鄭 熙，余惠珍，高 潔，朱鵬立

（1.福建省立醫(yī)院心血管內三科，福建福州 350001；2.福建省立醫(yī)院南院內科，福建福州 350028；3.福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院老年醫(yī)學研究室，福建福州 350001；4.福建省臨床老年病研究所，福建福州 350001）

心肌梗死是嚴重危害人類健康的常見心血管疾病之一，其導致的死亡占心血管病死亡原因的50%以上。心肌梗死給機體帶來的危害很大一部分是由于心肌梗死后心室重塑所造成的。心室重塑的發(fā)生發(fā)展主要包括心肌細胞、非心肌細胞及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的改變，組織基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）通過分解基質中的肽鍵來降解ECM，使心肌的順應性下降。人組織基質金屬蛋白酶抑制物1（human tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1，hTIMP-1）是一種內源性的MMP 的天然抑制劑［1］。TIMP-1 作為MMP-2、MMP-9 的特異性抑制劑，不僅能阻止MMP-2、MMP-9 酶原的活化，同時還可抑制已活化的MMP-2、MMP-9［2］。既往實驗提示TIMP-1基因敲除的小鼠，將導致其左心室發(fā)生肥大性改變、心功能惡化［3］。組織激肽釋放酶（tissue kallikrein，TK-1）是絲氨酸蛋白酶［4］，具有心肌保護作用及治療作用，通過緩激肽B2 受體能減少心肌缺血-再灌注的損傷［5-6］。心梗時缺血及壞死的心肌細胞會釋放一系列促炎細胞因子和趨化因子，將炎癥細胞募集到缺血區(qū)［7］。如巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等。MIF 在其中起到關鍵作用，它能誘導多種炎癥因子生成［8］，其誘導的炎癥因子可抑制心肌收縮，導致心室重塑和心肌細胞凋亡等［9］。目前有研究發(fā)現(xiàn)由促炎因子MIF 導致的心肌細胞凋亡，可被其抑制劑所抑制，從而改善心功能預后［10］。余細勇等［11］發(fā)現(xiàn)糖耐量異?？蓪е滦募〖毎把装Y因子MIF 表達，通過調節(jié)G 蛋白藕聯(lián)受體激酶影響心肌細胞能量代謝，從而影響心力衰竭的發(fā)生發(fā)展進程，我們推測對心梗后炎癥反應的抑制能改善心室重塑。結合以上研究結果，TIMP-1 通過抑制細胞外基質從而改善心梗后心室重塑發(fā)生發(fā)展，而TK-1 通過多條機制路徑發(fā)揮抗炎、保護血管內皮等作用，減輕心梗后心肌組織局部炎癥反應，從而抑制心室重塑。本題組前期實驗結果提示聯(lián)合TK-1 與TIMP-1 可抑制血管平滑肌細胞的增殖及球囊拉傷后血管再狹窄效應，具有良好的生物學功能［1，12］。與傳統(tǒng)的單基因轉染相比，聯(lián)合多基因轉染不僅擁有更高的表達效率，還能使目的基因間發(fā)揮協(xié)同作用。如Gaballa等［13］研究發(fā)現(xiàn)采用Ang-1和VEGF聯(lián)合基因轉染心肌梗死豬的心肌組織，與單基因轉染相比，其生成血管數(shù)量及成熟度都更好。故本實驗采用hTIMP-1與TK-1聯(lián)合基因轉染改善大鼠心梗后心室重塑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性Sprague-Dawley 大鼠75 只，體質量250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［許可證號SCXX（閩）2012-0001］。SD 大鼠飼養(yǎng)在福建醫(yī)科大學實驗動物中心，人工光源明暗各12 h，24 h 自由飲水取食，恒濕（55±5）%、恒溫（22±2）℃。水、鼠飼料和鼠墊料由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物實驗的設計和實施均遵守福建醫(yī)科大學的相關規(guī)定，通過福建醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 試劑和設備

本課題組前期構建并純化保存的重組腺病毒包括：Ad-EGFP是一種僅含有EGFP基因作為對照病毒的腺病毒載體，Ad-hTK1-IRES-EGFP（TK-1），Ad-hTIMP1-IRES-EGFP（TIMP-1），Ad-hTK1-hTIMP1-IRES-EGFP（TK-1 和TIMP-1）［14-15］。

抗TK-1 抗體（ab59271，美國abcam 公司），抗TIMP-1 抗體（250883，美國ABBIOTEC 公司），抗MMP-2 抗體（sc-13595，美國Santa Cruz 公司），抗MMP-9 抗 體（10375-2-AP，美 國Proteintech 公司），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔/鼠二抗（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司），蛋白提取試劑盒（上海碧云天公司），TUNEL 試劑盒（上海羅氏制藥有限公司），4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。

