齊小敏，任曉敏，李梅，徐懷德

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100）

晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs）是還原糖（如葡萄糖）的活性羰基與蛋白質(zhì)、脂肪以及核酸的自由氨基經(jīng)非酶促反應(yīng)形成的一系列結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化合物總稱[1-2]。體內(nèi)過量AGEs的累積與一些慢性疾病的發(fā)病機理密切相關(guān)，如心血管疾管[3]、腎病[4]、動脈粥樣硬化[5]、阿爾茨海默病[6]、腫瘤[7]、糖尿病及其并發(fā)癥等[8]。AGEs不僅在生物體內(nèi)生成，在食品熱加工（蒸、煮、炸、烤等）過程中也大量生成[9]。研究表明食源性AGEs是人體內(nèi)AGEs累積的重要外部來源[10-11]。

AGEs種類繁多、結(jié)構(gòu)復雜。羧甲基賴氨酸 [Nε-（carboxymethyl）lysine，CML]是研究最早且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的一類AGE，其生成量與AGEs的生成量呈正相關(guān)，常作為評價AGEs含量的代表性標志物[12]。Jaime等建立了549種不同類型食品中CML含量的數(shù)據(jù)庫[13]。Hull等測定了西方飲食中食用頻率最高的257種食物中CML含量，發(fā)現(xiàn)肉制品中CML含量最高，其中每100 g烤羊肉中CML含量高達42.39 mg[12]。食品中的CML主要有兩種存在形式：游離態(tài)CML和結(jié)合態(tài)CML。游離態(tài)CML易于被機體吸收，但其在食品中含量甚微。食品中的結(jié)合態(tài)CML以蛋白結(jié)合態(tài)CML為主[14-15]。由于蛋白結(jié)合態(tài)CML分子量大，需經(jīng)胃腸消化水解為低分子量CML，進而有可能被機體吸收。

肉制品是食品中蛋白結(jié)合態(tài)CML含量較高的一類食品（紅色肉＞白色肉），肌肉蛋白是肌肉中的主要成分，其中肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）占總蛋白的55%～60%，本研究以豬里脊肉為原料提取MP，以化學合成法制備肌原纖維蛋白結(jié)合態(tài)CML（myofibrillar protein-bound CML，MP-bound CML），探究MP-bound CML在體外模擬胃腸系統(tǒng)消化過程中分子形態(tài)的變化及消化結(jié)束后不同分子量范圍水解液中CML的水平，為科學評價食品中蛋白結(jié)合態(tài)CML的腸道吸收性提供前期理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬里脊肉（宰后24 h）：楊凌好又多超市；CML標品（純度＞98%）、內(nèi)標CML-d4（純度＞98%）：美國Santa Cruz Biotechnology公司；一水合乙醛酸、氰基硼氫化鈉、胃蛋白酶（3 200 units/mg protein～4 500 units/mg protein）、膽鹽、胰液素、胰蛋白酶（13000BAEE units/mg protein～20000 BAEE units/mg protein）：美國 Sigma 公司；九氟戊酸（純度＞97%）、色譜級甲醇、乙腈：上海百靈威試劑公司；四甲基乙二胺、三羥甲基氨基甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷：北京索萊寶科技有限公司；預染低分子量蛋白標準品：美國Thermo scientific公司；試驗用水為超純水；其他試劑購于國藥集團化學試劑有限公司（上海），均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1組織搗碎機、T18高速組織分散器、RH digital white恒速攪拌器：德國IKA公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；CVCFD5冷凍干燥機：金西盟（北京）儀器有限公司；UFSC05001超濾裝置：Millipore公司；精密pH計：上海精密儀器儀表公司；Waters Micromass Quattro Micro API LC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀：美國Waters公司；12T氮吹儀：上海泉島公司；UV-6100型紫外可見分光光度計：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；SHZ-88恒溫水浴振蕩器：國旺儀器制造公司；凝膠成像系統(tǒng)BIORAD Molecular Imager ChemiDoc XRS：美國BIO-RAD公司；I×71熒光倒置顯微鏡：日本olympus公司；Zetasizer Nano S90馬爾文納米粒度：英國Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參考Cao等[16]的方法對豬里脊中的MP進行提取。將冷凍的豬里脊肉置于4℃條件下解凍，剔除可見脂肪及結(jié)締組織后，于4℃環(huán)境中將豬里脊肉切成小條并絞碎稱重后置于組織搗碎機中，加入4倍體積的僵直液（10 mmol/L 磷酸鈉，0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L乙二醇四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA，pH 7.0），充分斬拌形成均勻混合液。于4℃條件下2 000 g離心15 min，棄去上清液，重復2次；此后所得沉淀加入3倍體積0.1 mol/L NaCl溶液，按上述條件重復2次，再經(jīng)4層紗布（100目）過濾以去除殘留結(jié)締組織等，濾液在相同條件下離心，棄去上清液所得膏狀沉淀與3倍體積蒸餾水混合勻漿，用分子量截留范圍為8 kDa～14 kDa的透析袋純水透析3 d，冷凍干燥，制得MP。

