曹春紅 李 爽 王海燕 張廣民 蔡輝益

（1.天津挑戰(zhàn)博德生物技術有限公司，天津301906；2.生物飼料開發(fā)國家工程研究中心，北京100081）

蛋白酶是水解蛋白質肽鏈的一類酶的總稱，可分為酸性蛋白酶（pH 值2.5～3）、中性蛋白酶（pH 值6.5～7.5）和堿性蛋白酶（pH值10.5）3種[1-2]。中性蛋白酶是最早被發(fā)現，并且在飼料工業(yè)、釀酒釀造、制藥工業(yè)、化妝品、洗滌劑、毛皮軟化等領域中被廣泛使用[3-10]。國內外學者對蛋白酶的研究結果表明，發(fā)酵工藝不同，同一菌株的酶活力有較大的差異，酶活力的高低直接影響蛋白酶的經濟效益。因此，提高蛋白酶發(fā)酵水平是很有必要的。最近幾年，國內外關于提高蛋白酶發(fā)酵酶活力的研究有了較大進展，如曾誠等[11]報道的解淀粉芽孢桿菌所產中性蛋白酶活力為6 984.3 U/ml。

本研究所采用的產中性蛋白酶菌株為解淀粉芽孢桿菌，該解淀粉芽孢桿菌具有較高的產中性蛋白酶能力。通過單因素實驗和正交實驗對該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行了優(yōu)化，選擇出廉價且適合工業(yè)化使用的培養(yǎng)基原料，同時優(yōu)化培養(yǎng)條件，提高酶活力，達到降低發(fā)酵成本、提高中性蛋白酶的發(fā)酵酶活力的目的，為其工業(yè)化生產奠定扎實基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

解淀粉芽孢桿菌YF03，由天津挑戰(zhàn)博德生物技術有限公司實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉1%、瓊脂2%，pH值7.0～7.2。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉1%，pH值7.0～7.2。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖3%、豆粕2%、麩皮2%、KH2PO40.4%、Na2HPO40.05%。

1.3 培養(yǎng)方法

將解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）YF03 在斜面上37 ℃培養(yǎng)24 h 后，接至種子培養(yǎng)基中，并于搖床37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)8 h，以5%的接種量轉至發(fā)酵培養(yǎng)基(100 ml/500 ml三角瓶)中，30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.4 分析方法

1.4.1 中性蛋白酶活力的測定

按照GB/T 28715—2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定分光光度法》進行酶活力的測定。

1.4.2 菌體生物量的測定

取一定體積的菌液在600 nm 測定其吸光值，即菌體的生物量。

1.5 主要試劑

碳酸鈉溶液、三氯乙酸溶液、福林(Folin)試劑、磷酸緩沖液（pH值7.2）、1%中性酪蛋白溶液(pH值7.2)。

2 結果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 不同碳源對菌株產酶活力的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中3%葡萄糖分別替換成玉米粉、可溶性淀粉、甘油、蔗糖，其發(fā)酵產酶活力結果如圖1所示。

由圖1 可以看出，菌株YF03 對玉米粉和葡萄糖的利用效果均較好。初始發(fā)酵培養(yǎng)基中以葡萄糖為碳源，發(fā)酵結束時酶活力為4 230 U/ml，通過比較可以看出玉米粉為碳源的酶活力更高，為5 205 U/ml。而且玉米粉價格低廉，因此選擇玉米粉作為YF03 發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。當以蔗糖、可溶性淀粉等為碳源時菌株產酶能力較低。這是因為易于被微生物利用的碳源或氮源有助于細胞生長，難以被微生物直接利用的碳源或氮源則有助于產酶[12]。

圖1 不同碳源對菌株產蛋白酶活力的影響

2.1.2 不同碳源含量對菌株產酶活力的影響

將玉米粉作為碳源，添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%，經搖瓶培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液中中性蛋白酶活力，結果如圖2所示。

