劉 巍，李婧婧，丁 婭，李丹丹，文習(xí)之，祝保艷，張曉實

（中山大學(xué)腫瘤防治中心∥華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室∥腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，生物治療中心，廣東廣州 510060）

PD-1（programmed death factor 1 receptor）抗體在惡性黑色素瘤的療效數(shù)據(jù)主要來自白種人群皮膚黑色素瘤臨床試驗結(jié)果。與白種人群不同，中國患者黑色素瘤亞型以肢端和黏膜黑色素瘤為主，而肢端型和黏膜型患者的預(yù)后相對較差［1-2］。PD-1 抗體具有起效后長期有效的特點［3］，但其單藥有效率仍有限，特別對黑色素瘤的有效率在中國人群較白種人群更低（中國人群二線治療總體有效率16.7%［4］），起效較緩慢（中位起效時間約3 個月［5］），且部分患者有超進(jìn)展風(fēng)險（約9%黑色素瘤患者出現(xiàn)超進(jìn)展［6］）。目前，以PD-1 抗體等免疫檢查點藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療策略，成為腫瘤治療領(lǐng)域研究的一大熱點?；熕幬镫m已不作為晚期黑色素瘤治療的一線推薦，但對于短期內(nèi)迅速遏制腫瘤發(fā)展、減輕腫瘤負(fù)荷仍具有優(yōu)勢。替莫唑胺還是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的化療藥物，可發(fā)揮促進(jìn)腫瘤新抗原表達(dá)、促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞浸潤及增強其功能、耗竭和抑制Treg 等免疫效應(yīng)［7-11］。通過發(fā)揮替莫唑胺化療的抑瘤優(yōu)勢及免疫調(diào)節(jié)的特點與PD-1 抗體聯(lián)用，以期提高近期有效率，縮短起效時間，降低超進(jìn)展風(fēng)險并達(dá)到抑瘤效果長效性的治療目的。目前國內(nèi)外尚無PD-1抗體聯(lián)合替莫唑胺治療晚期黑色素瘤的臨床數(shù)據(jù)公布。本研究嘗試初步探討PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療晚期黑色素瘤的療效和安全性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

2017 年8 月至2019 年4 月在本中心接受“PD-1 抗體＋替莫唑胺”聯(lián)合方案治療的晚期黑色素瘤患者，且符合以下入選標(biāo)準(zhǔn)：已經(jīng)病理學(xué)證實為不可手術(shù)的局部晚期或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者；經(jīng)CT/MRI檢查證實有可評價病灶；ECOG評分≤2分；主要器官無功能障礙，實驗室檢查均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：白細(xì)胞≥4.0×109/L，中性粒細(xì)胞≥1.5×/109/L，血小板≥100 × 109/L，血紅蛋白≥95 g/L，血清膽紅素≤正常值上限1.5 倍，谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶≤正常值上限2 倍，血清肌酐≤正常值上限1.5 倍。

1.2 治療方案

患者接受PD-1 抗體＋替莫唑胺聯(lián)合治療，替莫唑胺給藥：200 mg/（m2·d），連續(xù)口服5 d，每28 d為一個周期；或75 mg/（m2·d），連續(xù)口服21 d，每28 d 為一個周期。聯(lián)合用藥（PD-1 抗體）包括：Pembrolizumab 2 mg/kg，每3 周為一個周期；或Nivolumab 3 mg/kg，每2 周為一個周期；或Toripalimab 3 mg/kg，每2 周為一個周期。給藥療程：考慮到化療的毒副反應(yīng)，聯(lián)合用藥中替莫唑胺化療達(dá)6～8 個療程后，若患者仍有臨床獲益，后續(xù)方案為PD-1 抗體單藥維持治療。每2 個周期（以替莫唑胺周期為標(biāo)準(zhǔn)，下同）后評價客觀療效。

1.3 療效及不良反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)

患者治療前后病灶直徑以螺旋CT 或MRI 檢查測量，按照美國癌癥研究所實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)RECIST v1.1 版進(jìn)行療效判定，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）和進(jìn)展（PD），計算客觀有效率（objective response rate，ORR）（CR%+PR%）、疾病控制率（disease control rate，DCR）（CR%+PR%+SD%），無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）、總生存期（overall survival，OS）、疾病控制時間（duration of disease control，DDC）、緩解持續(xù)時間（duration of response，DOR）。PFS 被定義為從聯(lián)合治療開始的第1 天到第1 次發(fā)生疾病進(jìn)展或者任何原因死亡的時間。OS 被定義為從聯(lián)合治療開始的第1 天到因任何原因死亡的時間。DDC 被定義為從第1 次評估為CR、PR 或SD 到第1 次發(fā)生疾病進(jìn)展或者任何原因死亡的時間。DOR 被定義為從第1 次評估為CR或PR 到第1 次發(fā)生疾病進(jìn)展或者任何原因死亡的時間。不良反應(yīng)按照NCI-CTCAE 4.0 版毒性評定標(biāo)準(zhǔn)，分為0～5 度。隨訪截止日期為2020 年2 月5 日。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 25.0 版軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間差異采用logrank 檢驗。采用COX 比例風(fēng)險模型進(jìn)行單因素及多因素生存分析，單因素分析中所有P＜0.1 的變量均納入多因素分析。P＜0.05（雙側(cè)），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例特征