1.3 動物分組

將75 只清潔級雄性Sprague-Dawley 大鼠按照體質量編號后，采用隨機數(shù)字表法隨機分成6 組。假手術組10 只穿線不結扎，死亡1 只，存活9 只；生理鹽水組13 只在心梗交界區(qū)注射生理鹽水，死亡5 只，存活8 只；對照病毒組13 只注射對照病毒，死亡4 只，存活9 只；TK-1 組13 只注射TK-1基因，死亡2 只，存活11 只；TIMP-1 組13 只注射TIMP-1基因，死亡4 只，存活9 只；聯(lián)合基因組13 只注射聯(lián)合基因，死亡3 只，存活10 只。其死亡原因可能為：術中大出血、術后室顫、術后肺部感染、嚴重心衰、大鼠互相撕咬所致。建模存活率約74.67%。

1.4 心肌梗死模型的構建及干預

100 mL/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。大鼠固定于操作板上連接心電圖。取頸部正中切口約2～3 cm，行氣管插管，連接小動物呼吸機（呼吸機頻率為60 次/min，吸氣呼氣比為1∶1.5，潮氣量約為3 mL/100 g，吸入氧濃度為100%）。左前胸取切口長約3～4 cm，暴露心臟，5-0 縫合線結扎左前降支。隨后可見梗死區(qū)域心肌顏色變淺，在梗死交界區(qū)分別注射100 μL 生理鹽水、對照病毒、TK-1、TIMP-1、聯(lián)合基因［15］（病毒量均為1×1010pfu/只，保存于100 μL 的病毒稀釋液）?？p合關胸。術后予10 萬單位青霉素鈉溶液腹腔注射，連續(xù)3 d。假手術組只用5-0 縫合線穿過左前降支而不結扎，其余步驟均同冠脈結扎組。

1.5 心功能檢測

術后28 d，采用100 mL/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。用數(shù)字高幀頻超聲心動圖評價各組大鼠心功能。檢測左室舒張期內徑（LVIDd）、左室收縮期內徑（LVIDs）；根據(jù)公式計算射血分數(shù)（EF）、短軸縮短率（FS）。每個參數(shù)連續(xù)記錄3 個心動周期。

1.6 組織形態(tài)學分析

術后28 d，待超聲心動圖評估大鼠心功能后予處死大鼠。取大鼠心肌組織石蠟包埋切片（約3 μm）。HE 染色鏡下觀察心肌組織炎癥細胞浸潤；TTC 染色觀察心肌梗死面積，Image-Pro Plus 6.0 圖像軟件分析各組大鼠心肌梗死面積。

1.7 TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡

石蠟切片通透，滴加TUNEL 反應混合液，避光孵育。滴加converter-POD 避光孵育。加DAB顯色液，蘇木素復染。封片。凋亡細胞陽性指數(shù)（apoptosis index，AI）等于陽性凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.8 Western blot 檢測

20 μg 總蛋白質上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（4%濃縮膠，12%分離膠）。于5%BSA 中室溫封閉。一抗TK-1（0.5 μg/mL），TIMP-1（1 μg/mL），MIF（1 μg/mL），NF-κB（1 μg/mL），MMP-2（1.25 μg/mL），MMP-9（1.25 μg/mL），孵育過夜。二抗（0.2 μg/mL）孵育。Image-Pro Plus 6.0 圖像軟件分析目的蛋白與β-actin 灰度值比。

1.9 免疫組織化學法檢測

石蠟切片抗原修復、封閉。一抗（MIF 4 μg/mL、NF-κB 4 μg/mL、MMP-2 5 μg/mL、MMP-9 5 μg/mL）孵育。二抗孵育，DAB 顯色，脫水，透明，封片。光鏡下每張切片隨機選擇3 個視野（400×），采用Image-Pro Plus 6.0 圖像軟件進行分析。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行分析。心功能參數(shù)、心肌梗死面積百分比、心肌細胞凋亡指數(shù)、炎癥因子及目的蛋白的表達量以均數(shù)±標準差表示。各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。方差不齊者，使用H檢驗（多組比較的秩和檢驗），表達量以中位數(shù)和四分位數(shù)表示。采用雙側檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基因治療組表達TK-1 和TIMP-1

Western blot 結果提示僅TK-1 組和聯(lián)合基因組有TK-1 蛋白表達，且兩組間TK-1 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；僅TIMP-1 組和聯(lián)合基因組有TIMP-1 蛋白表達，且兩組間hTIMP-1蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖1）。假手術組、生理鹽水組、對照病毒組均無TK-1 或TIMP-1 蛋白表達。