1.3.2 賴氨酸含量的測定

參考李鳳麗[17]的方法對MP中賴氨酸的含量進行測定。采用異硫氰酸苯脂（phenyl-isothiocyanate，PITC）進行衍生，HPLC進行檢測。準確稱取100.0 mg MP樣品于水解管中，加入5 mL 6 mol/L鹽酸，在真空條件下封管，置于110℃烘箱中水解24 h。將水解液過濾并定容至25 mL，取200 μL水解液氮氣吹到樣品處于近干狀態(tài)，用200 μL 0.1 mol/L鹽酸復溶。分別加入20 μL正亮氨酸內(nèi)標，100 μL三乙胺乙睛溶液和100 μL異硫氰酸苯脂乙睛溶液，充分混合后室溫（25℃）放置1 h，加入400 μL正己烷充分振蕩混合，靜置10 min后，取下層溶液過0.45 μm濾膜，待測。

HPLC分析條件：Venusil AA氨基酸分析專用柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫 40℃，流動相組成：A相為0.1 mol/L醋酸鈉乙腈水溶液（醋酸鈉水溶液∶乙腈=93∶7，體積比）、B相為80%乙腈，線性梯度——0～17 min 100%～90%A；17 min～41 min 90%～55%A；42 min～47 min 0%A；47 min～57 min 100%A；流速1 mL/min，檢測波長 278 nm，進樣量 10 μL。

1.3.3 MP-bound CML的合成

合成條件參考Hellwig等[18]的方法。將一定濃度的乙醛酸加入MP磷酸緩沖液中（乙醛酸與MP中賴氨酸（按照1.3.2的方法測定得10.15 g賴氨酸/100 g MP蛋白）的摩爾比為4∶1，磷酸鹽緩沖液濃度為0.067 mol/L，pH 7.4），加入8.8 mmol NaBCNH3于40℃水浴恒溫攪拌反應(yīng)24 h，用分子量截留范圍為8 kDa～14 kDa的透析袋純水透析3 d后冷凍干燥，制得MP-bound CML。

1.3.4 CML含量測定

根據(jù)李梅[19]的方法對制備得到的MP-bound CML進行樣品前處理及含量測定。具體操作及其消化完全后各分子量組分樣品進行前處理及CML含量測定如下。

1.3.4.1 樣品前處理

準確秤取MP-bound CML樣品10.0 mg，滴加2～3滴1-辛醇消泡后加入1 mL 0.1 mol/L NaBH4溶液和1.5 mL 0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH值為9.2），室溫靜置4 h。將還原后的的樣品溶液轉(zhuǎn)移至酸水解管，加入2.5 mL 12 mol/L濃HCl至鹽酸終濃度為6 mol/L。通氮氣2 min～3 min后封口，置于110℃烘箱水解24 h。過濾酸水解結(jié)束后將樣品酸水解液進行過濾，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶定容。精確移取1 mL樣品酸水解液置于氮吹儀上于45℃下吹干。加入150 μL超純水，150 μL 475 ng/mL內(nèi)標CML-d4溶液于吹干樣品中進行復溶，旋渦混勻，用0.22 μm水系微濾膜過濾，準備上機檢測。

1.3.4.2 高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatographytriple quadrupoletendem mass spectrum，HP LC-QQQ-MS/MS）測定。