2017 年8 月至2019 年4 月共有33 例晚期黑色素瘤患者在我科接受PD-1 抗體＋替莫唑胺聯(lián)合方案治療，包括15 例男性，18 例女性。病例特征詳見表1。PD-L1 陽性細(xì)胞比例大于或等于1%被定義為PD-L1 表達(dá)陽性，反之為PD-L1 表達(dá)陰性。皮膚型包括慢性陽光損傷型、非慢性陽光損傷型和原發(fā)灶不明黑色素瘤。33 例患者接受的中位療程數(shù)為替莫唑胺6.0（1～12）個周期和PD-1抗體7.0（1～27）個周期，有20 例接受了4 個及4 個以上周期（替莫唑胺和PD-1 抗體周期均≥4）的聯(lián)合治療。

表1 基線臨床病理特征Table 1 Baseline clinicopathological characteristics

2.2 療 效

入組的33 例患者中，最佳療效評價結(jié)果：無CR的病例，8例為PR（24.2%），12 例為SD（36.4%），13例為PD（39.4%），ORR為24.2%，DCR 為60.6%，見表2。初治患者ORR 為24.0%，復(fù)治患者為25.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。從客觀有效率來看，總體有效率為24.2%；肢端型黑色素瘤有效率最高，為38.5%；黏膜和皮膚型有效率相差不大，分別為16.7%和15.4%。從疾病控制率來看，總體DCR 為60.6%；肢端和黏膜型黑色素瘤DCR分別為61.5%和66.7%；皮膚型略低，為53.9%。此外，有眼黑色素瘤1 例，療效評估為SD。但不同組織類型的ORR 和DCR 之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。此外，不同年齡（＜60 歲/≥60 歲）、性別、ECGO 評分、LDH 水平（＞/≤正常值上限）、組織來源類型、分期、BARF V600E/K基因突變狀態(tài)、MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)、腫瘤突變負(fù)荷、PD-L1 表達(dá)狀態(tài)等的患者之間ORR 和DCR 亦差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療療效評價Table 2 Response to anti-PD-1 antibody and temozolomide ［n（%）］

2.3 生存期

本研究中患者的中位PFS 為4.3 月（95%CI，1.3～7.3），6 月 和12 月PFS 率 分 別 為37.7% 和17.3%。中位DDC 為7.5 月（95%CI，2.3～12.7），6月和12 月DDC 率分別為51.3%和16.5%。中位DOR 為11.1 月（95%CI，5.5～16.6），6 月 和12 月DOR 率分別為75.0% 和28.1%。中位OS 尚未達(dá)到，6 月和12 月OS 率分別為92.7%和86.1%。值得注意的是，肢端型患者mPFS 為4.3 月（95%CI，0.6～7.9），mDDC為6.0月（95%CI，0.9～12.0），mDOR為11.1月（95%CI，3.8～8.4）。肢端型比黏膜型有更久的緩解持續(xù)時間（mDOR：11.1vs.2.1，χ2=5.000，P=0.025）。

亞組Kaplan-Meier 生存分析顯示，PD-L1 表達(dá)陽性患者的PFS 較陰性患者的更長（mPFS：5.2vs.1.7，χ2=4.029，P=0.045；圖1A）。BARF V600E/K突變型患者比野生型患者的PFS 更短（mPFS：1.8vs.5.2，χ2=4.631，P=0.031；圖1B）。PFS 在初治與復(fù)治、不同組織來源類型、不同給藥方案以及不同性別、年齡、LDH 等的患者之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。COX 回歸模型單因素分析顯示，P＜0.1 的因素有PD-L1 是否表達(dá)和BARF V600E/K是否突變，將其納入多因素分析，結(jié)果顯示PD-L1 是否表達(dá)和BARF V600E/K是否突變均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；表3）。

每例患者的緩解深度見圖2（包括PR、SD 和PD 患者，有4 例患者數(shù)據(jù)無法獲得），有效患者的緩解持續(xù)時間見圖3（包括PR 和SD 患者）。圖4直觀顯示了8 例PR 患者中有5 例是肢端型，且緩解時間均超過24 周，其中3 位在在隨訪結(jié)束時仍未出現(xiàn)進(jìn)展。值得注意的是，其中1 例患者初次評估時為SD，第2 次評估時達(dá)PR，之后緩解時間約18 周。

