虞惠貞，侯寒黎，尹文秀，張荃，孫超，張明哲，張曉峰，苗麗，吳姍*

（1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，杭州 310012；2.錢(qián)江海關(guān)，杭州 310007；3.鄭州海關(guān)技術(shù)中心，鄭州 450003）

經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下的商品摻假現(xiàn)象層出不窮，其中食品摻假問(wèn)題更是引起消費(fèi)者的普遍關(guān)注。近年來(lái)，肉和肉制品摻雜摻假事件頻頻被媒體曝光，不法分子將價(jià)格相對(duì)低廉的豬肉、雞肉、鴨肉，甚至不宜食用的狐貍?cè)?、馬肉等冒充牛肉、羊肉、驢肉進(jìn)行銷(xiāo)售。魚(yú)及魚(yú)類(lèi)制品市場(chǎng)也魚(yú)龍混雜，用食用后導(dǎo)致腹瀉的“油魚(yú)”（學(xué)名“異鱗蛇鯖”或“棘鱗蛇鯖”）冒充鱈魚(yú)；用淡水虹鱒替代深海大西洋鮭魚(yú)等。魚(yú)肉加工成肉塊或肉糜之后，從外形上較難進(jìn)行種類(lèi)鑒定，若再進(jìn)一步加工成魚(yú)罐頭、魚(yú)松、魚(yú)腸、魚(yú)丸等深加工產(chǎn)品則摻假摻雜的概率更高。

物種的特異性核酸序列檢測(cè)是實(shí)現(xiàn)食品真?zhèn)舞b別常用的手段，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RTPCR）方法都是目前較常用的鑒別方法。雖然較普通PCR方法已經(jīng)省卻了電泳檢測(cè)的步驟，但RTPCR技術(shù)也存在檢測(cè)通量的局限，如一般檢測(cè)3重或者4重PCR就達(dá)到了該方法檢測(cè)通量的極限。若一味追求檢測(cè)通量，同一RT-PCR反應(yīng)體系中加入過(guò)量的引物探針組合，導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低的同時(shí)，往往會(huì)引發(fā)引物的錯(cuò)配，最終導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度雙雙下降。

TaqMan微流控陣列（TaqMan?array microfluidic cards）技術(shù)是將單重?zé)晒舛縋CR（individual RTPCR,IRTP）的引物和探針固定在一個(gè)反應(yīng)孔中，再將眾多不同引物探針的反應(yīng)孔整合在一張芯片上形成一個(gè)反應(yīng)陣列，可同時(shí)對(duì)12～384個(gè)樣本，針對(duì)不同目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)引物探針組合的多少，同步檢測(cè)的基因達(dá)數(shù)十或幾十種不等。TaqMan微流控陣列技術(shù)保留了RT-PCR的靈敏度和準(zhǔn)確度，同時(shí)又可同步、快速地檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)基因，但該技術(shù)的檢測(cè)成本和RT-PCR及測(cè)序比較并無(wú)優(yōu)勢(shì)可言。目前，該技術(shù)較廣泛用于醫(yī)學(xué)疾病的診斷，如ONYANGO等[1]針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的急性感染開(kāi)發(fā)了一種可檢測(cè)21種病原體的TaqMan微流控陣列檢測(cè)方法；LIU等[2]則開(kāi)發(fā)了可用于同時(shí)檢測(cè)19種腸道病原體的TaqMan微流控陣列板。此外，該技術(shù)還被用于耐藥突變的研究[3]、髓母細(xì)胞瘤亞群分析[4]、癌變細(xì)胞[5-6]和干細(xì)胞[7]內(nèi)的表達(dá)差異性分析等。PHOLWAT等[3]開(kāi)發(fā)了TaqMan微流控陣列溶解曲線技術(shù)，即同時(shí)應(yīng)用探針和溶解曲線2種方法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)2種結(jié)果的比對(duì)，對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行雙重驗(yàn)證，但該方法在醫(yī)學(xué)以外的領(lǐng)域應(yīng)用尚少。本研究將TaqMan微流控陣列技術(shù)應(yīng)用到食品真?zhèn)舞b別檢測(cè)中，將不同物種特異性的引物探針集合在同一個(gè)TaqMan微流控陣列上，實(shí)現(xiàn)多物種成分同步檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所涉及的樣品信息如表1所示。