Alliance 2695高效液相色譜儀和Quattro Micro三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀用于測定樣品中的CML含量。LC分析條件：色譜柱為X-Bridge C18柱（100×2.1 mm i.d.，3.5 μm），柱溫為 35 ℃；流動相由純乙腈（A）和5 mM九氟戊酸水溶液（B）組成，線性梯度為——0～5 min 5%～60%A；5 min～7 min 60%～100%A；7 min～9 min 100%A；9 min～10 min 100%～5%A；流速為0.3 mL/min；柱平衡 10 min；進樣體積為 5 μL[19]。MS/MS分析條件：離子源為電噴霧正離子源（ESI+），檢測模式為MRM模式。毛細管電壓為3.55 kV，離子源溫度為110℃，脫溶劑溫度為400℃，脫溶劑氣流速為600 L/h，錐孔氣流速為50 L/h，碰撞氣（氬氣，純度99.99%）流速為0.13 mL/min。采用軟件MassLynx 4.1對試驗數(shù)據(jù)進行分析。按照1.3.3方法合成的MP-bound CML經(jīng)測定得到其中CML含量為127mg/g樣品。

1.3.5 MP-bound CML體外模擬胃腸消化試驗

參考Hellwig等[18]的方法，并稍加修改。

胃消化階段：將4.0 g MP-bound CML加入390 mL人工胃液（2.90 g/L NaCl，0.70 g/L KCl，0.27 g/L KH2PO4），用高速組織分散器勻漿，滴加3 mol/L HCl調(diào)pH值至2.0±0.1，加入10 mL樣品重量4%的胃蛋白酶，37℃水浴振蕩器中恒速攪拌消化120 min。期間用3 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0±0.1。于120 min取4 mL懸浮液，沸水煮5 min滅酶，終止MP-bound CML胃消化，取部分樣品于-80℃保存?zhèn)溆?，記為S。

CML腸消化，各樣品于-80℃保存?zhèn)溆?，分別記為S+I30、S+I60、S+I90、S+I120、S+I180 和 S+I360。

1.3.6 微觀形態(tài)

根據(jù)Zhang等[20]的方法，采用倒置熒光顯微鏡對MP-bound CML及其經(jīng)胃腸消化不同時間后水解液的微觀形態(tài)進行觀察。將20 μL熒光染料（0.01%Nile Blue，純水配制）加入到5 mL新鮮制備的樣品S、S+I30、S+I60、S+I90、S+I120、S+I180 和 S+I360 中，取 10 μL 樣品溶液滴到載玻片上，蓋上蓋玻片，確保蓋玻片和載玻片之間沒有氣泡，指甲油封片，吹干，避光保存。用倒置熒光顯微鏡（激發(fā)波長為488 nm）于10倍物鏡下觀察體外模擬胃腸消化不同時間樣品溶液的微觀形態(tài)。

1.3.7 粒徑分析

根據(jù)李偉偉[21]的方法，采用馬爾文粒徑儀測定新鮮制備的 1 mL 樣品 S、S+I30、S+I60、S+I90、S+I120、S+I180和S+I360粒徑的大小變化。

1.3.8 分子量分布

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和三甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine-Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）分析新鮮制備的樣品 S、S+I30、S+I60、S+I90、S+I120、S+I180和S+I360分子量的變化情況。

根據(jù)Cao等[16]的方法制備4%濃縮膠和12%分離膠，進行SDS-PAGE電泳。用磷酸鹽緩沖液將所有樣品稀釋至蛋白質(zhì)濃度為4 mg/mL。取80 μL樣品與20 μL上樣緩沖液混合，煮沸5min，MP-boundCML上樣20μL，樣品 S、S+I30、S+I60、S+I90、S+I120、S+I180 和 S+I360各上樣 40 μL，Marker上樣 5 μL。采用恒壓模式，初始電壓為90 V，樣品進入分離膠調(diào)電壓至110 V。電泳結(jié)束后，用含1 mg/mL考馬斯亮藍、50%甲醇和6.8%冰乙酸的溶液染色1 h，隨后用含5%甲醇和7.5%冰乙酸的溶液進行脫色，用凝膠成像系統(tǒng)BIO-RAD Molecular Imager ChemiDoc XRS拍照。

根據(jù)張微[22]的方法制備4%濃縮膠、10%夾層膠和16%分離膠，進行Tricine-SDS-PAGE電泳。所有樣品均按上述方法處理后，在濃縮膠和夾層膠中采用恒壓模式50 V壓線，進入分離膠后電壓轉(zhuǎn)換至80 V，在距離膠底部1 cm處停止，在低溫環(huán)境下進行，注意溫度不能超過35℃。電泳結(jié)束后，浸泡于含50%甲醇、10%冰醋酸、0.05 mol/L醋酸銨的固定液中固定1 h，用含0.025%考馬斯亮藍R-250、45%甲醇、10%冰醋酸的溶液染色1.5 h，隨后用含5%甲醇和7.5%冰醋酸的溶液進行脫色，用凝膠成像系統(tǒng)BIO-RAD Molecular Imager ChemiDoc XRS拍照。

