苑玉鑫，李樹華，玄 猛，蘇焜儀，呂 林，胡 潔

（1.中山大學(xué)中山眼科中心//眼科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510060；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院//廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510120）

視網(wǎng)膜新生血管性疾病，例如增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變通常是由于視網(wǎng)膜的缺血和缺氧引起的［1-2］。眾所周知，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在新生血管的形成過程中起著重要作用［3-6］。目前，玻璃體腔注射抗VEGF 藥物已成為視網(wǎng)膜新生血管性疾病的一線臨床治療方法，但是，在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗VEGF 藥物并不能完全阻止這類病變的發(fā)生發(fā)展［2］，絕大多數(shù)患者需要反復(fù)的治療，此外，部分患者對抗VEGF 藥物無應(yīng)答。因此，尋找VEGF 之外的其他治療靶點(diǎn)是迫切和必要的。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，自噬能促進(jìn)腫瘤組織和心血管系統(tǒng)的新生血管形成［7-9］，并且該過程不伴隨VEGF表達(dá)水平的變化［7］，提示自噬可能是引起新生血管形成的另一途徑。因此，從細(xì)胞自噬的角度研究視網(wǎng)膜新生血管性疾病可能為其治療提供新的思路。最新的研究表明，哺乳動物中唯一的細(xì)胞外基質(zhì)裂解酶-乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）可以正向調(diào)控腫瘤膠質(zhì)細(xì)胞的自噬水平，當(dāng)敲除小鼠胚胎纖維母細(xì)胞的Hpa 后，細(xì)胞的自噬水平降低［10］。然而，在缺氧狀態(tài)下，Hpa 對人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal endothelial cells，HREC）自噬水平的影響尚未見報道。本研究擬通過觀察缺氧狀態(tài)下，Hpa 的競爭性抑制劑-硫代磷酸甘露醇戊糖（phosphomannopentaosesulfate，PI-88）［11］對HREC 自噬的作用，探討Hpa 對HREC 自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HREC 購自西班牙innoprot 公司；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（Endothelial Cell Medium）培養(yǎng)基（美國Sciencell 公司），胎牛血清（美國Sciencell 公司），內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充劑（endothelial cell growth supplement，ECGS，美國Sciencell 公司），雙抗混合液（青霉素+鏈霉素，美國Sciencell 公司）；PI-88（澳大利亞Progen Industrials 公司）；氯化鈷（CoCl2，美國Sigma公司）；PBS 溶液（美國Hyclone 公司）；40 g/L 多聚甲醛（廣州威佳科技有限公司）；兔抗人LC3B 抗體、兔抗人GAPDH 抗體、AlexaFluor 488 羊抗兔二抗、HRP-山羊抗兔二抗（美國CST 公司）；HB AP 210 0001 綠色熒光蛋白自噬相關(guān)蛋白標(biāo)記腺病毒（上海漢恒生物技術(shù)有限公司）；DAPI（Sigma 公司）；牛血清蛋白（美國Sigma 公司）；TritonX-100（北京博奧森公司）；抗熒光衰減封片劑（Vector 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（thermo 公司）；PVDF 膜（Milipore 公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss 公司）；Western Blot配膠試劑盒、細(xì)胞裂解液（RIPA）、蛋白酶抑制劑（PMSF）、5×Page 蛋白電泳上樣緩沖液（碧云天生物）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)

HREC 的細(xì)胞系放置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細(xì)胞生長至80%～90%融合時傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。使用100 mL/L 的胎牛血清、1%ECGS 及1%抗生素（青霉素+鏈霉素）的ECM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入PI-88 在的終濃度為5 μg/mL。本實(shí)驗(yàn)共分為3 組：正常組（ECM 空白對照）、缺氧組（含CoCl2 100 μmol/L 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h）、實(shí)驗(yàn)組（缺氧+PI-88 組，PI-88 終濃度5 μg/mL 在CoCl2100 μmol/L 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h）。