1.2 樣品的DNA抽提

1.2.1 動(dòng)植物樣品DNA的提取

動(dòng)植物樣品的前處理：將剪碎的固體樣品放入帶有磁珠（Φ=3 mm，Sigma公司，美國(guó)）的2 mL試管（Sarstedt公司，德國(guó)）中，用FastPrep?-24振蕩研磨儀（MP Biomedicals公司，美國(guó)）以5 500 r/min振蕩研磨20 s，重復(fù)4次。

取上述研磨后的樣品50 mg，用FF3750抽提試劑盒（Promega公司，美國(guó)）進(jìn)行DNA抽提，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后抽提得到DNA固體樣品，溶解在30 μL去離子水中，后續(xù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將DNA溶液稀釋至不同濃度。

表1 用于檢測(cè)的樣品信息Table 1 Sample-tested information

1.2.2 微生物樣品DNA的提取

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液離心，去上清液，用QIAamp DNA迷你試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)）提取沉淀中菌的DNA，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后將得到的DNA根據(jù)濃度需要溶解在20 μL去離子水中，后續(xù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將DNA溶液稀釋至不同濃度。

DNA濃度用NanoDrop ND-1000紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（Thermo Scientific公司，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)定。

1.3 單重?zé)晒舛縋CR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：10 μLTaqMan 2×PCR反應(yīng)混合物，上游引物（10 pmol/μL）0.4 μL，下游引物（10 pmol/μL）0.4 μL，探針（10 pmol/μL）0.4 μL，調(diào)節(jié)為 5～10 ng/μL 的DNA溶液1 μL，用ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。采用ViiATM7熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國(guó)）進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)4次。檢測(cè)結(jié)果用循環(huán)閾值（cycle threshold,CT）表示。在靈敏度分析中檢測(cè)得到的CT≤35時(shí)為陽(yáng)性，4次結(jié)果中3次或3次以上結(jié)果為陽(yáng)性，則表示可檢測(cè)到該濃度。

反應(yīng)所用的引物和探針由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，探針的5′端用6-羧基熒光素（6-carboxyfluorescein,FAM）標(biāo)記，3′端以BHQ1為淬滅基團(tuán)。

1.4 TaqMan微流控陣列設(shè)計(jì)

本研究中TaqMan微流控陣列采用的是384孔板的TaqMan低密度陣列（TaqMan low density array,TLDA）（Applied Biosystems公司，美國(guó)），每個(gè)板上有8列，每列含48孔，每個(gè)基因占2個(gè)孔，可檢測(cè)24種（類(lèi)）對(duì)應(yīng)的物種。在對(duì)微流控陣列板進(jìn)行特異性驗(yàn)證時(shí)，板上設(shè)置1列陰性對(duì)照（Ctrl），即該列的樣品不含目標(biāo)物種的DNA，其他7道（S1～S7）用于樣品檢測(cè)。在對(duì)微流控陣列板進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證時(shí)，不設(shè)陰性對(duì)照列，Ctrl列也作為檢測(cè)列（S0）（圖1）。檢測(cè)的目標(biāo)物種見(jiàn)圖1，包括10類(lèi)哺乳動(dòng)物、7種禽類(lèi)、5種魚(yú)類(lèi)，以及1個(gè)“真核生物”和1個(gè)“哺乳動(dòng)物”的檢測(cè)孔。“真核生物”可作為檢測(cè)DNA質(zhì)量的內(nèi)參基因；“哺乳動(dòng)物”可作為當(dāng)所列物種都為陰性，唯有“真核生物”和“哺乳動(dòng)物”為陽(yáng)性時(shí)的篩選基因，為下一步檢測(cè)縮小物種范圍。此外，需要說(shuō)明的是，除了“哺乳動(dòng)物”和“真核生物”的引物探針外，陣列中其他的引物探針組合所針對(duì)的也可能并非一個(gè)物種，而是幾個(gè)物種，如“鱈魚(yú)”的引物探針，可同時(shí)檢測(cè)大西洋鱈、太平洋鱈等。本研究所設(shè)計(jì)的引物探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的物種以及所有物種的引物探針序列見(jiàn)表2。

