]、法國(guó)飼料成分表INRA2004[19]和中國(guó)飼料成分與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表CFIC2018[20]。本樣本集和美國(guó)NRC 的數(shù)據(jù)均表明高低脂玉米DDGS 在氨基酸含量組成上具有差異，例如，谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸4 種氨基酸在低脂玉米DDGS 中的含量相對(duì)于其在高脂玉米DDGS的含量更高?？梢?，在構(gòu)建玉米DDGS的氨基酸近紅外定量分析模型中，需要獲取不同脂肪含量的玉米DDGS樣品，以增強(qiáng)樣本集的代表性。

2.2 玉米DDGS的近紅外特征光譜（見圖2）

玉米DDGS在近紅外譜區(qū)有明顯吸收峰，該區(qū)域光譜主要為C-H、N-H、O-H等鍵的倍頻及合頻吸收，如圖2所示。波長(zhǎng)1 450 nm和1 923～1 940 nm為水分O-H拉伸和H-O-H彎曲合頻的吸收譜帶。2 100 nm與淀粉中C-H基團(tuán)的伸縮和轉(zhuǎn)動(dòng)吸收有關(guān)。2 050 nm與2 180 nm處與蛋白或酰胺中N-H面內(nèi)彎曲和C-N拉伸的合頻振動(dòng)等密切相關(guān)。2 000～2 200 nm 譜區(qū)的譜圖形狀反映其蛋白與淀粉的相對(duì)含量上的差異性。高蛋白含量的飼料原料在2 050 nm 和2 180 nm處具有雙吸收峰[21]，在2 100 nm 淀粉吸收峰處為波谷；高淀粉含量飼料原料（如玉米）僅有2 100 nm淀粉吸收峰，并蛋白吸收峰被重疊。對(duì)比玉米DDGS的近紅外光譜，也可見因淀粉被提出，其2 100 nm 吸收峰明顯變?nèi)酢?/p>

2.3 18種氨基酸的近紅外定量分析模型(見表2)

表2 為玉米DDGS 中18 種氨基酸的最優(yōu)近紅外模型。從表2中可以看出：不同氨基酸的預(yù)測(cè)效果存在較大差異，例如天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、蛋氨酸、胱氨酸和色氨酸10種氨基酸定量分析模型校正集的決定系數(shù)在0.85～0.95，蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸和脯氨酸7 種氨基酸定量分析模型的決定系數(shù)在0.73～0.82，而賴氨酸定量分析模型的決定系數(shù)為0.62。其他飼料原料不同氨基酸的近紅外定量分析模型的預(yù)測(cè)效果也具有較大差異[6-8]，例如，魚粉中酪氨酸相對(duì)于魚粉中其他氨基酸更不易被NIRS 分析[6]。評(píng)價(jià)近紅外定量分析模型的精準(zhǔn)度取決于評(píng)估參數(shù)的合理選取。根據(jù)不同的研究和應(yīng)用目的，不同的模型評(píng)估參數(shù)會(huì)被用于評(píng)價(jià)近紅外模型。R2反映了參考值與分析結(jié)果的相關(guān)性，間接反映了不同氨基酸與近紅外特征譜峰的相關(guān)性，其值越接近1，相關(guān)性越高，預(yù)測(cè)能力越高。RMSEC、RMSECV 和RMSEP 分別代表校正集、交互驗(yàn)證集和預(yù)測(cè)集的殘差的均方差。一般來(lái)說(shuō)，R2C（或R2P）越接近1，RMSEC（或RMSECV、RMSEP）越小，表明模型的校正和預(yù)測(cè)精準(zhǔn)度越高，而小的RMSEC（或RMSECV、RMSEP）比大的決定系數(shù)更為重要[22]。18 種氨基酸模型的RMSEP 均在0.03～0.19，且僅谷氨酸和亮氨酸2 種氨基酸的RMSEP＞0.10，其余氨基酸均≤0.10，可見本研究模型能夠?qū)崿F(xiàn)玉米DDGS 中多種氨基酸含量的快速獲取。

3 結(jié)語(yǔ)

氨基酸是構(gòu)成生命體的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是決定飼料和畜牧行業(yè)高效利用玉米DDGS 的重要因素。本文采集國(guó)內(nèi)外不同工藝、不同年份和不同產(chǎn)地的具有代表性的110份玉米DDGS樣品，構(gòu)建了玉米DDGS的18 種氨基酸的近紅外定量分析模型，模型RMSEP均在0.03～0.19，可實(shí)現(xiàn)玉米DDGS中多種氨基酸含量的快速獲取。