張 茜，楊月紅，章宏峰

隨著病理技術(shù)的發(fā)展，各種利用超聲震動(dòng)、恒溫水浴和專用試劑對(duì)病理組織完成固定、脫水、透明全過(guò)程于一體的病理組織處理儀得到廣泛應(yīng)用，是目前國(guó)內(nèi)病理科常用的快速制片方法之一[1]。因其方法簡(jiǎn)便快捷、省時(shí)省力，很多病理科會(huì)用超聲快速石蠟方法對(duì)胃腸鏡活檢組織進(jìn)行制片，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在某些活檢組織中，超聲快速石蠟制片可以獲得跟常規(guī)制片一致的HE染色的形態(tài)學(xué)結(jié)果[2]。在后續(xù)沒(méi)有手術(shù)大標(biāo)本的情況下，還需要用活檢組織對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumour, GIST)的患者進(jìn)行Sanger測(cè)序檢測(cè)C-Kit和PDGFRA基因突變的情況。本文主要探討經(jīng)超聲快速脫水處理的組織在GIST Sanger測(cè)序中對(duì)C-Kit和PDGFRA基因突變檢測(cè)結(jié)果的影響，以及與常規(guī)脫水組織在GIST Sanger測(cè)序中的C-Kit和PDGFRA基因突變檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 材料收集武漢市中心醫(yī)院病理科2018年3～9月的胃腸道手術(shù)標(biāo)本，每例標(biāo)本常規(guī)取材時(shí)另在腫塊相鄰部位上取大小0.3 cm×0.3 cm×0.2 cm的組織2塊分別進(jìn)行超聲快速脫水和常規(guī)脫水，制成蠟塊后備用。待常規(guī)病理及免疫組化檢測(cè)診斷后選取GIST 18例，其中男性8例，女性10例，患者年齡45～83歲，中位年齡66歲。儀器設(shè)備為HT-3型快速組織處理系統(tǒng)(山東駿騰醫(yī)療科技公司)和全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)(Leica ASP300S)，GIST C-it和PDGFRA基因突變檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海源奇生物公司。

1.2 方法

1.2.1組織處理 將所取每例組織大小0.3 cm×0.3 cm×0.2 cm的2塊組織中的一塊立即放入快速組織處理儀中進(jìn)行超聲快速石蠟制片，超聲快速石蠟制片方法如下：將組織放入第一缸的快速處理液中處理10 min；再將組織浸入第二缸的快速處理液中處理10 min；用濾紙吸取組織表面殘留的處理液，放入預(yù)先融化的石蠟中10 min，等到組織完全下沉不再有氣泡為止。取出組織迅速置于石蠟包埋機(jī)中進(jìn)行石蠟包埋。另一塊行常規(guī)石蠟處理。待常規(guī)病理及免疫組化檢測(cè)確診為GIST后，將兩種方法制得的蠟塊同時(shí)進(jìn)行C-Kit和PDGFRA基因檢測(cè)。

1.2.2核酸提取 取已制備好的同一患者的常規(guī)石蠟組織和超聲快速石蠟組織蠟塊，每塊切片10張，厚度為3 μm，制成組織切片，取連續(xù)切片的第一張和最后一張切片做常規(guī)HE染色，評(píng)估腫瘤細(xì)胞的含量和比例。根據(jù)評(píng)估的結(jié)果刮取腫瘤組織細(xì)胞到1.5 mL的EP管中，加入二甲苯1 mL脫蠟，離心去上清后加入無(wú)水乙醇，再離心去上清后將組織放置在通風(fēng)處烘干。在EP管中加入180 μL的ATL消化液和20 μL的蛋白酶K，于56 ℃的水浴鍋中消化3 h，90 ℃水浴鍋中孵育1 h，樣本室溫冷卻后，加入200 μL的DNA結(jié)合液和200 μL的無(wú)水乙醇，振蕩混勻離心后過(guò)吸附柱，經(jīng)2輪洗滌后，加入ATE緩沖液回收富集DNA。

1.2.3核酸定量 用Nanodrop 2000分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA進(jìn)行測(cè)量，確定核酸的濃度和純度。