1.3 Western Blot

收集每組的HREC，用含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的細(xì)胞裂解液（RIPA）（PMSF∶RIPA=1∶100）提取蛋白質(zhì)，并用BCA 法進(jìn)行定量。采用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后200 mA 電轉(zhuǎn)1.5 h 轉(zhuǎn)至PVDF 膜，使用5%脫脂奶粉在室溫下進(jìn)行搖床封閉，時長1 h，隨后分別加入兔抗人LC3B IgG（1∶1 000）、兔抗人GADPH IgG（1∶1 000），在4 ℃冰箱中過夜；用TBS-T 溶液清洗PVDF 膜3 次，每次10 min，洗滌后加HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶1 000），并在室溫下孵育1 h，用TBS-T 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min；用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行條帶顯影，在BIO-RAD 專用化學(xué)曝光儀內(nèi)進(jìn)行曝光，并使用Image Lab5.2.1 軟件進(jìn)行對蛋白質(zhì)的灰度值的半定量檢測，比較各組間LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ灰度值之比。

1.4 免疫熒光染色

通過免疫熒光染色法檢測不同Hpa 表達(dá)狀態(tài)下HREC 的自噬水平。消化HREC 后在無菌玻璃進(jìn)行細(xì)胞爬片的接種，待載玻片上的細(xì)胞長到70%后，將其在上述分組中分別處理24 h，在無菌環(huán)境中去除蓋玻片，并使用40 g/L 多聚甲醛在室溫下固定20 min，用5%BSA 封閉1 h，用1% TritonX-100 滲透5 min，放于濕盒中并添加5%BSA 稀釋的兔抗人LC3 IgG（1∶1 000），置于4 ℃冰箱中過夜；次日置于水平搖床上以PBS-T 溶液清洗上述的細(xì)胞爬片，每次10 min，共清洗3 次，然后使用Alexa-Fluor 488 羊抗兔二抗孵育，時長1 h，隨后洗滌3 次，每次10 min；使用DAPI 對細(xì)胞核進(jìn)行染色10 min，再洗滌2 次，每次10 min，使用封片劑進(jìn)行封片后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察LC3 蛋白的分布和表達(dá)水平。

1.5 LC3-GFP 偶聯(lián)腺病毒檢測活細(xì)胞HREC 內(nèi)的自噬體形成

外源性導(dǎo)入GFP-LC3 腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將模型建立24 h 后的各組細(xì)胞直接置于活細(xì)胞熒光顯微鏡下，觀察活細(xì)胞熒光強(qiáng)度。對隨機(jī)視野進(jìn)行拍攝照片并對照片上熒光亮點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0 對所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，呈正態(tài)分布的定量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，多組均數(shù)比較，各組定量資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性采用單因素方差分析進(jìn)行，有統(tǒng)計學(xué)差異時進(jìn)一步采用Bonferroni 法進(jìn)行多重比較；反之，用Kruskal WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計分析。P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧狀態(tài)下HREC 內(nèi)自噬標(biāo)記蛋白表達(dá)水平上調(diào)

自噬相關(guān)蛋白LC3 的含量能間接反映細(xì)胞自噬水平的高低，通常情況下LC3 含量越高，反映細(xì)胞的自噬水平越高。免疫熒光結(jié)果顯示，缺氧條件下，HREC 內(nèi)的LC3 蛋白含量比正常組的明顯增多（圖1）。圖1A 示正常組，圖1B 示缺氧組（100 μmol/L CoCl2），藍(lán)色為DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核（圖1A，箭頭所指示），綠色為自噬相關(guān)蛋白LC3（圖1B，箭頭所示）。缺氧組HREC 內(nèi)綠色熒光較正常組明顯增強(qiáng)。

細(xì)胞內(nèi)自噬發(fā)生的情況下，LC3-Ⅰ蛋白會向LC3-Ⅱ蛋白轉(zhuǎn)化，因此LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比例越高，細(xì)胞的自噬水平就越高，LC3B 蛋白抗體可以同時標(biāo)記LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ蛋白，故我們進(jìn)行了Western Blot 實(shí)驗(yàn)，可以同時顯示LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ條帶，進(jìn)行二者量的對比，結(jié)果顯示：3 組間存在統(tǒng)計學(xué)差異（F=33.04，P=0.000 6 ＜0.05），采用Bonferroni 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，缺氧組HREC 內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增高（灰度值，2.14 ± 0.33 比4.69 ± 0.54，P=0.001 ＜0.05），說明缺氧條件下，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ蛋白增加，HREC 自噬水平升高（圖2）。

