張 敏，張錦華

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006）

中國白酒有著悠久的歷史，釀酒和微生物的代謝活動息息相關(guān)，酒曲中含有大量的微生物菌株，使其具有糖化、發(fā)酵和生香的功能，霉菌中的糖化酶可以糖化糧食原料中的還原糖，為酵母的生長和發(fā)酵提供能源物質(zhì)，酵母通過發(fā)酵可以產(chǎn)生乙醇和有特殊香氣成分的酯類。

在各種指標(biāo)中，糖化、酯化和醇化的能力直接反映了白酒生產(chǎn)的能力，是判斷曲的質(zhì)量的重要指標(biāo)[1]，對于現(xiàn)實(shí)釀造生產(chǎn)也具有指導(dǎo)意義。清香型酒曲中也含有多種真菌，如產(chǎn)乙醇酵母和產(chǎn)酯酵母，其中霉菌也具有高度糖化力。生長曲線反映了酵母在培養(yǎng)過程中的生長和繁殖，是了解所用的菌株和后期發(fā)酵培養(yǎng)的生理指標(biāo)。目前，有許多關(guān)于用分光光度法測定酵母生長曲線的研究[2]，而霉菌會形成較大的菌絲體，常用的方法是菌絲干重[3-4]。細(xì)胞中的糖化酶可以將淀粉水解成葡萄糖，其通過微生物發(fā)酵來產(chǎn)生乙醇[5]。糖化力是曲的質(zhì)量控制的主要指標(biāo)，準(zhǔn)確快速地確定糖化力對于制曲生產(chǎn)質(zhì)量具有重要意義[6]。采用最新國標(biāo)中的直接滴定法測定還原糖的含量，滴定終點(diǎn)為無色，改善了舊方法中磚紅色終點(diǎn)難以準(zhǔn)確判斷和控制的缺點(diǎn)。

酵母在白酒釀造過程中對香味物質(zhì)的形成起著重要作用[7]。釀酒酵母是曲的主要酵母，它在發(fā)酵過程中首先利用葡萄糖代謝生成乙醇和乙酸，然后在酵母細(xì)胞內(nèi)酯酶的作用下產(chǎn)生乙酸乙酯[8]。酯化能力主要發(fā)生在早期[9]，而乙酸乙酯是清香型白酒中最重要的物質(zhì)之一[10]，也是清香型白酒香氣的主要成分，其含量越高，香味就越好[11]。氣相色譜法可快速準(zhǔn)確地檢測樣品中乙醇和乙酸乙酯的含量。

對清香型白酒的酒曲中核心真菌菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行了初步研究，為優(yōu)化釀酒廠的生產(chǎn)工藝，提高酒曲的質(zhì)量，生產(chǎn)更優(yōu)質(zhì)的清香型白酒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料和試劑

材料：清香型白酒核心菌株（均取自山西省祁縣某酒廠）。霉菌：紅曲霉（Monascus purpureus Went）；11 號（Aspergillus awamori）；根 霉（Rhizopus）。酵母：白地霉（Geotrichum candidum）；擬內(nèi)孢 霉 酵 母（Endomycopsis）；Kyle（Saccharomyces cerevisiae）；3077（Wickerhamomyces anomalus），3091（Wickerhamomyces anomalus），wind-2（Wickerhamomyces anomalus）。

培養(yǎng)基（均于121 ℃高壓滅菌20 min，試劑均為分析純）：

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar Medium，PDA 培養(yǎng)基）：馬鈴薯（去皮并切塊）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，自然pH值。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD 培養(yǎng)基）：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1000 mL，自然pH值。

酵母浸出粉胨可溶性淀粉培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Soluble Starch Medium，YPS 液體培養(yǎng)基）：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，可溶性淀粉20 g[12]，蒸餾水1000 mL，自然pH值。

生長培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀1 g，酵母粉0.5 g，MgSO4·7H2O 5 g[7]，蒸餾水1000 mL，自然pH值；

糖化培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀1 g，酵母粉0.5 g，MgSO4·7H2O 5 g[7]，蒸餾水1000 mL，自然pH值。

