周曉君 張 凱 彭正鋒 孫姍姍 押輝遠(yuǎn) 張延召 程彥偉

(1.洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 洛陽 471934； 2.河南小秦嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局 三門峽 472500；3.洛陽牡丹研究院 洛陽 471000)

牡丹是芍藥屬牡丹組(Paeoniasect.Moutan)植物的統(tǒng)稱(APG Ⅳ, 2016)。除了以“花中之王”的美譽(yù)供觀賞之外，牡丹還有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值：其根皮“丹皮”為復(fù)方中的常用藥材之一，列入中國藥典；牡丹籽油富含α-亞麻酸等不飽和脂肪酸，是很有發(fā)展前途的健康食用油之一(洪德元等, 2017)。由于牡丹具有較高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在世界各地廣泛栽培。中國特有的野生牡丹一直被國內(nèi)外視為珍貴的種質(zhì)資源，開展野生牡丹系統(tǒng)進(jìn)化的研究以及栽培牡丹起源的研究對(duì)闡明牡丹的起源、培育和改良栽培品種具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值(Zhaoetal., 2008)。葉綠體普遍存在于陸地植物、藻類和部分原生生物中，是進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵場所，是具有自主遺傳信息的重要細(xì)胞器(邢少辰等, 2008)。典型的被子植物葉綠體基因組為環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，即2個(gè)反向互補(bǔ)重復(fù)序列(inverted repeat，IRa和IRb)、大單拷貝區(qū)(large single-copy，LSC)和小單拷貝區(qū)(small single-copy，SSC)。與核基因組相比，葉綠體基因組較小，序列保守，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，遺傳重組率低，屬于母系遺傳，其結(jié)構(gòu)和序列信息在揭示物種起源、進(jìn)化演變及物種間親緣關(guān)系等方面具有重要價(jià)值(Mccauleyetal., 1996; 王玲等, 2012)。

近年來，先后有不同學(xué)者對(duì)芍藥屬植物葉綠體基因組進(jìn)行了研究。Zhang等(2016)對(duì)芍藥屬芍藥組(PaeoniaSect.Paeonia)藥用植物川赤芍(P.veitchii)進(jìn)行葉綠體基因組測序；Li 等(2018)對(duì)芍藥屬牡丹組中僅有的2種開黃花的野生牡丹大花黃牡丹(P.ludlowii)、滇牡丹(P.delavayi)的葉綠體進(jìn)行了測序并分析其特征；Guo等(2018)對(duì)油用鳳丹牡丹(P.ostii)進(jìn)行了綠葉體測序并將其與其他幾種芍藥屬植物的葉綠體特征進(jìn)行了對(duì)比。作為7種野生牡丹之一，矮牡丹(P.jishanensis)被認(rèn)為是現(xiàn)代栽培牡丹品種重要的祖先種(Yuanetal., 2014; Xuetal., 2016)。對(duì)矮牡丹葉綠體基因組特征進(jìn)行分析，并將其與已發(fā)表的其他5種芍藥屬植物葉綠體基因組進(jìn)行對(duì)比，旨在為牡丹種質(zhì)資源的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)，也可為今后芍藥屬植物系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究及種質(zhì)資源的鑒定提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于葉綠體基因組測序的矮牡丹組織樣本采集于山西省稷山縣馬家溝(35°43′N, 110°58′E)。利用天根試劑盒(天根，北京)提取基因組DNA備用。

1.2 總DNA測序

將檢測合格的DNA樣本用超聲波進(jìn)行片段化，經(jīng)純化后進(jìn)行末端修復(fù)、3′端加A及連接測序接頭，用瓊脂糖電泳選擇合適片段大小。通過PCR擴(kuò)增后構(gòu)建測序文庫，質(zhì)檢合格的文庫利用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.3 組裝與注釋