2.2 Hpa 抑制劑PI-88 可以降低缺氧狀態(tài)下HREC 的自噬標(biāo)記蛋白的表達(dá)量

免疫熒光結(jié)果顯示，缺氧條件下，HREC 內(nèi)的LC3 蛋白含量較正常組的明顯增加，而加入了Hpa抑制劑PI-88 的缺氧組細(xì)胞內(nèi)LC3 含量明顯下降（圖1B、C）。圖1B示缺氧組（100 μmol/L CoCl2），圖1C 示實(shí)驗(yàn)組（100 μmol/L CoCl2+5 μg/mL PI-88）。綠色為自噬相關(guān)蛋白LC3（圖1B-C，箭頭所指）。Hpa 抑制劑PI-88 可以抑制缺氧條件下HREC 中自噬相關(guān)蛋白LC3 的表達(dá)。

圖1 HREC 內(nèi)LC3 免疫熒光結(jié)果Fig.1 Immunofluorescent detection of cellular distribution of LC3 in HREC

Western Blot結(jié)果顯示：缺氧+PI-88組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ（灰度值）比值下降（與缺氧組比較，3.51±0.20比4.69±0.54，P=0.027 ＜0.05），表明在缺氧條件下，Hpa 被抑制后，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化水平下降，HREC的自噬水平降低。證明Hpa可以正向調(diào)節(jié)HREC 的自噬水平（圖2）。

圖2 HREC 中LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值Fig.2 The ratio of LC3-Ⅱ/Ⅰin HREC

2.3 Hpa 抑制劑PI-88 可減少缺氧狀態(tài)下活細(xì)胞中自噬體的數(shù)量

LC3 作為研究細(xì)胞自噬常用的標(biāo)記蛋白，在正常細(xì)胞內(nèi)絕對含量并不高，因此，行熒光染色的最佳實(shí)驗(yàn)方案為外源性導(dǎo)入GFP-LC3 腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提高LC3 含量并使其與綠色熒光蛋白GFP 偶聯(lián)，可直接在活細(xì)胞下觀察細(xì)胞的自噬水平。細(xì)胞自噬水平低時，GFP 呈散在的綠色熒光；細(xì)胞自噬水平高時，由于LC3蛋白聚集于自噬體周圍，故自噬體呈現(xiàn)點(diǎn)狀綠色強(qiáng)熒光，故此方法能更加直接地反映細(xì)胞的自噬水平（圖3）。結(jié)果顯示：與缺氧組相比，實(shí)驗(yàn)組HREC 的細(xì)胞內(nèi)熒光亮點(diǎn)數(shù)目明顯減少（圖3）。圖3A為缺氧組（100 μmol/L CoCl2），圖3B為實(shí)驗(yàn)組（100 μmol/L CoCl2+5 μg/mL PI-88），圖中每個亮點(diǎn)代表一個自噬泡，亮點(diǎn)數(shù)量越多，自噬水平越強(qiáng)，熒光彌散則代表自噬水平低。表明Hpa 抑制劑PI-88 可以抑制缺氧條件下的HREC 自噬水平。

圖3 LC3-GFP 免疫熒光結(jié)果Fig.3 LC3-GFP immunofluorescent detection in HREC

3 討論

自噬是細(xì)胞中一種進(jìn)化比較保守的分解代謝途徑。細(xì)胞質(zhì)成分，包括異常積累的蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子以及受損的細(xì)胞器，都是通過自噬作用被包裹在自噬體的囊泡中，隨后自噬體可以與溶酶體進(jìn)行融合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解及回收。這個過程正常發(fā)生在每個細(xì)胞水平，以代謝和去除異常折疊的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器，為細(xì)胞的重建、修復(fù)和再生提供原材料，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［12-14］。