1.2.4PCR擴(kuò)增 根據(jù)上海源奇生物公司的腫瘤相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的要求配置PCR MIX混合體系，加22 μL的需要擴(kuò)增的外顯子反應(yīng)液和3 μL的DNA，總反應(yīng)體系為25 μL。擴(kuò)增條件為：42 ℃預(yù)處理5 min，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。

1.2.5酶消化 取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加2 μL的SAP MIX酶進(jìn)行酶消化，消化程序設(shè)置為37 ℃孵育1 h，85 ℃處理15 min。

1.2.6測(cè)序PCR擴(kuò)增 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書配置測(cè)序PCR反應(yīng)體系，取3 μL的酶消化產(chǎn)物，加入2 μL的測(cè)序引物和1 μL的Bigdye液，總反應(yīng)體系為6 μL。擴(kuò)增條件為：96 ℃預(yù)變性1 min，96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸5 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物放置在4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.7測(cè)序PCR產(chǎn)物純化 每個(gè)0.2 mL的EP管中加入3 μL的0.125 mol/L的EDTA，再加入30 μL的無(wú)水乙醇，震蕩3次后室溫放置15 min；12 000 r/min離心30 min，棄去上清液；加入70 μL預(yù)冷的70%乙醇，冷凍離心機(jī)4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清；加入70 μL 預(yù)冷的70%乙醇，冷凍離心機(jī)4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清；將離心管放置在通風(fēng)處，使乙醇徹底揮發(fā)；加入10 μL的Hi-Di Formamide變性劑，迅速置于95 ℃的水浴鍋中孵育5 min，取出置于冰上。

1.2.8上機(jī)測(cè)序 純化后的產(chǎn)物即可在ABI 3500Dx基因分析儀上測(cè)序并分析。

2 結(jié)果

2.1 病理質(zhì)控行常規(guī)HE染色，同一患者超聲快速石蠟切片組織結(jié)構(gòu)清晰，染色對(duì)比鮮明，與常規(guī)石蠟切片質(zhì)量差異無(wú)顯著性，兩種HE切片的形態(tài)學(xué)結(jié)果一致，病理診斷為GIST，鏡下腫瘤細(xì)胞的比約占整張切片的60%(圖1)。

AB

圖1胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)本鏡下所見(jiàn)：A.超聲快速石蠟處理；B.常規(guī)石蠟處理

2.2 核酸的濃度和純度超聲快速石蠟處理的組織和常規(guī)石蠟處理的組織提取核酸濃度和純度均可以滿足下游測(cè)序的要求，兩者差異無(wú)顯著性(P>0.05，圖2)。

2.3 測(cè)序結(jié)果在18例GIST中，超聲石蠟Sanger測(cè)序檢測(cè)的結(jié)果中，C-Kit 11號(hào)外顯子基因突變16例，PDGFRA基因18號(hào)外顯子突變2例(表1)。同一患者經(jīng)Leica常規(guī)脫水機(jī)石蠟包埋處理的組織和經(jīng)HT-3型超聲波組織快速處理儀處理的組織樣本在測(cè)序片段的大小、背景熒光信號(hào)值、正常熒光信號(hào)峰和突變熒光信號(hào)峰上與常規(guī)石蠟樣本無(wú)明顯差異(圖3、4)。18例GIST基因測(cè)序結(jié)果完全一致(表1)。

圖2 超聲快速石蠟處理和常規(guī)石蠟處理的胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)本提取的核酸濃度(A)和純度(B)

圖3 胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)本超聲快速石蠟基因檢測(cè)：NM_000222.2: c.1679T>A(p.V560D)

圖4 胃腸道間質(zhì)瘤標(biāo)本常規(guī)石蠟基因檢測(cè)：NM_000222.2: c.1679T>A(p.V560D)