試劑及耗材：酵母DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒，Omega Bio-Tek，中國技術(shù)支持中心；引物ITS4,ITS5、6 × Loading Buffer，上海生物工程生物技 術(shù) 有限 公 司；Marker，λ DNA/hand III、100 bp Marker、2× Taq PCR Mastermix，北京Real-times 生物科技有限公司；蛋白酶K、溶菌酶瓊脂糖G-10、I型核酸染色劑、二巰基乙醇等，上海生物工程生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JA1203N 電子天平，上海恒平有限公司；LDX-75KB 電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市六一儀器廠；HRHPY-300 恒溫培養(yǎng)搖床，青島海爾特種冰箱柜有限公司；UV-5100 紫外分光光度計，METASH 上海元析儀器有限公司；DYY-6C 雙定時電泳凝膠儀，北京六一生物科技有限公司；DY-8C 旋渦振蕩儀，蘇州凈化設(shè)備有限公司；BIO RAD TIOOTM PCR 熱循環(huán)儀，新加坡制造；SC-3614 ZONKIA 低速離心機(jī)，安徽中科Zonkia 科學(xué)儀器有限公司；BioRad 全能成像分析系統(tǒng)，哈爾濱德遠(yuǎn)科技開發(fā)有限公司；2010 ATF 氣相色譜儀，230V Shimadzu Corporation（日本島津）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

對其中幾株未知菌株進(jìn)行測序和鑒定[11，13-14]。將菌株接種到PDA 培養(yǎng)基中，觀察各菌株形態(tài)并記錄。待生長狀態(tài)良好，用接菌環(huán)將菌株接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，制備種子液，在28 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床中振蕩約20 h，當(dāng)酵母在YPD培養(yǎng)基中于600 nm 處的OD 值達(dá)到約1 h，用酵母DNA 試劑盒提取基因組，再用0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳（樣品，5 μL；Marker：λDNA/handIII，5 μL；6×Loading buffer，2 μL）。然后以基因組作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（25 μL 體系：引物：ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，5 μL；ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，5 μL；dNTP，Taq DNA 聚合酶的混合物和緩沖液，12.5 μL；dd 水，2.5 μL；模板，1 μL；PCR 反應(yīng)條件：起始：105 ℃，體系：25 μL；1.94 ℃，5：00；2.94 ℃，0：30；3.55 ℃，0：30；4.72 ℃，1：30；5.轉(zhuǎn)到步驟2,34×；6.72 ℃，10：00；7.12 ℃，∞）。用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳（樣品，5 μL；標(biāo)記物：100 bp 標(biāo)記，5 μL）進(jìn)行測試。照膠并記錄，然后對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.2.2 菌株生長曲線

酵母生長曲線：將菌株接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中制備種子液，在28 ℃，120 r/min 的恒溫?fù)u床中振蕩約14 h，以4000 r/min 離心4 min，棄上清液，加入無菌水懸浮細(xì)胞，并調(diào)節(jié)菌懸液濃度，直至OD 600 nm 值相同。吸取1 mL 菌懸液注入含有100 mL 生長培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，然后每隔2 h 測量OD 600 nm[2，15-17]根據(jù)相關(guān)研究，白地霉應(yīng)在OD 660 nm處進(jìn)行測定[18]。

霉菌的生長曲線：向在PDA 培養(yǎng)基上生長的霉菌中加入40 mL 無菌水，涂布并過濾制備孢子懸浮液。吸取2 mL 懸浮液注入含有100 mL 生長培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，在28 ℃，120 r/min 下振蕩。每24 h 取出1 次并過濾，在80 ℃下干燥至恒定。差值法計算菌絲體干重[3，19-20]。

1.2.3 糖化力

制備霉菌孢子懸浮液，將2 mL懸浮液吸入50 mL YPS 液體培養(yǎng)基中，并在28 ℃，120 r/min 搖床培養(yǎng)。每天24 h 取霉菌培養(yǎng)基，加入10 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液，30 ℃水浴1 h，過濾，取10 mL 濾液倒入50 mL 2%可溶性淀粉溶液中，在40 ℃水浴中靜置1 h，加入3 mL 1 M 氫氧化鈉溶液停止反應(yīng)，再加水定容至100 mL。

將5 mL 樣品，6 mL 斐林試劑，10 mL 水，10 個沸石加入150 mL 錐形瓶中。加熱至沸騰時開始滴定。當(dāng)最后一滴滴下時，溶液藍(lán)色消失并變?yōu)闊o色或淡黃色，即為終點(diǎn)。此過程在3 min 內(nèi)完成。進(jìn)行預(yù)滴定，并設(shè)置空白對照，用蒸餾水替換酶溶液。用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定測定還原糖含量，滴定法參照國家標(biāo)準(zhǔn)[12，21]。