圖2 玉米粉含量對菌株產蛋白酶活力的影響

從圖2 可知，當玉米粉含量低于5%時，隨著玉米粉含量的升高，中性蛋白酶的酶活力越高。玉米粉含量為5%時，發(fā)酵產生的中性蛋白酶活力最高，為6 360 U/ml。因此，初步確定菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的玉米粉含量為5%。

2.1.3 不同氮源對菌株產酶活力的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中2%豆粕分別替換成豆餅粉、魚粉、玉米蛋白粉、棉粕、氯化銨，經搖瓶培養(yǎng)后，檢測發(fā)酵液中性蛋白酶活力，結果如圖3所示。

通過比較幾種常見氮源對YF03產中性蛋白酶的影響，可以看出，菌株對棉粕的利用效果最好，發(fā)酵酶活力為7 230 U/ml，其次是豆餅粉、豆粕，對氯化銨、玉米蛋白粉、魚粉的利用效果不是很明顯。棉粕和豆餅粉相比，價格上低于豆餅粉，且大豆多依賴于進口、易受國際經貿的影響，而棉粕在供應和價格上比較穩(wěn)定。因此選用棉粕作為YF03發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖3 不同氮源對菌株產蛋白酶活力的影響

2.1.4 不同氮源含量對菌株產酶活力的影響

將棉粕作為氮源，添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%，經搖瓶培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液中中性蛋白酶活力，結果如圖4所示。

圖4 棉粕含量對菌株產蛋白酶活力的影響

由圖4可知，當棉粕含量低于3%時，隨著棉粕含量的升高，發(fā)酵液中性蛋白酶活力越高；當棉粕含量高于3%時，棉粕含量越高，酶活力越低，可能是棉粕含量過高，導致培養(yǎng)基中碳源、氮源比例不合適。因此可以初步確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適氮源含量為3%，此時酶活力為7 899 U/ml。

2.1.5 不同麩皮含量對產酶活力的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加1%、2%、3%、4%、5%的麩皮，經搖瓶培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液中中性蛋白酶活力，結果如圖5所示。

由圖5可知，當麩皮含量為2%時，菌株對其利用效果最好，產生的中性蛋白酶活力最高，為7 921 U/ml。因此可以確定菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中麩皮的含量為2%。

圖5 麩皮含量對菌株產蛋白酶活力的影響

2.1.6 不同金屬離子對產酶活力的影響

分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1% CaCl2、0.5% Ca-Cl2、0.1% MgSO4、0.5% MgSO4、0.1% ZnSO4、0.5% Zn-SO4、0.1% FeSO4、0.5% FeSO4、0.01% MnCl2、0.1% Mn-Cl2，經搖瓶培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液中中性蛋白酶活力，結果如圖6所示。

由圖6 可以看出，與對照組相比，培養(yǎng)基中添加0.1% MgSO4時發(fā)酵生成的中性蛋白酶活力提高11%，為8 746 U/ml。當MgSO4含量提高為0.5%時，反而不利于酶的生成。芽孢桿菌的代謝網絡中主要包括EMP 途徑、HMP 途徑和TCA 循環(huán)，Mg2+是其代謝酶的輔助因子，而且Mg2+參與微生物細胞壁的形成，Mg2+是細胞生長所必需的金屬離子[13-14]，所以硫酸鎂對菌株產酶活力的促進作用最明顯。

圖6 不同金屬離子對菌株產蛋白酶活力的影響

培養(yǎng)基中添加0.01% MnCl2，發(fā)酵生成的中性蛋白酶活力提高5%。Mn2+是該中性蛋白酶中的活性中心，MnCl2對菌株產中性蛋白酶活力有激活的作用。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基配方的正交實驗優(yōu)化

以玉米粉、棉粕、麩皮和硫酸鎂含量為影響因子，設計L9(34)正交實驗，以確定菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配比，其他條件選取以上單因素實驗的最優(yōu)結果。正交實驗因素與水平見表1，正交結果見表2。