3 討論

GIST是消化道的一種間葉源性腫瘤，約占全部胃腸道腫瘤的2%[3]。在近20年的研究中，GIST已經(jīng)成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代針對(duì)特定基因的靶向治療的成功范例，靶向藥物伊馬替尼(Imatinib)對(duì)C-Kit基因11號(hào)外顯子突變的患者療效最佳[4]。另外，在病理診斷中，對(duì)于部分形態(tài)學(xué)符合間質(zhì)瘤梭形細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞特點(diǎn)、而免疫組化標(biāo)記CD117和DOG1雙陰性或只有一個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性的病例，若Sanger測(cè)序中C-Kit和PDGFRA基因突變陽(yáng)性，病理醫(yī)師可依據(jù)分子檢測(cè)的結(jié)果診斷為GIST[5-6]。因此在胃腸道組織中進(jìn)行Sanger測(cè)序檢測(cè)C-Kit和PDGFRA基因突變狀況不僅可以預(yù)示患者對(duì)靶向藥物的療效，還可以幫助病理醫(yī)師輔助鑒別診斷GIST[6]。

表1 C-Kit(NM_000222.2)和PDGFRA(NM_006206.4)基因突變的檢測(cè)結(jié)果

早期的GIST絕大部分病灶較小且患者無(wú)臨床癥狀，很多是通過(guò)體檢或活檢偶然發(fā)現(xiàn)[3-4]。在病理科對(duì)活檢組織進(jìn)行超聲快速石蠟制片廣泛應(yīng)用的今天，有部分的胃腸道活檢組織形態(tài)學(xué)觀察懷疑是GIST但免疫組化標(biāo)記CD117和DOG1雙陰性或只有一個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性時(shí)，可以直接使用超聲快速石蠟制片的活檢標(biāo)本進(jìn)行C-Kit和PDGFRA基因突變的檢測(cè)以輔助診斷GIST。臨床需要考慮使用Imatinib治療時(shí)，需要先明確C-Kit和PDGFRA基因的突變狀態(tài)，這種情況下也可以選用超聲快速石蠟處理的標(biāo)本。

常規(guī)石蠟組織是新鮮標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定6～24 h，再經(jīng)過(guò)由低至高各級(jí)濃度的乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明以及浸蠟等程序制成，該流程耗時(shí)10～20 h。目前HE和分子病理的診斷標(biāo)準(zhǔn)均是根據(jù)組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋制片而制定的。超聲快速石蠟是病理技術(shù)中的特殊領(lǐng)域，應(yīng)用環(huán)保型生物組織處理試劑結(jié)合HT-3處理儀處理病理組織是利用超聲原理，在處理液中快速振蕩病理組織和有機(jī)溶劑，實(shí)現(xiàn)周期性縮張的效果，進(jìn)而提高分子運(yùn)動(dòng)的速率，加速液體交換，使得細(xì)胞滲透性、溶劑分子穿透力顯著增強(qiáng)，最終實(shí)現(xiàn)病理組織的快速處理和診斷。該方法操作簡(jiǎn)便、安全可靠、省時(shí)省力，僅需30 min左右，3個(gè)步驟就可完成脫水、透明和浸蠟的全部流程，與常規(guī)石蠟制片相比雖然可以大大縮短制片時(shí)間[1-2]。但由于在脫水過(guò)程中超聲快速石蠟組織未經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定，用了環(huán)保型生物組織處理試劑結(jié)合超聲波的作用處理組織。在分子檢測(cè)中其核酸質(zhì)量和基因檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)脫水組織是否一致，目前還尚無(wú)大量文獻(xiàn)報(bào)道。

在超聲快速石蠟組織脫水過(guò)程中所用環(huán)保型生物組織處理試劑大多是醇性試劑，能有效保存核酸成分，而且Sanger測(cè)序檢測(cè)方法對(duì)核酸的質(zhì)量和濃度的要求比較高，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)超聲快速石蠟組織脫水過(guò)程中超聲波和生物組織處理試劑對(duì)核酸的質(zhì)量和濃度無(wú)影響，且不影響下游的C-Kit和PDGFRA基因突變檢測(cè)的結(jié)果。在臨床只有超聲快速石蠟標(biāo)本的情況下，可以用超聲快速石蠟組織行GIST的C-Kit和PDGFRA基因突變檢測(cè)，以便輔助診斷和預(yù)示靶向治療效果。需要注意的是超聲快速脫水的組織取材大小不能過(guò)厚，以免組織脫水不徹底影響制片質(zhì)量和蠟塊的保存，另外在提取核酸時(shí)盡量選擇已通過(guò)CFDA認(rèn)證的商品化的核酸提取試劑盒。