1.5 TaqMan微流控陣列檢測(cè)步驟

圖1 TaqMan低密度陣列板的設(shè)計(jì)Fig.1 Layout of TLDA

微流控陣列檢測(cè)采用ViiATM7熒光定量PCR儀和TaqPath ProAmp預(yù)混液（Applied Biosystems公司，美國(guó)）。將80 μL預(yù)混液和相應(yīng)的20 μL DNA混合，加入每一個(gè)檢測(cè)列，使得每一個(gè)孔的引物探針濃度和DNA質(zhì)量濃度與單重?zé)晒舛縋CR在數(shù)量級(jí)上保持一致，如以S1列為例，在單重目標(biāo)熒光定量PCR反應(yīng)中加入10 ng的目標(biāo)物種DNA，在S1列中要使每個(gè)反應(yīng)孔的目標(biāo)物種DNA為10 ng，則需要將7種檢測(cè)目標(biāo)物種（表3）的DNA質(zhì)量濃度均調(diào)整為80 ng/μL左右，每種各取3 μL，其他列的以此為例對(duì)取樣的濃度和體積進(jìn)行計(jì)算。但“哺乳動(dòng)物”和“真核生物”涉及多物種，因此“哺乳動(dòng)物”和“真核生物”例外，無(wú)法調(diào)節(jié)加樣板濃度與熒光定量PCR的一致。加樣后，以366g離心2次，每次1 min；封口，放入ViiATM7熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)程序如下：45℃去污染10 min；94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，60℃延伸1 min，45個(gè)循環(huán)。

1.6 TaqMan微流控陣列重復(fù)性與特異性驗(yàn)證

準(zhǔn)備1組非目標(biāo)物種成分的DNA樣品（N），作為陰性對(duì)照，加入Ctrl列；另外準(zhǔn)備6組DNA樣品，根據(jù)DNA樣品所含物種加入到對(duì)應(yīng)的列（S1～S6）中（表3）。S1和S2、S3和S4、S5和S6分別加入了相同目標(biāo)物種的DNA，但在22種（類(lèi)）目標(biāo)物種外，在S2、S4、S6列中又增加了另外4種非目標(biāo)物種的DNA，包括1種哺乳動(dòng)物（梅花鹿）、1種鳥(niǎo)類(lèi)（麻雀）、1種魚(yú)類(lèi)（細(xì)鱗壯鱈）和1種植物（水稻），以此檢測(cè)非目標(biāo)DNA是否會(huì)干擾目標(biāo)DNA，從而影響檢測(cè)結(jié)果。而S7列中加入的物種皆為22種（類(lèi)）目標(biāo)物種以外的物種（表3），理論上只能在哺乳動(dòng)物和真核生物的檢測(cè)孔中得到陽(yáng)性結(jié)果。哺乳動(dòng)物和真核生物由于涉及的檢測(cè)物種較多，而檢測(cè)的目標(biāo)基因在不同物種中的拷貝數(shù)也未必相同，因此，對(duì)于哺乳動(dòng)物和真核生物的檢測(cè)孔，不進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證。重復(fù)檢測(cè)3塊板。在進(jìn)行微流控陣列的重復(fù)性和特異性驗(yàn)證時(shí)，每個(gè)目標(biāo)物種的DNA在每個(gè)加樣孔的質(zhì)量為10 ng左右。

