朱 瑩，李 龍，江成德，邊 麗，楊仕駿，倪晨杰，陳萬(wàn)超，熊 芩，杜一平?

(1.華東理工大學(xué) 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237； 2.上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司，上海201108)

分子光譜技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速、儀器小巧、測(cè)定成本低，是理想的快檢技術(shù)，但傳統(tǒng)分子光譜技術(shù)在靈敏度和選擇性方面還有一些局限性。文獻(xiàn)[1-6]表明:將富集與光譜測(cè)定有機(jī)結(jié)合，即富集后免去洗脫步驟，在富集介質(zhì)上直接進(jìn)行光譜采集，簡(jiǎn)單快速。同時(shí)由于無(wú)洗脫，被測(cè)組分不會(huì)被再次稀釋，富集倍數(shù)很高，可以大幅度提高測(cè)定方法的靈敏度，測(cè)定方法的選擇性也有一定程度的提高，該技術(shù)被稱為固相萃取光譜(SPES)[7]。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的SPES[8-9]采用的固相萃取裝置和固相光譜測(cè)定裝置是分開的，使用不便。將以膜材料為分離富集介質(zhì)的固相萃取裝置和以漫反射近紅外-可見光譜為測(cè)定手段的固相光譜測(cè)定裝置有機(jī)結(jié)合，建立了固相萃取-固相光譜聯(lián)用儀。該儀器可提高樣品處理、光譜測(cè)定的自動(dòng)化程度，提高光譜分析方法的靈敏度和選擇性。

羅丹明B是一種人工合成的堿性熒光染料，由于其廉價(jià)、染色性強(qiáng)且不易掉色而被不法商販用于食品中。文獻(xiàn)[10-12]表明:羅丹明B具有潛在的致癌、致畸性，中國(guó)衛(wèi)生部已禁止羅丹明B 在食品及食品相關(guān)產(chǎn)品中使用。目前，食品中羅丹明B 的測(cè)定方法主要有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法[13]和熒光探針法[14]等。這些測(cè)定方法均依賴昂貴儀器且需要復(fù)雜的前處理，耗時(shí)長(zhǎng)，測(cè)定成本高。分光光度法[15]也可用于羅丹明B的測(cè)定，但該方法抗干擾能力差、線性范圍窄、方法的精密度較低。本工作將研發(fā)的固相萃取-固相光譜聯(lián)用儀用于食品中羅丹明B的快速測(cè)定，為食品中非法添加劑的快速測(cè)定提供一種快捷簡(jiǎn)便、成本低、自動(dòng)化程度高的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

INSION UV/VIS 型 微 型 光 譜 儀；INSION NIR 1.7型微型光譜儀；D0-IS30型便攜式地物反射探頭；PHS-25型數(shù)字型精密酸度計(jì)；SARTORIUS arium 611DI型超純水凈化系統(tǒng)；混合纖維素膜、尼龍膜、聚醚砜膜、親水混合纖維素膜(孔徑均為0.22μm)。

羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L－1，稱取100 mg羅丹明B，用水溶解后定容至1.000 L，避光保存。

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液:15.0μg·L－1，用p H 2.00的水逐級(jí)稀釋100 mg·L－1羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

羅丹明B、硫酸、氫氧化鈉均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水(電阻率不小于18.2 MΩ·cm)。

1.2 固相萃取-固相光譜聯(lián)用儀的構(gòu)建

自主開發(fā)的固相萃取-固相光譜聯(lián)用儀由固相萃取裝置、固相光譜測(cè)定裝置和軟件等3個(gè)部分組成，其實(shí)物照片和結(jié)構(gòu)示意圖見圖1，軟件操作界面見圖2。

固相萃取裝置主要包括樣品架、自動(dòng)負(fù)壓上樣系統(tǒng)、固相萃取模塊、濾液收集瓶、快速干燥系統(tǒng)等。濾膜和砂芯緊密密封，保證進(jìn)樣溶液不泄漏。樣品溶液通過負(fù)壓自動(dòng)上樣，可調(diào)節(jié)真空度選擇合適的過濾速率，滿足上樣要求。濾液通過管路進(jìn)入濾液瓶。待測(cè)物質(zhì)被富集在膜上后，采用熱空氣對(duì)濾膜進(jìn)行快速干燥，干燥后的濾膜直接用于后續(xù)的固相光譜測(cè)定。

