崔琳琳，王 瑩，李國玉，袁 甜

1黑龍江省預防與治療老年病藥物研究重點實驗室；2哈爾濱商業(yè)大學藥學院，哈爾濱 150076

1951 年，經過 Cuningham等[1]研究從人工栽培的蛹蟲草的培養(yǎng)液中分離得到的一種核苷衍生物—蟲草素(3′-脫氧腺苷)，同時也是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素[2]。經過多年研究，證實了蟲草素具有多種藥理活性，但是蟲草素的全部藥理作用并未完全闡明?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的藥理作用如下：抗腫瘤、抗病毒、抗菌、免疫調節(jié)、抗衰老、降血脂、降血糖和具有抗缺血再灌注損傷、加強心肌保護的作用、抑制血管內皮平滑肌細胞的增殖、抑制血小板在血管內聚集形成血栓[3-12]等多方面的藥理作用。目前，蟲草素的研究現(xiàn)在已經成為藥物化學中一個極其活躍的領域。

蟲草素雖然具有廣泛生物活性和藥理作用，對多種疾病都有潛在的治療作用，但從50年代被發(fā)現(xiàn)以來有關其體內實驗的報道甚少，究其原因，是由于蟲草素在體內腺苷脫氨酶(ADA)的作用下快速脫氨基后會變成生物活性極小的3′-脫氧次黃嘌呤核苷，半衰期很短，作用效果短暫，從而影響治療效果。本實驗以蟲草素為原料，在5′位置上接入新的基團，合成系列衍生物，擬通過改變蟲草素脂溶性從而增加其活性。對合成得到的化合物進行體外抗腫瘤活性評價，并進行體內藥代動力學研究。

1 材料與方法

1.1 實驗原料與儀器

1.1.1 實驗試藥

蟲草素、2-呋喃甲酰氯、2-噻吩甲酰氯、6-氯煙酰氯(四川省維克奇生物科技有限公司)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(北京欣經科生物技術有限公司)、杜爾貝科改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(Hy Clone/Thermofisher)、小牛血清(FBS)(杭州四季青生物有限公司)、平衡鹽溶液和胰蛋白酶消化液(GIBCO公司)、人肝癌HepG2細胞株(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心)、色譜甲醇、屈臣氏水、其它化學試劑均為分析純、實驗用水為滅菌二次水。

Wistar大鼠(體重220～240 g)，雄性，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，動物合格證號：SCXK(吉)-2016-0003，批號：201800024268，健康狀況良好。

1.1.2 主要儀器設備

核磁共振氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)(Bruker Avance 500 MHz)、超高效液相色譜-質譜(SHI-MADZU Nexera,AB Sciex Triple TOF4600)、高壓滅菌鍋(日本Sanyo公司)、DL-CJ-1ND醫(yī)用型超凈工作臺(中國北京東連哈爾儀器制造有限公司)、高效液相色譜儀(包括LC-10ATvp輸液泵、SPD-10Avp紫外檢測器、SCL-10Avp 系統(tǒng)控制器、CLASS-VP 6.0 色譜工作站)。

1.2 蟲草素衍生物的化學合成

以3′-脫氧腺苷為先導化合物，對其C-5′進行結構改造后得到衍生物分別為：(5′-噻吩甲酰酯)-3′-脫氧腺苷(1)、(5′-呋喃甲酰酯)-3′-脫氧腺苷(2)、(5′-6-氯煙酰酯)-3′-脫氧腺苷(3)、化合物其結構經1H NMR、13C NMR表征確證。

化合物1～3的合成方法：取蟲草素原料藥1 g(0.004 mol)溶于50 mL無水吡啶中。恒溫水浴70 ℃，氮氣保護，在磁力攪拌下緩慢滴入酰氯溶液(eq.：1∶1.2)。TLC監(jiān)測反應(甲醇∶二氯甲烷=1∶10)，5 h反應結束。減壓蒸除溶劑。將濃縮之后的膏狀產物，60 ℃蒸餾水溶解，以除去未反應的酰氯。分別用30 mL乙酸乙酯萃取三次。合并有機相，減壓蒸餾得到固體粉末樣品。采用干法上樣的方法，用少量硅膠粉末拌勻樣品，上硅膠柱(2×75 cm玻璃柱，200～300目柱層析硅膠)，柱層析(甲醇：二氯甲烷=1∶15)。