表2 本研究中引物和探針序列Table 2 Sequences for primers and probes used in this study

1.7 TaqMan微流控陣列靈敏度驗(yàn)證

比較TaqMan微流控陣列和單重?zé)晒舛縋CR（IRTP）的檢測(cè)靈敏度?？紤]到一個(gè)DNA樣品中涉及的物種越多，不同的DNA間會(huì)存在競(jìng)爭(zhēng)和干擾，從而影響目標(biāo)物種PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，因此，在對(duì)微流控陣列進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證時(shí)，我們采取了如表4所示的加樣組合，使一個(gè)加樣孔中涉及的物種減少至5～6種，但若再減少物種數(shù)量，則一塊加樣板內(nèi)無(wú)法檢測(cè)所有的目標(biāo)基因，且檢測(cè)成本也會(huì)增大。設(shè)置的質(zhì)量濃度低限參考IRTP的檢測(cè)低限，根據(jù)該物種在IRTP中的檢測(cè)低限，設(shè)置1個(gè)檢測(cè)值，同時(shí)再設(shè)置一個(gè)高于該值1個(gè)數(shù)量級(jí)的檢測(cè)值，以黃牛檢測(cè)為例，設(shè)置了0.01 ng/μL（IRTP的檢測(cè)低限值）和0.1 ng/μL（高于檢測(cè)低限1個(gè)數(shù)量級(jí)的值）2個(gè)值。只有“馬”和“狗”例外，這2個(gè)物種的IRTP檢測(cè)低限都為1.0 ng/μL，但設(shè)置的檢測(cè)值為1.0和0.1 ng/μL。這一方面是由于檢測(cè)用的微流控陣列板的數(shù)量有限，另一方面是在進(jìn)行重復(fù)性和特異性驗(yàn)證時(shí)使用的質(zhì)量濃度為10 ng/μL，因此可直接借鑒該結(jié)果。微流控陣列的加樣質(zhì)量濃度如表4所示，同一質(zhì)量濃度下重復(fù)4次檢測(cè)（1塊板內(nèi)重復(fù)2次，檢測(cè)2塊板），檢測(cè)得到的CT≤35時(shí)為陽(yáng)性，4次中3次或3次以上結(jié)果為陽(yáng)性，表示可檢測(cè)到該質(zhì)量濃度。

表4 用于TaqMan微流控陣列靈敏度檢測(cè)的DNA樣品組合Table 4 DNAsample combination used for TLDA sensitivity detection

1.8 數(shù)理統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)重復(fù)性的統(tǒng)計(jì)分為板內(nèi)重復(fù)性和板間重復(fù)性。板內(nèi)重復(fù)性統(tǒng)計(jì)時(shí)，假設(shè)S1和S2列、S3和S4列、S5和S6列，兩兩間沒(méi)有差異，即每個(gè)目標(biāo)物種都假設(shè)重復(fù)4次，用標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（CV）表示重復(fù)性；板間的重復(fù)性則采用單因素方差分析（analysis of variance,ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TaqMan微流控陣列重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

因每個(gè)加樣列有2個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)每個(gè)樣本重復(fù)加入2列，如“黃牛、水牛、駱駝、綿羊、家豬”同時(shí)加入S1和S2列，但不同的是S2列除了包含上述目標(biāo)物種，還包含4個(gè)非目標(biāo)物種“梅花鹿、麻雀、細(xì)鱗壯鱈、水稻”，這是為了驗(yàn)證該方法的特異性而添加的，但在重復(fù)性驗(yàn)證中，假定S1和S2列沒(méi)有區(qū)別，即每個(gè)目標(biāo)物種板內(nèi)重復(fù)4次；同時(shí)重復(fù)3塊板，因此板間重復(fù)3次。