表1 正交實驗因素水平

由表2 可知，各因素影響作用按大小排列為：A＞B＞C＞D。對正交實驗結果方差分析可知，FA＞FB＞FC＞FD，即培養(yǎng)基中玉米粉含量對解淀粉芽孢桿菌產酶活力的影響最大，硫酸鎂含量對解淀粉芽孢桿菌產酶活力影響最小，但在α = 0.05 水平上都不顯著，這可能是由于各因素水平間距較小造成的。理論優(yōu)化組合為A2B2C3D1，即玉米粉5%、棉粕3%、麩皮3%、MgSO40.1%。在該條件下，解淀粉芽孢桿菌的產中性蛋白酶活力為9 200 U/ml。

2.3 菌株發(fā)酵產酶活力培養(yǎng)條件的優(yōu)化

表2 正交實驗結果

2.3.1 菌株生長曲線的繪制

將菌株接種于50 ml LB培養(yǎng)液中，在搖床37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。每隔1 h取樣，并在600 nm下測定其吸光度值，用未接種的培養(yǎng)液做空白對照。以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制菌體生長曲線(見圖7)。

圖7 菌體的生長曲線

由圖7 可以看出，菌株YF03 的對數生長期為4～8 h，因此在研究發(fā)酵條件對菌株產酶活力的影響時，選擇8 h的菌液進行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.3.2 培養(yǎng)基發(fā)酵起始pH值的影響

pH 值主要是通過影響微生物細胞的帶電狀態(tài)、氧化還原電位等，進而影響到微生物對營養(yǎng)物質的吸收及酶的分泌。培養(yǎng)基的初始pH值對微生物產生特定的代謝物也有很大影響。實驗中設定初始pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，經搖瓶培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液中性蛋白酶活力，結果如圖8所示。

圖8 培養(yǎng)基發(fā)酵初始pH值對菌株產中性蛋白酶活力的影響

從圖8 可以看出，在設定范圍內，隨pH 值的升高，酶活力先升高后降低，在pH 值為7.0 時培養(yǎng)基中蛋白酶分泌能力最強，酶活力為9 500 U/ml。所以，培養(yǎng)基起始pH值設定為7.0。

2.3.3 培養(yǎng)溫度的影響

搖瓶的發(fā)酵溫度直接影響菌體的生長，同時影響菌體產酶速度。實驗中設置溫度分別為25、30、37、40、45 ℃，經搖瓶培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液中性蛋白酶活力，結果如圖9所示。

從圖9 可以看出，在設定溫度范圍內，30 ℃是該菌株最適發(fā)酵溫度。發(fā)酵溫度過低，不利于菌株生長，發(fā)酵酶活力也低；發(fā)酵溫度過高，菌株衰老加快、蛋白酶穩(wěn)定性變差、蛋白酶自溶增加，酶活力迅速降低。因此選擇30 ℃作為培養(yǎng)溫度，此條件下酶活力為15 403 U/ml。

圖9 培養(yǎng)溫度對菌株產中性蛋白酶活力的影響

2.3.4 接種量的影響

接種量的大小影響著菌株的繁殖速度。一般情況下，接種量越大，延滯期越短。然而接種量過大會使培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質過快地被消耗，代謝廢物增多，對菌株產酶產生抑制作用[10]。實驗中設置接種量分別為2%、3%、4%、5%、6%，經搖瓶培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液中性蛋白酶活力，結果如圖10所示。

圖10 接種量對菌株產中性蛋白酶活力的影響

如圖10所示，隨著接種量的增加，中性蛋白酶活力也增加。當接種量為5%時，中性蛋白酶活力達到最高值16 700 U/ml。接種量繼續(xù)增加，中性蛋白酶活力反而下降。實驗結果說明接種量過大、過小都會影響到酶的產量，過小會引起菌株長勢較慢、產酶能力低，而過大又會造成溶氧不足，根據實驗結果最終選擇5%的接種量。

2.3.5 培養(yǎng)時間的影響

隨著發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分會隨著菌體的繁殖、生長、消耗發(fā)生變化，實驗中設置培養(yǎng)時間分別為12、24、36、48、60、72 h，經搖瓶培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液中性蛋白酶活力，結果如圖11所示。