目標化合物路線如圖1。

圖1 目標化合物的合成路線

1.3 體外活性測定以及藥動學評價

1.3.1 目標化合物的體外抗腫瘤活性測試

HepG2細胞培養(yǎng)：HepG2細胞解凍后，放入超凈工作臺，加入離心管內并加含有10%小牛血清的1 640培養(yǎng)液，混勻后離心。棄去上清液，向離心管加入培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。細胞計數，調細胞濃度以3×104個/mL。置于培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，進行常規(guī)培養(yǎng)傳代[13]。

MTT實驗：根據文獻方法[14-17]，將蟲草素、化合物1～3均制備成濃度為80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL的溶液。細胞以3×105個/mL 接種量接種于96孔培養(yǎng)板，置于5% CO2，37 ℃溫箱中培養(yǎng) 48 h后，每孔加入不同濃度的化合物各100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24，48 h，每孔 6 個平行孔。觀察到培養(yǎng)液變黃且細胞未長滿時，更換培養(yǎng)液。分別加入100 μLMTT(噻唑藍)后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h 棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，在酶標儀570 nm下讀板，根據測得的吸光度值，計算細胞生長抑制率，用分析軟件SPSS計算IC50值。

1.3.2 體內藥物代謝實驗方法

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18，5 μm，4.6×250 mm；流動相：蟲草素乙腈-水(8∶92，V/V)，化合物1～3甲醇-水(50∶50，V/V)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃;進樣量：20 μL ;檢測波長：蟲草素260 nm，化合物1～3 280 nm。

1.3.2.2 系列標準溶液的配制

蟲草素、化合物1～3均各自配制成16.7 μmol/mL的灌胃液。其中，化合物1～3均不易溶于水，制備成混懸液，灌胃之前進行搖勻。

1.3.2.3 動物分組及給藥方案

取40只Wistar雄性大鼠(體重220～240 g)，隨機分配為4組，每組10只大鼠。每組各取14 個時間點，禁食不禁水。第一組為蟲草素組，第二組為化合物1組，第三組為化合物2組，第四組為化合物3組。禁食24 h后，灌胃給藥。除每組中空白對照外，各組中其余大鼠每只給藥3 mL，分別于0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、7、9、12、15、18 h時間點眼眶取血0.5 mL，置于肝素化離心管中，所有血樣均以4 000 rpm高速離心5 min后，吸取血漿冷凍備用。

1.3.2.4 樣品前處理

取0.2 mL血漿樣品，加入色譜甲醇0.2 mL，震蕩混勻，在16 000 rpm下離心15 min，取上清液用0.45 μm有機濾膜濾過，將濾液揮發(fā)干，重新加入0.2 mL甲醇，充分震蕩混勻，濾液用于血藥濃度的測定[18]。

2 結果與討論

2.1 目標化合物的結構表征結果

化合物1白色粉末，熔點204～205 ℃，產率52.0%，HR-ESI-MS：m/z362.092 8[M+H]+。UV(MeOH)λmax289 nm；IR(KBr)νmax1 113 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：8.25(1H，s，2-H)，8.14(1H，s，8-H)，7.98～7.23(3H，dd，J=6.5，8.8 Hz，5′-CH2)，7.33(2H，s，6-NH2)，5.94(1H，d，J=13.9 Hz，1′-H)，5.79(1H，d，J=12.3 Hz，2′-H)，4.72～4.45(4H，dp，2′-OH，4′-H，5′-CH2)，2.42～2.11(2H，ddd，J=10.2，12.4，13.6 Hz，3′-CH2)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：161.8(-COO)，156.5(2-C)，153.2(4-C)，149.5(8-C)，134.6～128.8(4，5′，-CH=)，119.4(5-C)，91.3(1′-C)，78.0(4′-C)，74.8(2′-C)，66.3(5′-C)，35.2(3′-C)。因此鑒定該化合物為(5′-噻吩甲酰酯)-3′-脫氧腺苷。