圖1 固相萃取-固相光譜聯(lián)用儀的實(shí)物照片和結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Physical photo and structure chart of hyphenated instrument solid phase extraction and solid phase spectroscopy

圖2 軟件操作界面Fig.2 Software operation interface

固相光譜測(cè)定裝置包括光纖、光譜儀和積分球。積分球用于漫反射固相光譜的采集。固相光譜測(cè)定裝置能與固相萃取裝置完美搭配，完成固相萃取操作后在固相介質(zhì)表面平穩(wěn)和準(zhǔn)確地采集固相光譜。

軟件具備儀器控制、光譜采集和數(shù)據(jù)處理等功能。軟件控制架構(gòu)見圖3。

圖3 軟件控制架構(gòu)Fig.3 Software control architecture

通過主機(jī)軟件控制真空泵，進(jìn)行負(fù)壓上樣操作；通過主機(jī)軟件控制熱風(fēng)槍，進(jìn)行濾膜干燥操作；主機(jī)軟件與光譜儀通訊，讀取儀器內(nèi)部溫濕度信息，進(jìn)行環(huán)境監(jiān)控，確保工作環(huán)境的正常；通過主機(jī)軟件向光譜儀下達(dá)指令，采集光譜信息；主機(jī)軟件對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析，生成報(bào)告。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取0.500 g市售辣椒樣品，加入50.0 m L 水，超聲10.0 min，離心后取上清液，得到樣品溶液(辣椒提取液)。

紅茶樣品無(wú)需處理，可直接作為樣品溶液。

將混合纖維素膜放置在砂芯上，加置濾杯和溶劑輸入裝置。取50.0 m L 預(yù)先用硫酸調(diào)p H 至2.00的樣品溶液置于樣品架上。打開軟件，開啟真空泵，控制真空度為0.06 MPa，負(fù)壓上樣。樣品溶液經(jīng)管道富集到微孔濾膜(混合纖維素膜)上，濾液流至收集瓶中。進(jìn)樣完成后，取出濾膜，熱風(fēng)干燥。干燥后的濾膜無(wú)需洗脫，直接在線采集濾膜上的樣品點(diǎn)(羅丹明B)的可見光譜，取波長(zhǎng)546.7 nm 處的吸光度，進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 微孔濾膜種類

按試驗(yàn)方法考察了混合纖維素膜、尼龍膜、親水混合纖維素膜、聚醚砜膜等4種常用微孔濾膜對(duì)羅丹明B富集性能的影響。結(jié)果表明:只有混合纖維素膜對(duì)羅丹明B有良好的富集效果，其他種類的微孔濾膜對(duì)羅丹明B沒有明顯的富集效果，光譜信號(hào)很弱。試驗(yàn)選擇微孔濾膜為混合纖維素膜。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)

按試驗(yàn)方法將15.0μg·L－1羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)溶液富集到混合纖維素膜上，干燥后測(cè)得的固相光譜見圖4。

圖4 富集羅丹明B膜的固相光譜Fig.4 Solid phase spectrum of membrane enriched rhodamine B

該光譜與課題組前期工作[8]報(bào)道的結(jié)果，以及羅丹明B 溶液測(cè)定的透射光譜很接近。試驗(yàn)選擇測(cè)定波長(zhǎng)為546.7 nm。

2.1.3 樣品溶液的體積

膜富集試驗(yàn)中，富集的樣品溶液的體積對(duì)方法靈敏度有影響。試驗(yàn)中分別用微孔濾膜富集10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0，100.0，110.0 m L的15.0μg·L－1羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)溶液(p H 2.00)，待濾膜干燥后，采集各濾膜上樣品點(diǎn)的可見光譜，樣品溶液體積對(duì)羅丹明B 吸光度的影響見圖5。

圖5 樣品溶液體積對(duì)羅丹明B吸光度的影響Fig.5 Effect of sample solution volume on absorbance of rhodamine B