標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)的值都能說(shuō)明板內(nèi)相同列間的重復(fù)性。由表5可知，一般情況下標(biāo)準(zhǔn)差較高的，對(duì)應(yīng)的CV值也較高，以黃牛檢測(cè)的值為例：TLDA1（表示第1塊TLDA板上的驗(yàn)證，以此類(lèi)推）中標(biāo)準(zhǔn)差為0.19，對(duì)應(yīng)的CV值為0.84%；TLDA2中標(biāo)準(zhǔn)差為0.43，對(duì)應(yīng)的CV值為1.92%；TLDA3中標(biāo)準(zhǔn)差為0.39，對(duì)應(yīng)的CV值為1.85%。比較同一個(gè)目標(biāo)物種的檢測(cè)結(jié)果時(shí)，由于各板間CT值的平均值都較為接近，標(biāo)準(zhǔn)差和CV值都可說(shuō)明板內(nèi)列間的重復(fù)性優(yōu)劣，因此仍以黃牛檢測(cè)為例，TLDA1板內(nèi)列間的重復(fù)性優(yōu)于TLDA3，TLDA3優(yōu)于TLDA2。但在比較不同檢測(cè)目標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果時(shí)，由于不同引物探針的擴(kuò)增效率不同，即便在目標(biāo)DNA質(zhì)量濃度相同的情況下，得到的CT值的平均值差異也可能較大，此時(shí)單純以標(biāo)準(zhǔn)差比較重復(fù)性優(yōu)劣，則較難說(shuō)明問(wèn)題。如表5中TLDA1板內(nèi)黃牛和羊檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差皆為0.19，但CV值分別為0.84%和0.62%。標(biāo)準(zhǔn)差的大小和均值相關(guān)，而變異系數(shù)是一個(gè)量綱一的量，所以變異系數(shù)更適合用于比較2組均值不同的數(shù)據(jù)。因此，當(dāng)比較不同檢測(cè)目標(biāo)時(shí)，如比較TLDA1板內(nèi)黃牛和羊檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性優(yōu)劣時(shí)，CV值顯示羊的重復(fù)性優(yōu)于黃牛的重復(fù)性。

表5 TaqMan微流控陣列的重復(fù)性檢測(cè)Table 5 Repeatability test of TLDA

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示：最高的CV值為2.74%（狗，TLDA3），最低的CV值為0.62%（羊，TLDA1）。22個(gè)物種中有2個(gè)物種（豬和馬）的3個(gè)CV值均大于2%，12個(gè)物種的3個(gè)CV值均小于2%，但沒(méi)有一個(gè)物種的3個(gè)CV值均小于1%。即便是檢測(cè)同一個(gè)物種，不同的板間CV值也會(huì)存在較大的差異，如檢測(cè)水牛時(shí)，TLDA1、TLDA2和TLDA3的CV值分別為0.67%、2.11%和1.13%，因此，相應(yīng)的顯示其板間重復(fù)性的P值為0.031 6，也是唯一一個(gè)P值小于0.05的物種，說(shuō)明檢測(cè)水牛時(shí)其板間的重復(fù)性較低；而其他物種的P值皆大于0.05，說(shuō)明板間差異不大，重復(fù)性較好。

2.2 TaqMan微流控陣列特異性驗(yàn)證結(jié)果

特異性結(jié)果檢驗(yàn)顯示，TaqMan微流控陣列有較高的特異性，24種（類(lèi)）物種中，有22個(gè)（類(lèi)）物種的檢測(cè)既沒(méi)有出現(xiàn)假陰性也沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性，只有2個(gè)物種出現(xiàn)了假陰性，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程沒(méi)有發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性。特異性的驗(yàn)證往往基于對(duì)大量近似物種的檢測(cè)，如檢測(cè)黃牛的引物探針的特異性時(shí)，往往需要檢測(cè)水牛、牦牛、山羊、綿羊等同科同屬的近似種是否存在假陽(yáng)性。本研究應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)中的引物探針及本研究研發(fā)的引物探針，在進(jìn)行單重?zé)晒舛縋CR時(shí)已經(jīng)對(duì)該引物探針是否存在假陽(yáng)性進(jìn)行了驗(yàn)證。將單重?zé)晒舛縋CR整合成微流控陣列后，對(duì)某一個(gè)引物探針而言產(chǎn)生假陽(yáng)性的物種一般不會(huì)因此增多。但在檢測(cè)駱駝和鴿時(shí)，出現(xiàn)了假陰性，假陰性率分別達(dá)到了16.7%和25%。假陰性的出現(xiàn)，可能是由加樣操作失誤造成的。如在檢測(cè)駱駝時(shí)，在同一列的2個(gè)平行樣中，出現(xiàn)了假陰性，這很有可能是加樣失誤造成的；而在鴿的檢測(cè)時(shí)也出現(xiàn)了假陰性，這可能是操作失誤引起的，也可能是引物本身靈敏度不太高導(dǎo)致的。如表6所示，檢測(cè)鴿得到的CT值都在33左右，而實(shí)驗(yàn)設(shè)定大于35即為陰性。雖然鴿的假陰性和引物靈敏度低有關(guān)，但比較單重?zé)晒舛縋CR，在同樣的DNA檢測(cè)濃度下，重復(fù)3次并沒(méi)有出現(xiàn)假陰性，說(shuō)明TaqMan微流控陣列方法較普通單重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)的靈敏度低。