化合物2淺黃色粉末，熔點197～198 ℃，產率50.4%，HR-ESI-MS：m/z346.115 4[M+H]+。UV(MeOH)λmax280 nm；IR(KBr)νmax1 126 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：8.26(1H，s，2-H)，8.13(1H，s，8-H)，7.98～6.70(3H，d，J=4.9 Hz，5′-CH=)，5.93(1H，d，J=11.9 Hz，1′-H)，5.77(1H，d，J=3.1 Hz，1′-H)，4.69～4.24(4H，ddtd，2′-OH，4′-H，5′-CH2)，2.06(2H，ddd，J=12.1，15.2，17.3 Hz，3′-CH2)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：158.2(-COO)，156.5(6-C)，153.1(2-C)，149.5(4-C)，148.3～144.0(5′-CH=)，139.3(8-C)，119.4(5-C)，119.2～112.9(5′-CH=)，91.2(1′-C)，77.9(4′-C)，74.8(2′-C)，66.0(5′-C)，35.2(3′-C)。因此鑒定該化合物為(5′-呋喃甲酰酯)-3′-脫氧腺苷。

化合物3白色粉末，熔點211～212 ℃，產率60.2%，HR-ESI-MS：m/z392.9[M+H]+。UV(MeOH)λmax280 nm；IR(KBr)νmax1 132 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：8.92～7.67(3H，s，5′-CH=)，8.25(1H，s，2-H)，8.11(1H，s，8-H)，7.28(2H，s，-NH2)，5.93(1H，s，1′-H)，5.76(1H，d，J=10.4 Hz，2′-H)，4.79(1H，s，4′-H)，4.6～4.59(2H，dp，5′-CH2-)，4.51～4.56(2H，dd，J=11.7，16.8 Hz，3′-CH2-)，2.09(2H，ddd，J=4.2，12.6，18.7 Hz，3′-CH2-)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：164.3(-COO)，156.5(6-C)，155.0(2-C)，153.1～125.1(5C，5′-CH=)，149.5(4′-C)，139.7(8-C)，119.6(5-C)，91.5(1′-C)，77.8(4′-C)，74.6(2′-C)，66.6(5′-C)，35.3(3′-C)。因此鑒定該化合物為(5′-6-氯煙酰酯)-3′-脫氧腺苷。

2.2 體外活性測試結果

在體外抗腫瘤活性研究中，以人肝癌細胞HepG2為研究對象。采用MTT法檢測不同濃度的化合物1～3對HepG2細胞增殖的影響。圖2為三個化合物和蟲草素在不同濃度下對腫瘤抑制率變化曲線。如圖，經修飾后的3′-脫氧腺苷衍生物均顯示了較好的抗腫瘤活性，且對HepG2的抑制效果隨化合物濃度的升高而升高。在一定濃度范圍內，化合物濃度越大對腫瘤細胞的抑制率越強。蟲草素、化合物1～3四者IC50值分別為0.12、0.11、0.07、0.06 μM。本實驗為蟲草素衍生物抗腫瘤作用的深入研究和探索蟲草素衍生物在腫瘤治療應用方面的前景提供依據，為新藥研發(fā)提供理論基礎。

圖2 化合物對HepG2細胞抑制作用

2.3 方法學考察結果

2.3.1 色譜行為

分別取對照組未給藥大鼠的空白血漿，按“1.3.2.4”項下處理組織血樣樣品，分別進樣20 μL，得到色譜圖A為大鼠空白血漿。將一定量的標準品儲備液加入到大鼠空白血漿中，同法操作，得到對照品色譜圖B。取大鼠給藥后的血漿樣品，同法操作，得到樣品色譜圖C。在上述色譜條件下，測得的蟲草素和化合物1～3的色譜圖如下，圖3-6中“a、b、c、d”分別為蟲草素和化合物1～3的色譜峰，保留時間分別為7.68、8.26、5.43、7.11 min。蟲草素和化合物1～3各組織的內源性物質分離情況良好，無雜質峰干擾。