測序獲得的原始數(shù)據(jù)利用CLC Genomics Workbench 9.0軟件(CLC Bio，Aarhus，Denmark)過濾去除低質(zhì)量序列(參數(shù)設(shè)置為：Ambiguous limit=2，Quality limit=0.05)(Wambuguetal., 2015)。以大花黃牡丹葉綠體基因組(KY817592)作為參照(Lietal., 2018)，將過濾后的11 322 016條reads采用Hahn等(2013)的組裝方法構(gòu)建葉綠體基因組。最終得到長度為152 628 bp的矮牡丹葉綠體全基因組序列。共有145 741條葉綠體reads參與組裝，平均覆蓋率為141.9×。利用Geneious 8.0軟件進(jìn)行矮牡丹與大花黃牡丹序列的CLUSTAL比對(duì)，進(jìn)行堿基修正、修改蛋白質(zhì)和tRNA等注釋，完成葉綠體基因組的分區(qū)。采用OGDraw在線工具(http:∥ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/)進(jìn)行基因組圖譜繪制。

1.4 葉綠體基因組特征分析

圖1 矮牡丹葉綠體基因組物理圖譜

利用MISA(MicroSatellite identification tool)軟件(http:∥pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索矮牡丹葉綠體基因組中SSR位點(diǎn)并分析其特征。具體參數(shù)為：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸為基序(Motif)的重復(fù)數(shù)分別設(shè)置為8、5、4、3、3、3，2個(gè)復(fù)合SSR位點(diǎn)間隔堿基數(shù)最大為100。用EMBOSS 6.4.0軟件(http:∥emboss.open-bio.org/)分析蛋白編碼基因密碼子偏好性(Riceetal., 2000)。從GenBank下載鳳丹牡丹、大花黃牡丹、滇牡丹、川赤芍和草芍藥5個(gè)種的葉綠體基因組全序列，與本項(xiàng)目矮牡丹葉綠體基因組序列進(jìn)行多重比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組基本特征

與已發(fā)表的其他芍藥屬葉綠體基因組類似，矮牡丹葉綠體基因組為包含LSC、SSC、IRa和IRb 4個(gè)區(qū)段的共價(jià)閉合雙鏈環(huán)狀分子(圖1)，序列全長152 628 bp，GC含量為38.4%。其中LSC區(qū)段長84 292 bp，SSC區(qū)段長17 044 bp，IR區(qū)段為25 646 bp(Zhouetal., 2019)?；蚪M的GC含量是判斷物種間親緣關(guān)系的重要指標(biāo)，矮牡丹LSC、SSC、IR區(qū)段GC含量與其他芍藥屬一致，分別為36.7%、32.7%、43.1%(Guoetal., 2018; Lietal., 2018)。在基因組大小方面，矮牡丹葉綠體基因組比鳳丹牡丹大475 bp，比川赤芍、大花黃牡丹、滇牡丹和草芍藥分別小54、59、70、70 bp(表1)。

葉綠體注釋結(jié)果表明，矮牡丹葉綠體基因組共有112個(gè)基因，包括蛋白編碼基因78個(gè)、tRNA基因30個(gè)和rRNA基因4個(gè)(表2)。其中，有19個(gè)基因(包括4個(gè)rRNA、7個(gè)tRNA、8個(gè)蛋白編碼基因)在IR區(qū)重復(fù)。LSC區(qū)段含有22個(gè)tRNA基因和60個(gè)蛋白編碼基因，SSC區(qū)段含有1個(gè)tRNA基因和10個(gè)蛋白編碼基因。研究表明，內(nèi)含子在基因的表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，許多內(nèi)含子能夠增強(qiáng)外源基因在植物特定時(shí)間及特定部位的高水平表達(dá)，從而產(chǎn)生相關(guān)的農(nóng)藝性狀(Jiaoetal., 2012)。矮牡丹蛋白編碼基因中，9個(gè)基因(atpF,ndhA,ndhB,petB,petD,rpl16,rpl2,rpoC1,rps16)含有1個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)基因(clpP,rps12,ycf3)含有2個(gè)內(nèi)含子。

表1 芍藥屬6個(gè)種葉綠體基因組基本特征比較①

①LSC: Large single-copy region; SSC: Small single-copy region; IR: Inverse repeats.

表2 矮牡丹葉綠體基因組基因信息①

①*: 具有內(nèi)含子的基因；a: 重復(fù)基因(存在于IR區(qū)域的基因)。*: Genes containing introns; a: Duplicated gene(genes present in the IR regions).