糖化酶活性的定義：在40 ℃，pH4.6 的條件下，水解1 mL 可溶性淀粉溶液1 h 所需的酶量被稱為酶活性的一個單位，以U/mL表示[22]。

1.2.4 產(chǎn)酒力

挑取酵母并將其接種于含有50 mL YPD 液體培養(yǎng)基的100 mL 錐形瓶中，在28 ℃，120 r/min搖動20 h，以4000 r/min離心4 min，然后用無菌水懸浮細(xì)胞，并將所有菌株的OD 值調(diào)整為2。吸取1 mL懸浮液接種到含有50 mL YPD 培養(yǎng)基的100 mL 錐形瓶中，在28 ℃下靜置培養(yǎng)。每24 h 取出樣品用pH 計測量酸度值并蒸餾，收集等量的濾液，通過0.22 μm 濾膜，并通過氣相色譜檢測。氣相色譜條件：進(jìn)樣口：220 ℃，色譜柱為SGEAC-20 毛細(xì)管柱，（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；起始柱溫為32 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至60 ℃；載氣為高純氮?dú)猓兌葹?9.999%）；檢測器溫度為220 ℃，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為350 mL/min，拖尾速度為30 mL/min，分流比為30∶1；注射量為1 μL[13-14，23]。

1.2.5 酯化力

制備懸浮液，接種于上述YPD 液體培養(yǎng)基中，每24 h取出培養(yǎng)液，加入100 mL 60%乙醇溶液，蒸餾后收集75 mL 餾分，用氣相色譜法測定餾液[24]，色譜條件與上述相同。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果用MEGA5 軟件分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，得到鑒定結(jié)果。

生長曲線：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由origin 9.1 軟件分析，取平均值為顯示結(jié)果。

糖化力：在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 種真菌后，提取懸浮液中的糖化酶并測量活性。樣品中還原糖通過如下公式計算[25-26]：

式中：X：樣品中葡糖淀粉酶活性，U/mg；V：滴定空白樣品時所用的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的消耗量，mL；V0：滴定樣品時消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的消耗量，mL；1：每毫升標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液中含有的葡萄糖量，mg/mL；100/5：糖化溶液的總體積與用于滴定的糖化溶液的體積的比率；60/10：比率糖化酶溶液的總體積與糖化酶溶液的體積相對應(yīng)；50：真菌懸浮液的體積，mL。

產(chǎn)酒力和酯化力：用氣相色譜法檢測不同濃度梯度的樣品，以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。乙酸乙酯趨勢線公式：y=2E-6x +0.0028，R2=0.9997。使用相同的方法，繪制乙醇濃度和峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1E-5x-0.0727，R2=0.9994。將樣品的峰面積值代入公式，計算樣品濃度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)和分子生物學(xué)特征

圖1 是在PDA 固體培養(yǎng)基上于28 ℃條件下生長3～5 d 的真菌菌落形態(tài)圖片。菌株形態(tài)特征見表1。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

使用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步鑒定未知菌株。如圖2 所示，提取酵母基因組并進(jìn)行PCR 反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳。在凝膠圖中，泳道M：100 bp marker，泳道1，2：Kyle，片段大小約800 bp，泳道3，4：3091，泳道5，6：Wind-2，泳道7，8：3077，片段大小均約為600 bp。

圖1 真菌形態(tài)學(xué)

圖2 Kyle、3091、Wind-2,3077的PCR產(chǎn)物凝膠圖

表1 菌株形態(tài)特征

圖3 Kyle、3091、Wind-2、3077的系統(tǒng)發(fā)育樹

系統(tǒng)發(fā)育樹分析：保留測序結(jié)果中可靠的序列，通過NCBI進(jìn)行比較，獲得具有更高同源性的已知分類群，然后選取并使用這些序列通過Mega.5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。如圖3 所示，經(jīng)過比較，kyle 和釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeculture CBS：7764（KY105065.1）之間的相似性高達(dá)95%，因此它可能被鑒定為釀酒酵母，而3077,3091 和wind-2 與異常威克漢姆酵母的相似性高達(dá)99%，因此它們具有高度的同源性。菌種11 號由南昌科昌生物技術(shù)有限公司鑒定，與泡盛曲霉具有高度同源性。

