張金蘋，閆慧嬌，王亞蘭，王志偉*，王曉靜*

1濟南大學 山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南 250200；2山東省分析測試中心 齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)，濟南 250014；3山東省醫(yī)學科學院藥物研究所；4國家衛(wèi)生部生物技術藥物重點實驗室 山東省罕少見病重點實驗室，濟南 250062

大葉糖膠樹是雞骨常山屬(夾竹桃科)植物，該屬植物為灌木和喬木，主要生長在非洲和亞洲的熱帶地區(qū)，我國主要分布于廣東、云南、廣西等地。雞骨常山屬在民間用藥比較廣泛，其藥理活性包括抗高血壓、抗菌抗炎和鎮(zhèn)痛[1,2]、鎮(zhèn)咳[3]、抗哮喘和祛痰活性、抗瘧疾、胃腸道疾病，癌癥[4]和許多其他疾病。雞骨常山屬植物已被證明是豐富的生物堿來源，特別是吲哚類生物堿，從中分離得到的吲哚生物堿結構骨架變化多樣，有諸多潛在的研究價值。

2005年，Ganesh Chandra Jagetia課題組對不同季節(jié)的雞骨常山屬植物中生物堿對人宮頸癌細胞HeLa的體外活性進行研究[5]，2006年該課題組又對雞骨常山屬植物中生物堿進行了一系列人腫瘤細胞的活性實驗，包括人宮頸癌細胞HeLa和人肝癌細胞HepG2，KB細胞人口腔表皮樣癌細胞，MCF-7人乳腺癌細胞[6]。2018年，Toh-Seok Kam課題組從雞骨常山屬植物中分離的雙生物堿也表現(xiàn)出對KB、PC-3、LNCaP、MCF7、MDA-MB-231、HT-29、HCT 116和549的明顯細胞毒性[7]。目前，國內外對大葉糖膠樹的研究較少，為了更合理地開發(fā)利用，基于前期課題組對吲哚生物堿的研究[8]，我們對大葉糖膠樹枝葉進行研究，并測試所有化合物對HCT-116人結腸癌細胞和DLD-1人結直腸腺癌上皮細胞的細胞毒性。

1 儀器與材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀；Bruker Avance III 400 NMR型核磁共振儀；Agilent Technology 6520 Accurate-Mass Q-TOF 型質譜儀；艾杰爾LC-6AD制備液相色譜儀(天津)；Thermo Acclaim TM 120 C18分析型色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；Daisogel C18制備型色譜柱(20 × 250 mm，10 μm)；ODS-C18(日本YMC公司產品)硅膠及高效薄層板(青島海洋化工廠和Merck公司)；分析甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

人結腸癌細胞HCT-116細胞株(中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心)；DLD-1人結直腸腺癌上皮細胞(中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心)。HF 90二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力升科學儀器)；Nikon Eclipse Ts 2倒置顯微鏡；LDZM立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；Spark多功能酶標儀試劑(瑞士Tecan公司)；湘儀離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(hyclone)；青鏈霉素混合液(索萊寶)；PBS；MTT(索萊寶)；胰酶(索萊寶)。

大葉糖膠樹(Alstoniamacrophylla)采集于廣西白色市吞盤鄉(xiāng)，樣品編號：AR-201903，存放于山東省分析測試中心中藥資源可持續(xù)利用研究室。

2 方法

2.1 提取與分離

大葉糖膠樹枝葉10.2 kg，粉碎，用95%乙醇對粉碎物進行了加熱回流提取，濃縮，得到總提取物1 407 g。加水混懸，用2% HCl調pH至2～3以二氯甲烷反復萃取，用10% NaOH 調pH至9～10，以二氯甲烷萃取得總生物堿部位18.0 g和乳化部位61.3 g。

將總生物堿部位18.0 g進行硅膠柱層析，二氯甲烷：甲醇(150∶1→1∶1)梯度洗脫，經HPLC檢測后合并得到13個部位(Fr.a～Fr.m)。將Fr.f(1.2 g)進一步經硅膠柱層析，二氯甲烷：甲醇(50∶1→1∶1)梯度洗脫得40個部位(Fr.f-1～Fr.f-40)，其中Fr.f-15(445 mg)以55%甲醇-水(含5 mM碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)經制備液相色譜洗脫，得到化合物1(400 mg，tR27.4 min)。Fr.f-7(103 mg)以59%甲醇-水(含5 mM碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)經制備液相色譜洗脫，得到化合物2(40 mg，tR29.9 min)。Fr.e(356.5 mg)經葡聚糖凝膠柱層析洗脫得23個部位(Fr.e-1～Fr.e-23)，其中Fr.e-22(130 mg)以45%甲醇-水(含5 mM碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)經制備液相色譜洗脫，得到化合物3(37 mg，tR19.6 min)。Fr.i(1.5 g)進一步經硅膠柱層析，二氯甲烷：甲醇(20∶1→1∶1)梯度洗脫得24個部位(Fr.i-1～Fr.i-24)，其中Fr.i-17～21(272 mg)以42%甲醇-水(含5 mM碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)經制備液相色譜洗脫，得到化合物4(26 mg，tR22.9 min)。Fr.i-22即為化合物5(44 mg，tR10.0 min)。