圖3 空白血漿(A)、空白血漿+蟲草素(B)、給藥后血漿(C)的色譜圖

圖4 空白血漿(A)、空白血漿+化合物1(B)、給藥后血漿(C)的色譜圖

圖5 空白血漿(A)、空白血漿+化合物2(B)、給藥后血漿(C)的色譜圖

圖6 空白血漿(A)、空白血漿+化合物3(B)、給藥后血漿(C)的色譜圖

2.3.2 標準曲線的繪制

取大鼠空白血漿500 μL，分別加入儲備液配制成低、中、高(0.5、5、50 μg/mL)三種濃度的標準溶液。按“1.3.2.1”項下色譜條件操作，每個濃度測定6次，記錄峰面積。以峰面積(A)對樣品濃度(c，μg/mL)進行回歸運算。求得回歸方程如表1。

結果表明各藥物在0.01～100.0 μg/mL范圍內線性關系良好(r>0.992 4)。

表1 不同藥物的回歸方程(n =6)

2.3.3 精密度

精密量取各化合物儲備液30 μL至離心管中，加入空白血漿500 μL，配制成低、中、高(0.5、5、50 μg/mL)三種濃度的樣品溶液，按“1.3.2.4”項下處理，進樣20 μL記錄峰面積，三個濃度每個濃度每日內平行測定5次，重復測定5日。得日內日間精密度，結果見表 2、3、4、5。由結果可知，精密度良好，符合生物樣品分析方法的要求。

表2 蟲草素精密度測定結果(n =5)

表3 化合物1精密度測定結果(n =5)

表4 化合物2精密度測定結果(n =5)

表5 化合物3精密度測定結果(n =5)

2.3.4 回收率

將各化合物配制成低、中、高(0.5、5、50 μg/mL)三種不同濃度的空白血漿供試液各3份，按“1.3.2.4”項下進行處理。按“1.3.2.1”項下各自的色譜條件測定血藥濃度，所得峰面積和相應的對照品溶液直接進樣所得峰面積進行比較，計算提取回收率，測得結果見表6。表明該方法符合方法學要求。

表6 各藥物濃度回收率測定結果(n =3)

2.3.5 穩(wěn)定性

將各化合物配制成低、中、高(0.5、5、50 μg/mL)三種不同濃度的空白血漿供試液，每個濃度測定5次。每個樣本分別在放置室溫24 h后、反復凍融3次后和在-20 ℃冰箱冷藏15天后的條件下測定，測定各化合物的穩(wěn)定性。該方法穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析方法的要求。

表7 各藥物穩(wěn)定性測定結果(n =5)

2.3.6 定量限

利用不斷減少加入化合物的量的方法使液體中的分析物濃度不斷降低，采用信號(S)與噪聲(N)的比值大于等于10的標準來確定定量限。

表8 藥物的定量限測定結果(n =6)

圖7 蟲草素、化合物1～3體內藥物轉化情況(n=6)

2.4 藥物轉化與代謝分析

2.4.1 藥物體內轉化情況

為檢驗化合物1～3在大鼠體內能否轉變?yōu)橄x草素自身來發(fā)揮作用，對各組處理后的血樣中的蟲草素含量進行了測定。測得的各組的蟲草素血藥濃度隨時間變化的曲線如圖7所示，化合物1～3進入動物體內后，會逐漸代謝為蟲草素來發(fā)揮作用。結果顯示，蟲草素結構修飾物在體內轉化為蟲草素的效率低。

2.4.2 體內藥物代謝分析評價結果

取血漿上清液0.2 mL，按照本章“1.3.2.4”項下樣品處理方法操作，進樣量20 μL進樣測定不同時間內血液中化合物的含量。結果如圖8。計算得到的相應的藥代動力學參數見表8。

圖8 灌胃給藥蟲草素、化合物1～3后血藥濃度-時間分布曲線(n=6)

表9 各藥物的藥代動力學參數

注：P<0.05，n=6。

從表9結果可見，經過結構修飾后的蟲草素，Tmax時間延長，化合物在體內的存在時間延長；Cmax的升高，說明化合物在體內的作用濃度升高，可以更好地發(fā)揮藥效，進而的減少給藥劑量；t1/2的延長，可以減少重復給藥次數。