圖11 培養(yǎng)時間對菌株產中性蛋白酶活力的影響

如圖11所示，在培養(yǎng)初期，中性蛋白酶活力隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加，在菌株發(fā)酵培養(yǎng)48 h時，中性蛋白酶活力達到最高值16 523 U/ml，然后又有所降低。酶活力的降低可能是由于解淀粉芽孢桿菌代謝的一些雜酶對蛋白酶產生一定的降解造成的。而且隨著發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質被不斷消耗，在營養(yǎng)物質匱乏的條件下菌株可能以自身產生的蛋白酶為底物進行降解。因此選擇48 h 作為發(fā)酵培養(yǎng)的最佳產酶時間。

2.3.6 搖瓶裝液量的影響

在搖床轉速相同的條件下，裝液體積直接影響著菌株的氧氣供給。在發(fā)酵過程中，提供充足氧分條件對于產酶活力的提高起著重要的作用。因此，分別在500 ml三角瓶中裝入50、100、150、200、250 ml的發(fā)酵培養(yǎng)基，經培養(yǎng)后測定發(fā)酵液的酶活力，結果如圖12所示。

如圖12 所示，當搖瓶的裝液量為100 ml/500 ml時，此時中性蛋白酶活力達最高值16 826 U/ml，裝液量過大，菌株通氣狀況變差，所以，選擇100 ml/500 ml這一裝液量作為菌株發(fā)酵產蛋白酶的最佳搖瓶裝液量。

圖12 搖瓶裝液量對菌株產中性蛋白酶活力的影響

3 討論

蛋白酶是三大酶制劑之首，其銷量占全世界酶制劑銷量的60%。最近幾年，國內外學者在產蛋白酶菌株選育、提高發(fā)酵水平等方面已取得較大的研究進展，但蛋白酶的工業(yè)化生產，仍然存在產量低、成本高的問題，這在很大程度上制約著蛋白酶的大規(guī)模生產與應用。因此，選育高產蛋白酶菌株并優(yōu)化培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件顯得尤為重要。

本研究選取的出發(fā)菌株是經過選育獲得的較高發(fā)酵水平的解淀粉芽孢桿菌，通過優(yōu)化碳源、氮源的種類和濃度，選擇玉米粉和棉粕分別作為碳源、氮源。目前菌株發(fā)酵產蛋白酶的主要碳源、氮源是葡萄糖、豆粕[11，13，15]，試驗中選擇玉米粉代替葡萄糖、棉粕替代豆粕，不僅酶活力有顯著提高，而且玉米粉、棉粕來源廣泛、價格低廉。

枯草芽孢桿菌產生的中性蛋白酶多數是金屬蛋白酶，其酶活性主要依賴于某種二價金屬陽離子（如Zn2+、Mg2+、Ca2+等），這些金屬離子對酶起激活或保護作用，而某些非依賴性陽離子會抑制酶活性[16]。解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，因此試驗研究Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+等離子對菌株產酶活力的影響。結果表明，Mg2+、Mn2+對菌株產酶起到了激活作用。

本研究在優(yōu)化后培養(yǎng)基前提下，分別從發(fā)酵初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時間、搖瓶裝液量幾方面優(yōu)化發(fā)酵條件，得出最適的產酶條件，發(fā)酵條件優(yōu)化后的酶活力16 826 U/ml 是優(yōu)化前酶活力9 200 U/ml的1.83倍。經過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最終發(fā)酵酶活力是初始發(fā)酵酶活力4 230 U/ml的3.98倍。

4 結論

通過單因素實驗和正交實驗，確定解淀粉芽孢桿菌YF03菌株最適培養(yǎng)基配方為玉米粉5%、棉粕3%、麩皮3%、KH2PO40.4%、Na2HPO40.05%、MgSO40.1%、MnCl20.01%。通過單因素實驗，確定了YF03菌株最適搖瓶培養(yǎng)條件為初始pH 值7.0、種齡8 h、接種量5%、裝液量100 ml/500 ml、30 ℃、240 r/min培養(yǎng)48 h，此時發(fā)酵液中性蛋白酶活力最高，為16 826 U/ml，是初始發(fā)酵酶活4 230 U/ml的3.98倍。