將大葉糖膠樹的乳化部位進行硅膠柱層析，經二氯甲烷：甲醇(100∶1→1∶2)梯度洗脫，經HPLC檢測后合并得到5個部位(Fr.1～Fr.5)。其中Fr.3(0.6 g)以59%甲醇-水(含5mM 碳酸銨，10 mL/min，UV 254 nm)經制備液相色譜洗脫，得到化合物6(32 mg，tR28.3 min)。

2.2 HCT-116和DLD-1的細胞毒性試驗

HCT-116和DLD-1細胞株的培養(yǎng)將細胞用含10%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(NaHCO3，2 g，100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞覆蓋率達90%以上時傳代，生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗研究。

取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入濃度為1×104個/mL的細胞懸液100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，加入含不同質量濃度的受試藥物(溶解在含0.1% DMSO的培養(yǎng)基中)100 μL/孔，使其終質量濃度分別為100 μg/mL(C1)、50 μg/mL(C2)、25 μg/mL(C3)、12.5 μg/mL(C4)、6.3 μg/mL(C5)和3.1 μg/mL(C6)，每質量濃度3個復孔，空白組加入等量含0.1% DMSO的培養(yǎng)基(C0)，以順鉑為陽性對照，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。取出細胞培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去MTT，每孔加入100 μL DMSO，振蕩，使結晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度值。計算IC50。試驗重復進行3次。

3 實驗結果

3.1 化合物結構鑒定

圖1 化合物1～6的化學結構

化合物1白色無定形粉末(甲醇)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS：m/z341[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)譜顯示有4個吲哚環(huán)上的芳香氫信號δH7.50(1H，d，J=8 Hz，H-9)，7.42(1H，d，J=8 Hz，H-12)，7.18(1H，t，J=7.2 Hz，H-11)，7.10(1H，t，J=7.2 Hz，H-10)；5個連接氮、氧或者雙鍵的信號δH5.77(1H，q，J=6.8 Hz，H-20)，5.02(1H，d，J=15.6 Hz，H-6)，4.45(1H，q，J=15.6 Hz，H-6)，4.20(1H，d，J=10 Hz，H-17)，3.98(1H，d，J=10 Hz，H-17)，1個連接吸電子基團的甲基信號1.81(3H，d，J=6.8 Hz，H-18);13C NMR(100 MHz，CD3OD)譜10個烯碳信號δC136.8(C-13)，136.5(C-2)，131.5(C-20)，128.8(C-19)，126.6(C-8)，123.8(C-11)，120.9(C-10)，118.2(C-9)，112.4(C-12)，102.4(C-7)；4個連氧或氮原子的碳信號δC70.3(C-17)，60.2(C-16)，53.4(C-21)，53.4(-OCH3)以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，故確定化合物1為vallesamine。

化合物2紅棕色無定形粉末(氯仿)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS：m/z339[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)譜顯示有4個吲哚環(huán)上的芳香氫信號δH7.09(2H，overlapped，H-9,12)，6.76(2H，overlapped，H-10，11)，2個連接氮、氧或者雙鍵的信號δH5.40(1H，d，J=8 Hz，H-19)，4.82(1H，s，H-5)；1個甲氧基信號δH3.66(3H，s，-OCH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)譜8個烯碳信號δC147.6(C-13)，136.4(C-20)，135.2(C-8)，127.9(C-11)，125.1(C-9)，120.8(C-10)，120.3(C-19)，110.6(C-12)；1個羰基碳信號δC172.5(C-COOCH3)，8個連氧或氮原子的碳信號δC106.3(C-2)，87.4(C-5)，52.0(C-3)，51.8(C-16)，51.4(C-OMe)，51.2(C-7)，46.4(C-21)以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故確定化合物2為picrinine。

化合物3淡黃色無定形粉末(甲醇)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS：m/z353[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)譜顯示有4個吲哚環(huán)上的芳香氫信號δH7.43(1H，d，J=8.4 Hz，H-9)，7.26(1H，d，J=8 Hz，H-12)，7.03(1H，t，J=7.2 Hz，H-11)，6.96(1H，t，J=7.6 Hz，H-10)；2個連接氮、氧或者雙鍵的信號δH5.44(1H，d，J=6.8 Hz，H-19)，4.22(1H，d，H-16)；1個連接吸電子基團的甲基信號δH1.68(3H，d，J=6.4 Hz，H-18);13C NMR(100 MHz，CD3OD)譜10個烯碳信號δC137.2(C-13)，137.1(C-2)，136.6(C-20)，126.6(C-8)，120.7(C-11)，118.3(C-10)，117.2(C-19)，116.8(C-9)，110.6(C-12)，104.7(C-7)；6個連氧或氮原子的碳信號δC67.6(C-15)，57.6(C-5)，54.7(C-22)，51.3(C-23)，50.4(C-14)，50.2(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，故確定化合物3為khasuanine A。