圖1 蛋白免疫印跡法觀察大鼠心肌組織TK1 及TIMP1 的表達情況Fig.1 Expression of TK1 and TIMP1 in rat myocardium by Western blotting

2.2 腺病毒載體過表達TK-1 和TIMP-1 對大鼠心功能的影響

與假手術組相比，對照病毒組大鼠LVIDd、LVIDs升高，F(xiàn)S、EF降低（P＜0.01）。與對照病毒組相比，TK-1 組、TIMP-1 組或聯(lián)合基因組LVIDd 降低，F(xiàn)S、EF 升高（P＜0.01）。與TK-1 組或TIMP-1組相比，聯(lián)合基因組LVIDd 降低，以及FS、EF 升高更顯著（P＜0.05）。生理鹽水組與對照病毒組相比各項差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；表1）。

2.3 腺病毒載體過表達TK-1 和TIMP-1 對大鼠心肌組織梗死面積的影響

HE 染色鏡下可見假手術組心肌細胞完整，無壞死或炎性細胞浸潤，心肌橫紋清晰可見；與假手術組相比，對照病毒組心肌組織中嗜酸性粒細胞浸潤、中性粒細胞浸潤、心肌細胞分布不均勻、甚至斷裂；與對照病毒組相比，TK-1 組、TIMP-1組或聯(lián)合基因組心肌損傷程度和炎癥程度改善（圖2）。與假手術組相比，對照病毒組心肌梗死面積百分比升高（P＜0.01）。與對照病毒組組相比，TK-1 組、TIMP-1 組或聯(lián)合基因組心肌梗死面積百分比下降（P＜0.01）；相比于TK-1 組或TIMP-1組，聯(lián)合基因組心肌梗死面積百分比降低更顯著（P＜0.05）。生理鹽水組與對照病毒組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖3）。

表1 病毒載體轉染后的各組大鼠心功能參數(shù)改變Table 1 Changes of cardiac function parameters in rats transfected with viral vectors［P50（P25～P75），（±s）］

表1 病毒載體轉染后的各組大鼠心功能參數(shù)改變Table 1 Changes of cardiac function parameters in rats transfected with viral vectors［P50（P25～P75），（±s）］

LVIDs：Left ventricular systolic diameter；LVIDd：Left ventricular diastolic diameter；FS：Shortening rate of short axis；EF：Ejection fraction.For LVIDs：H values between groups is 4.271.1）Compared with sham operation group，P=0.007，0.021；2）Compared with control virus，P=0.036，0.041，0.029；3）Compared with TK-1 group，P=0.064；4）Compared with TIMP-1 group，P=0.085.For LVIDd：F values between groups is 1.433.1）Compared with sham operation group，P=0.022，0.039，0.31，0.27，0.53.For FS：F values between groups is 22.443.1）Compared with sham operation group，P=0.000，0.000；2）Compared with control virus，P=0.001，0.001，0.00；3）Compared with TK-1 group，P=0.037；4）Compared with TIMP-1 group，P=0.047.And for EF：F values between groups is 26.802.1）Compared with sham operation group，P=0.000，0.000；2）Compared with control virus，P=0.006，0.002，0.00；3）Compared with TK-1 group，P=0.003；4）Compared with TIMP-1 group，P=0.01.The sample size of each group：n=4.One-way chi-square analysis.

圖2 各組大鼠左室形態(tài)學變化（200×）Fig.2 Morphological changes of left ventricle in rats of each group（200×）

2.4 腺病毒載體過表達TK-1 和TIMP-1 對大鼠心肌細胞凋亡的影響

與假手術組相比，對照病毒組大鼠AI 升高（P＜0.01）。與對照病毒組相比，TK-1 組、TIMP-1或聯(lián)合基因組AI 下降（P＜0.01）。與TK-1 組或TIMP-1 組比較，聯(lián)合基因組AI 降低更顯著（P＜0.05）。生理鹽水組與對照病毒組相比，AI 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖4）。

圖3 病毒載體轉染后對各組大鼠左室梗死面積的影響Fig.3 Influences of viral vector transfection on left ventricular infarct size in rats of each group

2.5 腺病毒載體過表達TK-1 和TIMP-1 對大鼠心肌組織炎癥因子水平的影響

與假手術組相比，對照病毒組大鼠心肌組織各炎癥因子的表達水平升高（P＜0.05）。與對照病毒組相比，TK-1 組、TIMP-1 組或聯(lián)合基因組各炎癥因子表達水平下降（P＜0.05）。與TK-1 組或TIMP-1 組比較，聯(lián)合基因組各炎癥因子的表達水平降低更顯著（P＜0.05）。生理鹽水組與對照病毒組相比，各炎癥因子表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖5～9）。