2.4 不良反應(yīng)

主要不良反應(yīng)為皮膚瘙癢、皮疹、胃腸道反應(yīng)以及疲勞，其次為轉(zhuǎn)氨酶升高、白細(xì)胞減少以及白癜風(fēng)。不良反應(yīng)多為1/2 度，且經(jīng)對癥處理或預(yù)防性給藥后能好轉(zhuǎn)，其中1 例因2 度白細(xì)胞減少持續(xù)超過2 周，考慮主要為替莫唑胺副反應(yīng)，予暫停替莫唑胺化療并予升白細(xì)胞處理后恢復(fù)。3/4 度不良反應(yīng)較少，主要是胃腸道反應(yīng)（3 度惡心、嘔吐）及疲勞，其中1 例患者因出現(xiàn)3 度疲勞，主要在使用替莫唑胺過程中出現(xiàn)，予暫停替莫唑胺化療后可緩解（表4）。無一例因治療相關(guān)的毒副反應(yīng)而致死亡。不良反應(yīng)和近期療效之間無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性（P＞0.05）。

圖1 生存曲線Fig.1 Survival curve

表3 臨床病理特征與PFS 之間的多因素COX 回歸分析Table 3 Multivariate(cox-regression)analyses of various clinicopathologic features in melanoma patients

圖2 PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療的緩解深度（包括SD和PD）Fig.2 The depth of response of anti-PD-1 antibody and temozolomide treatment（SD and PD included）

3 討論

圖3 PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療的緩解時間（包括SD）Fig.3 Duration of anti-PD-1 antibody and temozolomide treatment（SD included）

表4 不良反應(yīng)Table 4 Treatment-related adverse events［n（%）］

國外一項免疫檢查點抑制劑ipilimumab 聯(lián)合替莫唑胺一線治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的II 期臨床試驗取得了不錯的療效（ORR 31.2%，mPFS 5.0個月，mOS 24.5 個月）［13］，這可能與ipilimumab 的高劑量（10 mg/kg）、iRECIST 的評價標(biāo)準(zhǔn)以及一線治療有關(guān)。但國內(nèi)外均無PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療晚期黑色素瘤的臨床數(shù)據(jù)發(fā)表。本研究顯示，33例晚期黑色素瘤患者接受PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療，一線、二線和三線的ORR 分別為24.0%、40.0%和0（初治與復(fù)治患者分別為24.0%和25.0%），DCR 分別為64.0%、60.0%和33.3%，總體mPFS 為4.3 個月，mDOR 為11.1 個月。其中二線治療患者的ORR 為40.0%，DCR 為60.0%，較pembrolizumab單藥二線治療中國晚期黑色素瘤患者的隨機(jī)Ib期臨床試驗（KEYNOTE-151，ORR 和DCR 分別為16.7%和38.2%）［4］中的療效更好。從有效率來看，肢端型ORR 為38.5%，黏膜型ORR 為16.7%，均較pembrolizumab 單藥二線治療中國晚期黑色素瘤患者（KEYNOTE-151，肢端型ORR 15.8%，黏膜型ORR 13.3%）［4］和pembrolizumab/nivolumab 單藥治療韓國轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者（回顧性研究，肢端/黏膜型ORR 為11.5%）［14］的客觀有效率更高，尤其是肢端型更為明顯。從疾病控制率來看，黏膜型和肢端型DCR 分別為66.7%和61.5%，均明顯高于pembrolizumab 在中國晚期黑色素瘤患者（黏膜型20.0%，肢端型42.1%）的疾病控制率［4］。以上不能排除本研究中一線治療患者居多的影響。我們進(jìn)一步分析二線治療患者中的肢端型和黏膜型，可得肢端型ORR 為50.0%（2/4），仍高于PD-1 抗體單藥在中國人群中的二線治療數(shù)據(jù)（肢端型ORR 15.8%［4］）。我們的研究中二線治療的黏膜型患者只有1 例，療效評估為SD，遂未進(jìn)一步比較。

本研究發(fā)現(xiàn)PD-1抗體聯(lián)合替莫唑胺治療對肢端型皮膚黑色素瘤有較高的有效率（5/13，38.5%），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，肢端型mDOR 為11.1 個月，5 例PR 患者中有3 例平均隨訪13.0 個月仍未出現(xiàn)進(jìn)展，緩解持續(xù)時間長。而肢端型中3 例SD 患者的中位疾病控制時間為2.8 個月，顯示PR 患者較SD患者疾病控制時間明顯增加。但有意思的是5 例PR 患者中有1 例患者第1 次評估時為SD，第2 次評估時達(dá)到PR，PFS 為8.87 月，說明SD 患者雖疾病控制時間不長，但有達(dá)到PR 的可能，有機(jī)會獲得更久的疾病控制時間。綜上所述，PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療晚期黑色素瘤的療效優(yōu)于PD-1抗體單藥療效，尤其是對于肢端型效果更佳，值得更進(jìn)一步的臨床研究。