化合物4棕褐色無定形粉末(甲醇)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS：m/z357[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)譜顯示有3個吲哚環(huán)上的芳香氫信號δH6.78(2H，overlapped，H-9，10)，6.68(1H，m，H-11)，1個甲氧基的氫信號δH3.86(3H，s，-OCH3)；1個甲基的氫信號δH1.13(3H，d，J=6.0 Hz，H-18);13C NMR(100 MHz，CD3OD)譜8個烯碳信號δC171.9(C-2)，141.5(C-12)，136.7(C-8)，110.8(C-9)，122.2(C-10)，115.0(C-11)，131.0(C-13)，96.3(C-16)；1個羰基碳信號δC169.6(C-COOCH3)；5個連氧或氮原子的碳信號δC60.7(C-3)，57.5(C-7)，53.1(C-5)，68.2(C-19)，50.9(C-OCH3)，以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故確定化合物4為scholaricine。

化合物5白色晶體(DMSO)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS：m/z385[M]+。1H NMR(400 MHz，DMSO)譜顯示有4個吲哚環(huán)上的芳香氫信號δH7.75(1H，d，J=7.6 Hz，H-9)，7.11(1H，t，J=7.6 Hz，H-11)，6.76(2H，overlapped，H-10，12)，1個與氮原子相連的氫信號δH7.54(1H，s，NH)；4個連接氮、氧或者雙鍵的信號δH5.74(1H，q，J=6.8 Hz，H-19)，4.40(2H，overlapped，H-3，H-21α)，4.25(1H，d，J=15.2 Hz，H-21β)；3個連接吸電子基團的甲基信號δH3.75(3H，s，-OCH3)，3.29(3H，s，-NCH3)，1.80(3H，d，J=7.6 Hz，H-18);13C NMR(100 MHz，DMSO)譜8個烯碳信號δC147.5(C-13)，132.6(C-20)，129.8(C-19)，128.8(C-11)，128.7(C-8)，126.7(C-9)，119.5(C-10)，110.6(C-12)；1個羰基碳信號δC173.2(C-COOCH3)；9個連氧或氮原子的碳信號δC100.0(C-2)，68.8(C-3)，64.7(C-21)，64.6(C-17)，61.8(C-5)，60.6(C-7)，55.7(C-16)，51.9(-OCH3)，49.6(-NCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故確定化合物5為echitamine。

化合物6棕褐色無定形粉末(甲醇)；碘化鉍鉀反應陽性，提示為生物堿類化合物。ESI-MS：m/z499[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)譜顯示有4個吲哚環(huán)上的芳香氫信號δH7.38(1H，d，J=7.2 Hz，H-9)，7.34(1H，d，J=8 Hz，H-12)，7.08(1H，t，J=7.2 Hz，H-11)，7.00(1H，t，J=7.6 Hz，H-10)；4個連接氮、氧或者雙鍵的信號δH5.64(1H，m，H-19)，5.40(1H，br s，H-21)，5.33(2H，t，J=10.4 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)譜12個烯碳信號δC136.4(C-13)，133.4(C-19)，133.0(C-2)，127.3(C-8)，121.1(C-11)，119.2(C-18)，118.8(C-10)，117.3(C-9)，110.9(C-12)，108.9(C-7)，108.9(C-7)，107.9(C-16)；1個羰基碳信號δC165.7(C-C=O)；1個單糖的碳信號δC99.1(C-1′)，76.8(C-3′)，76.7(C-5′)，72.9(C-2′)，70.0(C-4′)，61.2(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故確定化合物6為strictosamide。

3.2 HCT-116和DLD-1細胞毒活性

對HCT-116人結腸癌細胞和DLD-1人結直腸腺癌上皮細胞毒活性，鏡下觀察可見，化合物2和4組細胞形態(tài)不規(guī)則，破碎明顯，其余各化合物不同劑量組細胞形態(tài)規(guī)則，生長良好，未見細胞破碎等現(xiàn)象，陽性藥順鉑組細胞出現(xiàn)明顯的細胞破碎現(xiàn)象。各化合物對HCT-116人結腸癌細胞和DLD-1人結直腸腺癌上皮細胞IC50值(見表1)。從表1可知，化合物4的IC50值為16.7 μg/mL，對HCT-116人結直腸腺癌上皮細胞株具有較高的細胞毒活性。

表1 各化合物對HCT-116和DLD-1的IC50值

*結果用每次實驗平均值± SD表示(n=3)；a陽性對照藥。

*The results are expressed as mean ± SD of each experiment(n=3);aPositive control.

4 結論

本文對大葉糖膠樹的進行了化學成分研究，分離得到6個不同骨架的單萜吲哚生物堿類化合物，其中化合物3和6為首次從該屬植物中分離得到，化合物1、2、4、5為首次從該植物中分離得到。對分離得到的6個化合物進行了對HCT-116人結腸癌細胞和DLD-1人結直腸腺癌上皮細胞毒活性試驗，結果顯示，化合物2和4具有一定的細胞毒性，化合物4對DLD-1人結直腸腺癌上皮細胞的細胞毒性較為明顯(IC50=16.7 μg/mL)。目前，國內外對雞骨常山屬植物的化學成分研究較少，本研究豐富了該屬植物化學結構的多樣性。