表6 TaqMan微流控陣列特異性驗(yàn)證Table 6 Specificity test of TLDA

2.3 TaqMan微流控陣列靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

KODANI等[21]在使用TaqMan微流控陣列進(jìn)行呼吸道病毒和細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，同時(shí)與單重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行靈敏度比較，發(fā)現(xiàn)同樣的引物探針序列，在整合到微流控陣列后也存在靈敏度下降的現(xiàn)象。鑒于此，我們?cè)谠O(shè)置靈敏度驗(yàn)證時(shí)，選擇單重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)低限為最低濃度。檢測(cè)結(jié)果顯示：本研究也同樣出現(xiàn)了檢測(cè)靈敏度降低的問(wèn)題，即和單重?zé)晒舛縋CR比較，22個(gè)物種中10個(gè)物種的檢測(cè)靈敏度都降低為原來(lái)的10%，鴿?rùn)z測(cè)的靈敏度則降低為原來(lái)的1%；其他物種成分的檢測(cè)靈敏度保持不變，檢測(cè)低限保持為0.1或者0.01 ng/μL（表7）。

3 討論

本研究將24種（類(lèi)）檢測(cè)不同物種的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)集成在同一張TaqMan陣列中，并對(duì)該方法的重復(fù)性、特異性及檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了驗(yàn)證。不論是板內(nèi)或板間其重復(fù)性都比較高，顯示板內(nèi)重復(fù)性的22個(gè)物種的66個(gè)CV值中，11個(gè)（占16.7%）CV值低于1%，15個(gè)（占22.7%）大于2%，其余（占60.6%）介于1%～2%之間，但沒(méi)有一個(gè)物種的CV值高于3%。顯示板間重復(fù)性的P值，只有水牛的P值小于0.05，顯示板間差異顯著，而其他21個(gè)物種的板間差異均不顯著。

表7 TaqMan微流控陣列與普通單重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)靈敏度比較Table 7 Comparison of sensitivity of TLDA and IRTP assays

本研究的特異性驗(yàn)證沒(méi)有發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性，這可能和混合加樣的方式有關(guān)。如表3所示，S1列中加入的DNA所包括的物種有黃牛、水牛、駱駝、綿羊、家豬、馬、驢，這種將近似種都加入一個(gè)混合樣中的方法不利于特異性的驗(yàn)證，如“黃牛和水牛、綿羊”“馬和驢”都是在種源關(guān)系上比較近的物種，若要檢測(cè)黃牛引物探針的特異性，則該列不應(yīng)加入黃牛的DNA而應(yīng)加入水牛、綿羊等其他和黃牛在物種上比較接近的哺乳動(dòng)物的DNA。馬和驢，以及其他禽類(lèi)和魚(yú)類(lèi)的特異性引物探針的檢測(cè)也以此類(lèi)推，但這樣驗(yàn)證需要耗費(fèi)較多TLDA板。由于本研究所購(gòu)TLDA板數(shù)量有限，故并未實(shí)施上述驗(yàn)證。本研究中所選取的引物探針在單重?zé)晒舛縋CR中都驗(yàn)證了其特異性，在排列到陣列上后，理論上特異性并不會(huì)因此降低。但在實(shí)際檢測(cè)中，TaqMan陣列中出現(xiàn)了單重?zé)晒舛縋CR中沒(méi)有出現(xiàn)的假陰性，假陰性的出現(xiàn)降低了檢測(cè)的特異性，但這種特異性的降低是靈敏度降低導(dǎo)致的。在比較靈敏度時(shí)發(fā)現(xiàn)，TaqMan陣列的靈敏度要低于單重?zé)晒舛縋CR，22個(gè)物種中10個(gè)物種的靈敏度降低為原來(lái)的10%，1個(gè)物種甚至降低為原來(lái)的1%，其余11個(gè)物種的靈敏度和單重?zé)晒獗３忠恢?，但沒(méi)有靈敏度提高的檢測(cè)物種。這和KODANI等[21]利用TaqMan微流控陣列進(jìn)行呼吸道病毒和細(xì)菌檢測(cè)的結(jié)果較為一致，都得到了TLDA檢測(cè)靈敏度較單重?zé)晒舛縋CR降低的結(jié)果。