一項替莫唑胺與達(dá)卡巴嗪治療晚期轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤的隨機(jī)Ⅲ期臨床研究顯示：替莫唑胺單藥一線治療晚期黑色素瘤患者ORR 為13.5%，mPFS 為1.9 個月，mOS 為7.7 個月［15］。我們的研究中PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療晚期黑色素瘤就總體而言，ORR 為24.2%，mPFS 為4.3 個月，mOS雖未達(dá)到，但超過20 個月。進(jìn)一步分析，PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療作為一線治療時，ORR 為24.0，mPFS 為5.3 個月，mOS＞20 個月，優(yōu)于替莫唑胺單藥一線治療晚期黑色素瘤患者的療效。

Kaplan-Meier 法生存分析和COX 多因素分析顯示，影響PFS 的因素有PD-L1 表達(dá)和BARF V600E/K基因突變狀態(tài)。PD-L1表達(dá)陽性患者比陰性患者有更長的PFS，這與PD-1 抗體單藥治療晚期黑色素瘤PFS 與PD-L1 表達(dá)的相關(guān)性相符［16］。BARF V600E/K基因突變患者比野生型患者的PFS更短（P＜0.05），可能與BRAF是黑色素瘤的驅(qū)動基因［17］有關(guān)。本研究中BARF V600E/K突變陽性的兩例患者，1 例PD，1 例SD（PFS 為2.7 個月），雖例數(shù)少，仍可提示我們PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺對BARF V600E/K突變陽性患者療效可能不佳。

本研究中包含3 例基線合并腦轉(zhuǎn)移的患者，雖例數(shù)不多，但均為治療有效病例，其中2 人PR（1 人已行聯(lián)合治療8 程，PD-1 抗體單藥維持6 程；另1 人已行聯(lián)合治療6 程，PD-1 抗體單藥維持21程，均持續(xù)中），1 人SD（聯(lián)合治療8 程，PD-1 抗體單藥維持1 程后腫瘤進(jìn)展，PFS 為6.1 個月）。我們進(jìn)一步分析臨床資料發(fā)現(xiàn)，PR 的兩例患者均在聯(lián)合治療前進(jìn)行過腦轉(zhuǎn)移瘤放療，SD 的1 例患者于聯(lián)合治療7 程后行腦轉(zhuǎn)移瘤放療。黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移目前是黑色素瘤免疫治療中的一大難點，且黑色素瘤極易出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移，替莫唑胺因其可通過血腦屏障的特點，在黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移的治療中具有一定優(yōu)勢。本研究提示PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療+腦轉(zhuǎn)移瘤放療對黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移患者的治療具有一定的臨床價值。而關(guān)于放療聯(lián)合的時機(jī)問題，我們的研究提示先行腦轉(zhuǎn)移瘤放療再行PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺治療對于黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移患者的臨床獲益可能更大。

替莫唑胺的主要不良反應(yīng)為骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)［15］。PD-1 抗體的毒性譜廣泛，涵蓋全身各個系統(tǒng)，較為常見的有皮膚毒性、內(nèi)分泌毒性、肝臟毒性、胃腸毒性、肺毒性等，發(fā)生率分別約為30%～50%［18］、10%［19］、2%～10%［20-21］、8%～27%［22］和3.6%［23］。本研究結(jié)果與之對比，皮膚毒性發(fā)生率相差不大，內(nèi)分泌毒性發(fā)生率更低，肝臟毒性發(fā)生率略高，肺毒性未出現(xiàn)，胃腸毒性發(fā)生率相差不大，但通常在口服替莫唑胺期間發(fā)生，考慮主要為替莫唑胺毒性。且絕大多數(shù)為1～2 級，個別3 級不良反應(yīng)考慮主要為替莫唑胺化療副反應(yīng)，停用替莫唑胺可緩解?？傮w而言，PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺方案與PD-1 抗體單藥毒性發(fā)生率基本相符，未發(fā)現(xiàn)增加毒性。

本研究提示PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺方案治療晚期黑色素瘤患者具有優(yōu)于PD-1 抗體單藥和替莫唑胺單藥的療效，可持續(xù)的疾病緩解時間和可耐受的毒性反應(yīng)，且初步觀察對肢端型有效率較高且緩解持續(xù)時間較長，有望成為晚期黑色素瘤一線或二線以上治療方案，尤其可推薦于肢端型患者的治療選擇。但由于本研究樣本量較小，故PD-1 抗體聯(lián)合替莫唑胺方案在晚期黑色素瘤治療中的有效性和安全性仍有待于前瞻性的隨機(jī)對照臨床研究進(jìn)一步驗證。