體內化合物轉化情況的評價結果表明：化合物在體內能逐漸代謝轉變?yōu)橄x草素，但轉化后的藥物在體內的作用結果與原型藥相比，Cmax降低。Tmax延長，可以使蟲草素在體內發(fā)揮作用的時間延長。同時，結合Cmax與Tmax數據對比，t1/2的延長可以表明轉化后得到的蟲草素以低血藥濃度在體內存在。體內轉化后的化合物在體內代謝情況與蟲草素相比，轉化后的化合物在體內的代謝時間和血藥濃度要低于蟲草素原型藥。

3 結論

本實驗對蟲草素進行修飾，對3′-脫氧腺苷的C-5′位進行修飾，接入三種不同的基團，合成了三種衍生物：(5′-呋喃甲酰酯)-3′-脫氧腺苷，(5′-噻吩甲酰酯)-3′-脫氧腺苷，(5′-6-氯煙酰酯)-3′-脫氧腺苷。在蟲草素結構中有3個活性部位，分別為2′-OH、5′-OH和6-NH2，本實驗中酰氯與5′-OH反應，生成酯基。蟲草素的結構修飾物化合物1～3的產率分別為52.0%、50.4%、60.2%。結合反應過程中的TLC檢測反應情況和產率來看，實驗中均有副產物產生，因在反應中嚴格禁水，無脂肪酸生成，推測其副產物為5′-OH和6-NH2的產物。分析酰氯與各基團反應生成的產物情況，推測其結果為：化合物存在空間位阻影響，蟲草素中5′-OH活性最大，與酰氯反應幾率大，產物多。2′-OH因臨近五元環(huán)，空間位阻大，影響其活性，產率低。6-NH2的活性與5′-OH相比，低于5′-OH。

在經過MTT法篩選其抗腫瘤活性后，經修飾后的蟲草素衍生物均顯示了較好的抗腫瘤活性，且對HepG2的抑制效果隨化合物濃度的升高而升高。在一定濃度范圍內，化合物濃度越大對腫瘤細胞的抑制率越強。蟲草素、化合物1～3四者IC50值分別為0.12、0.11、0.07、0.06 μM。

合成后的蟲草素衍生物在體內半衰期延長，但其在體內的血藥濃度變低了。實驗中化合物進入動物體內后開始逐漸代謝為蟲草素，但是結構修飾物在體內的轉化率低，蟲草素在動物體內的達峰濃度不高，相同劑量下，難以達到蟲草素原型藥在動物體內的最高血藥濃度，但達峰時間和半衰期有所延長，可以實現(xiàn)蟲草素在體內以低濃度的形式發(fā)揮療效。關于結構修飾物在體內轉化效率低的問題進行分析，推測其原因可能為：①動物體內對結構修飾物的分解酶少，不能有效的使蟲草素衍生物全部在體內代謝分解，只有一小部分被還原為原型藥。②實驗中的給藥方式為灌胃給藥，動物體內胃里含有大量的胃酸，pH值偏低，而蟲草素衍生物中的被修飾部分為酯基結構，化合物在進入胃內部后，在酸性條件下還原為原型藥困難，僅有一小部分在進入消化系統(tǒng)后進行分解代謝，導致在體內的轉化率低。評價三種化合物在大鼠體內的藥動學研究，為蟲草素衍生物抗腫瘤作用的深入研究和探索蟲草素衍生物在腫瘤治療應用方面的前景提供依據，為其新藥開發(fā)提供思路。

本實驗通過化學結構修飾的手段，改變蟲草素的結構后，增加對腫瘤的抑制率。同時蟲草素衍生物在動物體內可以逐漸代謝轉變?yōu)橄x草素，所以蟲草素衍生物可以作為蟲草素的前藥而發(fā)揮作用。蟲草素衍生物在動物體內轉變成的蟲草素的Tmax和t1/2的延長，可以表明轉化后得到的蟲草素以低血藥濃度在體內存在。Cmax和AUC值出現(xiàn)先升高、再降低的有規(guī)律性的變化。這說明，蟲草素經化學結構修飾后，可使蟲草素在體內發(fā)揮作用時間延長。該實驗可通過化學結構修飾的手段研究開發(fā)具有更高藥理活性的新型藥物，為學者們提供了一條新思路。