2.3 菌株的生長曲線

圖4 顯示酵母3077、3091、Kyle、Wind-2、Geotrichum candidun、Endomycopsis在600 nm 處的OD值，而白地霉在660 nm 處測量。延滯期為0～6 h，指數(shù)生長期為6～30 h，穩(wěn)定期為30 h。在細(xì)胞生長期間培養(yǎng)基中同時含有活細(xì)胞和死細(xì)胞，以及未使用的培養(yǎng)基和代謝物。因此，培養(yǎng)液的吸光度不能反映衰退情況[27]。

圖4 酵母菌的生長曲線

計算抽濾前濾紙的干重與抽濾后濾紙和菌絲體的總干重之間的差值。在圖5 中，霉菌細(xì)胞干重隨時間而變化，其趨勢先增加后減小。11號和紅曲霉菌絲體的干重在第4 天達(dá)到最大值，而根霉菌的菌絲干重在第3天達(dá)到最大值。

2.4 菌株的糖化力

圖5 霉菌生長曲線

圖6 顯示了3 種不同霉菌的葡萄糖淀粉酶活性隨時間的變化趨勢，隨著時間的延長，均出現(xiàn)先增加而后下降的趨勢。紅曲霉在開始時生長緩慢，然后降低，葡萄糖淀粉酶活性達(dá)到最大值，第5 天達(dá)到5.76 U/mL;而根霉的最大葡萄糖淀粉酶活性在第3天為7.68 U/mL，11號為6.94 U/mL。

圖6 霉菌糖化力

2.5 酵母的產(chǎn)酒能力和酯化能力

圖7 是6 種酵母的乙酸乙酯產(chǎn)量的變化曲線。不同酵母在不同的發(fā)酵階段表現(xiàn)出不同的產(chǎn)酯特性。在第3 天，3077、白地霉和Wind-2 的乙酸乙酯含量分別達(dá)到最高值0.178 mg/mL、0.029 mg/mL 和0.558 mg/mL；在第4天，3091，Kyle和擬內(nèi)孢霉的乙酸乙酯含量分別達(dá)到最高值0.144 mg/mL，0.16 mg/mL和0.705 mg/mL。在發(fā)酵期內(nèi)，菌株擬內(nèi)孢霉表現(xiàn)出較高的合成乙酸乙酯的能力，乙酸乙酯產(chǎn)量明顯高于其他酵母，是清香型白酒中主要的產(chǎn)酯酵母。

圖7 酵母酯化能力

圖8 顯示6 株酵母合成乙醇產(chǎn)量的變化。隨著時間的推移，3077、Endomycopsis、Kyle 和Wind-2 的乙醇產(chǎn)量逐漸減少，第1 天的最大含量分別為17.18 mg/mL、17.43 mg/mL、19.27 mg/mL 和27.05 mg/mL。3091 和白地霉的乙醇含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，第4 天最高分別為8.78 mg/mL 和40.72 mg/mL。在實(shí)驗(yàn)測定的5 d 發(fā)酵時間內(nèi)，白地霉乙醇含量最高，顯著高于其他5 株酵母，表現(xiàn)出優(yōu)異的產(chǎn)酒能力。

圖8 酵母產(chǎn)酒力

3 結(jié)論

通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定了核心菌株中幾株未知菌株，分別屬于釀酒酵母，異常維克漢遜酵母和泡盛曲霉。

在測量了菌株的糖化能力后，我們發(fā)現(xiàn)在這些真菌中，根霉具有最強(qiáng)的糖化力，最強(qiáng)的葡萄糖淀粉酶活性為7.68 U/mL，而糖化能力最弱的則是擬內(nèi)孢霉酵母酵母，為3.175 U/mL。

在這些酵母中，結(jié)果顯示具有最強(qiáng)酯化力的酵母是擬內(nèi)孢霉酵母，乙酸乙酯產(chǎn)量為0.705mg/mL；其次是Wind-2，含量為0.558 mg/mL；乙酸乙酯的最低產(chǎn)量為白地霉，0.029 mg/mL，相反，產(chǎn)乙醇的能力最強(qiáng)，最高含量為40.72 mg/mL，產(chǎn)酒精能力最弱的菌株為3091，含量8.78 mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為各核心菌種在酒曲中的靈活運(yùn)用及清香型白酒的釀造工藝的優(yōu)化提供了理論依據(jù)。