1.3.9 不同分子量范圍水解液中CML的含量測定

根據(jù)宗玉霞[23]的方法，分別采用截留分子量5、3、1 kDa的超濾膜對經(jīng)胃腸系統(tǒng)消化完全的MP-bound CM水解液樣品S+I360進行超濾處理，得到＞5 kDa、3 kDa～5 kDa、1 kDa～3 kDa、＜1 kDa 4 個分子量范圍的水解液組分，凍干各組分樣品并測定其所含的CML含量，測定方法同1.3.4。如圖1所示。

圖1 超濾裝置[23]Fig.1 Ultrafiltration device

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均進行3次重復，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差的形式表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，以單因素變量分析法（analysis of variance，ANOVA）及LSD檢驗進行組間差異比較和差異顯著性分析。P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MP-bound CML在模擬胃腸消化過程中微觀形態(tài)的變化

MP-bound CML經(jīng)體外模擬胃腸消化不同時間的微觀形態(tài)見圖2。

圖2 MP-bound CML經(jīng)體外模擬胃腸消化不同時間的微觀形態(tài)（10×）Fig.2 Micromorphology of MP-bound CML after different time of simulated gastrointestinal digestion in vitro

由圖2可知，MP-bound CML經(jīng)胃蛋白酶消化120 min后，顆粒變大，之后在腸消化階段，隨著胰蛋白酶消化時間的增長，MP-bound CML顆粒逐漸減小，表明MP-bound CML消化程度逐漸增加。當腸消化120 min后顆粒形態(tài)變化不明顯，這可能是由于隨著腸消化時間的延長，MP-bound CML消化速率減慢，標志著MP-bound CML經(jīng)體外模擬胃腸消化基本結(jié)束，MP-bound CML消化完全。這一結(jié)果與Hellwig等的研究結(jié)果相一致。Hellwig等研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白結(jié)合態(tài)CML在體外模擬胃腸消化過程中，結(jié)合態(tài)CML的長度隨消化時間的增加而逐漸縮短[18]。

2.2 MP-bound CML在模擬胃腸消化過程中粒徑的變化

為了明確MP-bound CML在胃腸消化過程中顆粒大小的變化，本研究收集了MP-bound CML經(jīng)體外模擬胃腸消化不同時間的水解液并檢測其粒徑分布情況，見圖3。

圖3 MP-bound CML經(jīng)體外模擬胃腸消化不同時間的粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of MP-bound CML after different time of simulated gastrointestinal digestion in vitro

由圖3可知，MP-bound CML在胃腸消化過程中水解物的粒徑均為雙峰分布，且都在100 nm以上。這可能是由于在整個消化過程中MP-bound CML在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下水解為不同分子量大小的肽結(jié)合態(tài)CML和小分子結(jié)合態(tài)CML。當MP-bound CML經(jīng)胃蛋白酶消化120 min后，水解物的粒徑小于腸道消化30 min后，這可能是由于蛋白溶解度隨著pH值的增大而增大，酸性條件下聚集的蛋白在堿性條件下溶解。胃腸消化30 min的平均粒徑為503.37±2.194 nm。隨著腸道消化時間的增加，MP-bound CML水解物的粒徑逐漸減小，其胃腸消化360 min的平均粒徑為（476.28±5.79）nm。同時由雙峰趨向為單峰，后峰強度較小，說明MP-bound CML隨著消化時間的延長，MP-bound CML可能水解為分子量較小的肽結(jié)合態(tài)CML，這與熒光顯微鏡結(jié)果相一致。

2.3 MP-bound CML在模擬胃腸消化過程中分子量的變化

為進一步闡明MP-bound CML在胃腸消化過程中的水解情況，本文采用SDS-PAGE和Tricine-SDSPAGE電泳技術(shù)得到MP-bound CML經(jīng)體外模擬胃腸消化不同時間的分子量分布，見圖4。