圖4 病毒載體轉染后對對各組大鼠心肌細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of viral vector transfection on myocardial cell apoptosis in rats

3 討論

心梗后的病理過程受到許多因素的影響，其中炎癥反應對于纖維化愈合至關重要［16］。急性心梗后在梗死區(qū)域大量的炎癥因子生成，NF-κB 在炎癥反應中啟到了樞紐的作用［17］，它與眾多的炎性因子相互激活、活化，形成連鎖式爆發(fā)反應［9］，通過減少心梗區(qū)域內NF-κB 的表達，能抑制心肌細胞凋亡，改善心功能及心室重塑等［18］。此外，MIF 也是炎癥反應中不可忽視的一部分，它被稱為多效性炎性細胞因子［19］，它不僅能激活IL-1、TNF-α、IFN-γ等炎性因子、加劇炎癥反應［8］，而且還能抑制心肌收縮、惡化心功能，導致心肌細胞凋亡以及心室重塑等［9］。隨著基因工程技術的發(fā)展，已有相關報道稱MIF 基因多態(tài)性與心血管疾病相關［20-21］，近期針對中國人口的研究報道稱，攜帶有-173C MIF 等位基因的女性患冠心病的風險更高［22］。MIF 可通過CD74/CD44 受體介導，經(jīng)由Akt 通路激活NF-κB，而活化的NF-κB 可與MIF 形成正性環(huán)路。機體外周循環(huán)中MIF 水平與心肌梗死面積和梗死后心臟重塑程度有關［23］。另有動物實驗表明采用MIF 抑制劑拮抗MIF 作用，在許多炎癥疾病和心血管疾病中有可能阻斷疾病進展［24-25］。

圖5 病毒載體轉染后對各組大鼠心肌組織MMP-2 表達的影響（400×）Fig.5 Effect of viral vector transfection on the expression of MMP-2 in myocardium of rats in each groups（400×）

圖6 病毒載體轉染后對各組大鼠心肌組織MMP-9 表達的影響（400×）Fig.6 Effect of viral vector transfection on the expression of MMP-9 in myocardium of rats in each groups（400×）

此外，ECM 的改變對心室重塑啟著至關重要的作用，活化的MMP-2 與MMP-9 能夠降解心肌細胞外的基質，引起急性左室破裂和慢性心室擴大［26］，而它們的轉錄啟動受到MIF、NF-κB 以及TNF-α等的調節(jié)［27］，MIF 激活MMP-2 與MMP-9 可能是通過MEK1/2-JNK（AP-1）-MMP這條通路［17］。相反，MIF 的敲除可降低心肌梗死后MMP-9 和MMP-2 的表達和活性［28］。

圖9 病毒載體轉染后對各組大鼠心肌組織各目的蛋白表達的影響Fig.9 Effect of viral vector transfection on expression of various target proteins in myocardial tissue of rats

本實驗采用聯(lián)合基因對心梗大鼠進行干預基于以下兩點。一方面，TK-1 作用于B2 受體后，可激活PI3K-Akt-eNOS 途徑，進而促進一氧化氮的生成［29-30］，減輕心肌細胞的氧化損傷、抑制炎癥因子的活化，從而改善心功能等［31-33］；心梗后的炎癥反應與活化的NF-κB 以及血管細胞黏附分子1 等炎癥因子有密切聯(lián)系，TK-1 可通過上述機制抑制NF-κB等炎癥因子［18］，從而抑制MIF與NF-κB炎癥瀑布反應起始，進而減少下游MMP-2、MMP-9等因子的表達，達到延緩心室重塑改善心功能等效應；另一方面，TIMP-1 是內源性的MMP-2 與MMP-9的天然抑制劑，它不僅能阻止MMP-2與MMP-9酶原的活化，還能抑制已活化的MMP-2和MMP-9［2］，使它們失去降解ECM 的能力。同時TIMP-1 作用于CD63 后激活PI3K-Akt 路徑，抑制心梗后的心肌細胞凋亡［34］。以上研究支持我們的推測：雙基因共表達可能通過共同抑制MIF/NF-κB/MMP-2/9炎癥通路、改善ECM代謝等共同作用，使兩種目的蛋白抑制炎癥反應產(chǎn)生協(xié)同效應，從而發(fā)揮更強的抗炎效果、改善心室重塑。然而對于TK-1和TIMP-1發(fā)揮生物學效應的詳細機制，特別是細胞內信號傳導通路方面以及轉錄因子調控方面的具體機制仍不明了，有待進一步深入的研究。