由表5可知:隨著樣品溶液體積的增加，羅丹明B的吸光度逐漸增加；當(dāng)樣品溶液體積增加到60.0 m L時(shí)，繼續(xù)增加樣品溶液的體積，羅丹明B的吸光度基本平穩(wěn)。試驗(yàn)選擇樣品溶液的體積為50.0 m L。

2.1.4 樣品溶液的酸度

樣品溶液酸度的改變會(huì)引起溶液中目標(biāo)物分子的質(zhì)子化和去質(zhì)子化，進(jìn)而改變目標(biāo)物在溶液中的溶解度，影響膜富集過程。試驗(yàn)考察了樣品溶液的p H 為1.00～9.00 時(shí)對(duì)膜富集羅丹明B 過程 的影響。結(jié)果表明:p H 為1.00時(shí)，羅丹明B的吸光度最大；繼續(xù)增大p H，羅丹明B的吸光度逐漸降低。這是因?yàn)榱_丹明B 分子中的羧基在強(qiáng)酸條件下不易解離，與微孔濾膜的結(jié)合能力較強(qiáng)?？紤]到p H 為1.00～3.00時(shí)，羅丹明B吸光度的差異不大，p H 為2.00時(shí)，平行測(cè)定結(jié)果誤差較小，試驗(yàn)選擇樣品溶液的酸度為p H 2.00。

2.2 干擾試驗(yàn)

試驗(yàn)考察了樣品中可能存在的K＋、Na＋、Ca2＋、Cu2＋、NO3－、Cl－、SO42－等無(wú)機(jī)離子和孔雀石綠、熒光素、堿性橙等多種有機(jī)染料對(duì)羅丹明B測(cè)定的干擾。當(dāng)干擾物的存在引起羅丹明B 測(cè)定信號(hào)的相對(duì)誤差在±5%以內(nèi)時(shí)，無(wú)機(jī)離子的允許量(以倍數(shù)計(jì))為300～4 500，有機(jī)染料的允許量小于10。這說明建立的方法對(duì)一些常見無(wú)機(jī)離子的抗干擾能力較強(qiáng)，對(duì)有機(jī)染料的抗干擾能力較弱。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按試驗(yàn)方法對(duì)4.0～40.0μg·L－1的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行富集并采集其光譜，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:羅丹明B的質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的吸光度呈二次函數(shù)關(guān)系，回歸方程為y ＝5.97×10－1x2＋5.45×10－1x＋1.06×10－2，相關(guān)系數(shù)為0.994 5。在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，羅丹明B 的富集容易趨于飽和，因此呈現(xiàn)二次函數(shù)關(guān)系；在4.0～20.0μg·L－1內(nèi)(低質(zhì)量濃度)，羅丹明B 的質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的吸光度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y ＝4.49×10－3x ＋1.29×10－2，相 關(guān) 系 數(shù) 為0.995 5。

為消除基體背景干擾，分別以辣椒提取液和紅茶作為基體，加入羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制了羅丹明B 基體標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按試驗(yàn)方法對(duì)上述羅丹明B基體標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，以羅丹明B的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。羅丹明B的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

按試驗(yàn)方法測(cè)定空白樣品9次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)，按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算方法的檢出限(3s/k)，結(jié)果見表1。

表1 線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.4 方法的精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)空白辣椒和空白紅茶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2，紅茶中含有大量的糖類和添加劑，其在富集過程中會(huì)占據(jù)甚至堵塞濾膜，因此用水稀釋10倍后測(cè)定。

由表2 知:回收率為88.0%～108%，RSD 為4.6%～9.3%。

辣椒樣品的回收率均小于100%，可能是試驗(yàn)操作者在少量平行試驗(yàn)中，膜富集過程中操作不規(guī)范導(dǎo)致的。因此需對(duì)操作者的操作進(jìn)行流程化規(guī)范。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

紅茶樣品第一個(gè)加標(biāo)量15.0μg·L－1所測(cè)得的回收率小于100%，這可能是由于羅丹明B含量低，在樣品處理過程中損失少量組分，導(dǎo)致結(jié)果偏低。

綜合來看，表2結(jié)果滿足食品中羅丹明B 的含量測(cè)定要求(SNT 2430－2010《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法》)，證明了本方法可用于食品中羅丹明B的測(cè)定。