圖4 MP-bound CML經(jīng)體外模擬胃腸消化不同時間的分子量分布Fig.4 Molecular weight distribution of MP-bound CML after different time of simulated gastrointestinal digestion in vitro

由圖4A可以得出，MP-bound CML經(jīng)胃消化120 min后，與MP-bound CML相比水解物的多條分子量條帶均在60 kDa以下；進入腸消化階段后隨著消化時間的增加，MP-bound CML水解物的分子量進一步減小，25 kDa左右、15 kDa～25 kDa和 10 kDa左右的條帶較為清晰，表明MP-bound CML經(jīng)胃腸消化后分子量逐漸減小。

由于SDS-PAGE無法分離分子量較低的水解物，本文進一步采用Tricine-SDS-PAGE電泳對分子量較低的水解物進行分子量分布分析。由圖4B可知，MP-bound CML隨著胃腸消化時間的增加，小于17 kDa的條帶先清晰后變淺，10 kDa以下條帶逐漸清晰，當腸消化達到360 min時，與腸消化180min相比，僅能在4.6 kDa～17 kDa中觀察到條帶，17 kDa～26 kDa的條帶消失，表明MP-bound CML經(jīng)胃腸消化后水解為分子量較低的結(jié)合態(tài)CML。Hellwig等報道酪蛋白結(jié)合態(tài)CML經(jīng)胃腸消化后，小于1 kDa的水解物組分有可能被腸道吸收[18]。因此，本研究中MP-bound CML經(jīng)體外模擬胃腸消化后存在被機體吸收的可能性。

2.4 MP-bound CML經(jīng)胃腸消化后不同分子量組分中CML的含量

為了揭示MP-bound CML經(jīng)胃腸消化完全后不同分子量范圍水解液中結(jié)合態(tài)CML的含量，本研究對MP-bound CML樣品經(jīng)胃消化120 min+腸消化360 min后的水解液進行了超濾處理，并收集了＞5 kDa、3 kDa～5 kDa、1 kDa～3 kDa以及＜1 kDa的水解液，MP-bound CML經(jīng)體外模擬胃腸消化360 min后水解液不同組分中CML含量及占總CML的百分比見圖5。

圖5 MP-bound CML經(jīng)體外模擬胃腸消化360 min后水解液不同組分中CML含量及占總CML的百分比Fig.5 Concentration and percent of CML in different components of MP-bound CML hydrolysates after simulated gastrointestinal digestion in vitro for 360 min

由圖5可以看出，＞5 kDa的水解液中結(jié)合態(tài)CML含量為（49.6±0.83）mg/g樣品干重，占 MP-bound CML總含量的比例為31.5%，3 kDa～5 kDa的水解液中結(jié)合態(tài)CML含量為（46.0±6.77）mg/g樣品干重，占MP-bound CML總含量的比例為29.2%，1 kDa～3 kDa的水解液中結(jié)合態(tài)CML含量為（48.0±9.19）mg/g樣品干重，占MP-bound CML總含量的比例為30.4%，＜1 kDa的水解液中結(jié)合態(tài)CML含量為（14.0±0.14）mg/g樣品干重，占MP-bound CML總含量的比例為8.9%。結(jié)果表明MP-bound CML經(jīng)胃腸系統(tǒng)消化后能夠水解為分子量較小的肽結(jié)合態(tài)CML。通常胃和腸道消化后分子量小于1 kDa的物質(zhì)所占整體的百分比稱為可消化率[18]。Hellwig等報道小于1 kDa的結(jié)合態(tài)CML能夠被機體吸收[18]，同時也有研究發(fā)現(xiàn)CML結(jié)合在二肽上的吸收率高于游離態(tài)CML[24]。因此MP-bound CML存在被機體消化吸收的風險。

3 結(jié)論

本研究以豬里脊中的MP為原料，以合成法制備得到的MP-bound CML為研究對象探究MP-bound CML的胃腸消化特性。結(jié)果表明隨著胃腸系統(tǒng)消化時間的增長，MP-bound CML逐漸水解為分子量較小的結(jié)合態(tài)CML，其中小于1 kDa的水解物中結(jié)合態(tài)CML含量達到（14.0±0.14）mg/g樣品干重，占MP-bound CML總含量的8.9%，表明MP-bound CML有可能經(jīng)胃腸消化被機體吸收，這一研究為科學評價食品中蛋白結(jié)合態(tài)AGEs的潛在生物安全性提供了一定的理論參考。