判斷結(jié)果的陰陽(yáng)性和所設(shè)置的CT值的檢測(cè)低限值密切相關(guān)?；诒疚闹幸玫臉?biāo)準(zhǔn)，一般RT-PCR普遍進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，因此，本研究中的TaqMan微流控陣列反應(yīng)以及單重?zé)晒舛縋CR的循環(huán)數(shù)都設(shè)置為40個(gè)。在40輪反應(yīng)中，若得到CT≤35，則一般認(rèn)為陽(yáng)性比較明顯，因此本文中設(shè)置CT≤35為陽(yáng)性，CT＞35為陰性。但本研究的結(jié)果顯示，單重?zé)晒舛縋CR在整合成微流控陣列時(shí)，某些檢測(cè)的靈敏度會(huì)降低，鑒于此，可通過(guò)適當(dāng)增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)，將CT值設(shè)置得更高，以此提高靈敏度。如檢測(cè)低限為0.1和0.01 ng/μL的物種的閾值仍設(shè)為35，而檢測(cè)低限為1或10 ng/μL的物種可根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將CT值上調(diào)。由于本研究購(gòu)置的微流控陣列的數(shù)量有限，沒(méi)有進(jìn)一步進(jìn)行最佳檢測(cè)限CT值的驗(yàn)證。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)TaqMan微流控陣列反應(yīng)對(duì)樣品DNA的品質(zhì)要求較高，特別是對(duì)DNA的濃度要求較高。如本文中1.5節(jié)所提到，要達(dá)到在S1列中每個(gè)反應(yīng)孔的目標(biāo)物種DNA為10 ng，需要將7種檢測(cè)目標(biāo)物種的DNA質(zhì)量濃度均調(diào)整為80 ng/μL左右。20 μL的樣品加入48個(gè)反應(yīng)孔中，每個(gè)孔的樣品量不到0.5 μL，因此樣品的DNA質(zhì)量也是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。KODANI等[21]認(rèn)為，雖然TaqMan微流控陣列方法的靈敏度有所降低，但仍然能滿足實(shí)際樣本檢測(cè)的需求。本研究也發(fā)現(xiàn)，TaqMan微流控陣列對(duì)大多數(shù)物種的檢測(cè)靈敏度為0.1 ng/μL，用市售DNA提取試劑盒從魚(yú)、肉等制品中抽提得到的DNA質(zhì)量濃度一般在10～100 ng/μL之間，即TaqMan方法的靈敏度以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，為0.1%～1%（0.1/100×100%～0.1/10×100%）。一般應(yīng)用RTPCR進(jìn)行物種成分檢測(cè)鑒定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，其檢測(cè)靈敏度為0.1%。從摻假制假謀取利益的角度考慮，摻假物種成分的含量一般不低于一定的含量，才會(huì)有一定的經(jīng)濟(jì)利益。因此，即便TaqMan微流控陣列方法的靈敏度為1%，也能滿足一般制假摻假的檢測(cè)要求。雖然該方法具有檢測(cè)通量高、操作相對(duì)簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但對(duì)設(shè)備和耗材的要求比較高、檢測(cè)成本并不低，這也是該方法在食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用尚不廣泛的原因之一。

4 結(jié)論

本研究將TaqMan微流控陣列技術(shù)應(yīng)用到食品真?zhèn)舞b別檢測(cè)中，將不同物種特異性的引物探針集合在同一個(gè)TaqMan微流控陣列上，以實(shí)現(xiàn)多物種成分同步檢測(cè)。通過(guò)對(duì)該方法的重復(fù)性、特異性及靈敏度驗(yàn)證，認(rèn)為該方法可用于食品的真?zhèn)舞b別。