研究表明在慢性缺氧和缺血疾病中，自噬現(xiàn)象會增加，并且自噬能促進(jìn)心腦血管系統(tǒng)中的新生血管形成［7］。Du 等［7］在體外培養(yǎng)的牛主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中加入自噬抑制劑3-MA 和沉默ATG-5 后，細(xì)胞的成管和遷移降低，而過表達(dá)ATG-5 以促進(jìn)細(xì)胞自噬時，細(xì)胞的增殖和遷移也顯著增強(qiáng)，而誘導(dǎo)新生血管形成的重要上游因子，例如VEGF、血小板源生長因子和整合素α-V 的水平是保持不變的，提示自噬在新生血管的形成中不依賴VEGF 的經(jīng)典通路而發(fā)揮重要的作用。

Hpa 可以正向調(diào)控腫瘤細(xì)胞中的自噬水平。Hpa 是哺乳動物中唯一能夠裂解硫酸乙酰肝素的酶，參與許多重要的病理生理過程，例如胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、炎癥等。其作為一種潛在酶被細(xì)胞分泌，可被內(nèi)化在自噬-溶酶體系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白水解和激活的過程。研究顯示在腫瘤細(xì)胞中，過表達(dá)Hpa 可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬水平升高；而沉默小鼠胚胎纖維母細(xì)胞的Hpa，細(xì)胞自噬水平會降低［10］。

Hpa 實(shí)際上是一種葡糖苷酸內(nèi)切酶，其作用是水解硫酸乙酰肝素蛋白多糖HS 側(cè)鏈與其應(yīng)的核心蛋白之間的糖苷鍵［15-17］。PI-88 與硫酸乙酰肝素蛋白多糖的HS 側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相似，即與Hpa 作用的底物結(jié)構(gòu)高度類似，故可以競爭性結(jié)合Hpa，抑制Hpa 對HS 的降解活性，從而抑制Hpa 發(fā)揮作用［11］。我們前期的研究工作也證明，對低氧誘導(dǎo)小鼠腹腔注射PI-88 可以明顯減少視網(wǎng)膜組織的Hpa 含量，在體外培養(yǎng)的HREC 中加入PI-88 也可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)的Hpa 水平［18-19］。

我們的研究通過對HREC 進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)，并在此基礎(chǔ)上利用Hpa 抑制劑PI-88 作用于上述細(xì)胞，形成組間Hpa 差異。采用免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡對HREC 的表達(dá)的LC3 水平進(jìn)行檢測。LC3是細(xì)胞自噬的特定標(biāo)記物，其含量可反映自噬水平。其可分為兩個亞型，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬，LC3-Ⅰ可轉(zhuǎn)為LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，因此LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比率可以反映細(xì)胞自噬初始階段的水平［20］。研究結(jié)果顯示，在PI-88 抑制HREC 的Hpa 表達(dá)后，除了LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達(dá)量降低外，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值也明顯降低，提示自噬水平降低。為了進(jìn)一步證明研究結(jié)果，我們使用GFP-LC3 偶連腺病毒轉(zhuǎn)染HREC，使細(xì)胞的自噬泡被帶有熒光素GFP-LC3 標(biāo)記，在活細(xì)胞狀態(tài)下觀察Hpa 被抑制后，細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量明顯減少，進(jìn)一步直接證明抑制Hpa 可以降低HREC 的自噬水平。

Hpa 可能通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mammalian target of rapamycinm complex1，mTOR1）的通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。mTOR1 是一種對營養(yǎng)敏感的激酶，研究顯示，在饑餓時，其可負(fù)向調(diào)控自噬［21］。Shteingauz 等［10］報道，在過表達(dá)Hpa的腫瘤細(xì)胞中，mTOR1 下游特異的磷酸-RPS6KB/p70 S6 激酶水平降低，同時，細(xì)胞的自噬水平顯著提高；而抑制這些細(xì)胞的Hpa 表達(dá)，則可以增加磷酸-RPS6KB/p70 S6 激酶表達(dá)，而細(xì)胞的自噬水平降低。因此，本研究推斷Hpa 在HREC 中可能通過激活mTOR1 途徑而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)，這需要我們在未來的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

長久以來，VEGF 被認(rèn)為是導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管性眼病的重要因素，目前其治療也主要基于抗VEGF 藥物。本研究通過免疫熒光染色，蛋白免疫印跡法和GFP-LC3 腺病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在HREC 中，使用Hpa 的抑制劑PI-88 可以降低細(xì)胞的自噬水平，從而提示Hpa-自噬通路可能為新生血管性疾病的治療提供新思路。