2.2 矮牡丹葉綠體基因組密碼子使用情況

在矮牡丹葉綠體基因組中，共有25 988個(gè)密碼子，編碼蛋白78個(gè)，其中編碼亮氨酸的密碼子數(shù)量最多，為2 716個(gè)，異亮氨酸、色氨酸的密碼子數(shù)量分列第2(2 223個(gè))和第3(1 984個(gè))。TAA為常用的終止密碼子(43個(gè))，略高于TAG(21個(gè))和TGA(21個(gè))。矮牡丹葉綠體基因組中蛋白編碼基因密碼子偏好使用A/T堿基。在所有密碼子中，第1個(gè)、第2個(gè)和第3個(gè)堿基為A/T的分別占總密碼子數(shù)的54.04%、61.59%和68.89%。

2.3 葉綠體基因組SSR分析

在矮牡丹葉綠體基因組中搜索到143個(gè)SSR位點(diǎn)。其中，141個(gè)為普通型SSRs，2個(gè)為復(fù)合型SSRs；單核苷酸重復(fù)Motif位點(diǎn)最多為116個(gè)，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重復(fù)基序分別有13、6、5、1個(gè)，沒有發(fā)現(xiàn)六核苷酸重復(fù)基序(表3)。143個(gè)SSRs位點(diǎn)中，A/T組成的位點(diǎn)有134個(gè)，僅有9個(gè)位點(diǎn)含有G/C，這表明SSRs的堿基組成偏好；從分布區(qū)段上看，14個(gè)位點(diǎn)位于IR區(qū)段，103個(gè)位于LSC區(qū)段，26個(gè)位于SSC區(qū)段，說明矮牡丹葉綠體基因組SSRs分布的不均勻性。

2.4 芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組IR邊界分析

植物葉綠體基因組IR的擴(kuò)張與收縮是較為普遍的現(xiàn)象，它決定了不同植物葉綠體基因組大小(Huangetal., 2014)。為了探索IR潛在的擴(kuò)張與收縮，比較了芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組IR與SC邊界區(qū)域基因的分布狀況(圖2)。如圖所示，LSC/IR和SSC/IR邊界分布的基因包括rps19，rpl2，ycf1，ndhF和trnH。芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組SSC/IRa邊界均為ycf1基因，且在不同的區(qū)域內(nèi)ycf1基因分布長度不同，在草芍藥、鳳丹牡丹、大花黃牡丹、滇牡丹、川赤芍、矮牡丹的SSC區(qū)域內(nèi)長度分別為4 325、4 352、4 340、4 355、4 327和4 346 bp，在IRa區(qū)域內(nèi)的長度分別為1 087、1 078、1 078、1 078、1 076和1 078 bp。同樣地，trnH基因在6個(gè)種中均位于LSC區(qū)域內(nèi)，分別距IRa/LSC邊界1、79、0、1 534、3、3 bp。rpl2基因僅在鳳丹牡丹中位于LSC/IRb邊界，與其他5個(gè)種不同。ndhF基因位于5個(gè)種的IRb/SSC邊界，而在川赤芍中位于SSC區(qū)域距邊界20 bp。

表3 矮牡丹葉綠體基因組SSRs類型信息

圖2 芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組反向重復(fù)區(qū)(IR)、大單拷貝區(qū)(LSC)和小單拷貝區(qū)(SSC)邊界比對(duì)

3 討論

葉綠體基因組序列包含著解決復(fù)雜系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的諸多信息，被廣泛用于植物系統(tǒng)發(fā)育及農(nóng)作物栽培種進(jìn)化關(guān)系重建等領(lǐng)域(Cuénoudetal., 2002; 謝海坤等, 2017)。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組測序成本大大降低，葉綠體基因組獲得更加便捷。大多數(shù)被子植物葉綠體基因組都屬于典型的質(zhì)體基因組4部分結(jié)構(gòu)，即1對(duì)IR區(qū)將整個(gè)基因組劃分成2個(gè)單拷貝區(qū)域；都具有74個(gè)蛋白編碼基因，少數(shù)植物會(huì)在此基礎(chǔ)上增加5個(gè)蛋白編碼基因(Millenetal., 2001)。矮牡丹cp DNA基因組具有蛋白編碼基因78個(gè)、tRNA基因30個(gè)和rRNA基因4個(gè)。通過比較分析矮牡丹與芍藥屬其他5個(gè)種的葉綠體基因組序列可發(fā)現(xiàn)，從基因組大小和基因內(nèi)容來看，芍藥屬葉綠體基因組高度保守。

密碼子是遺傳信息正確表達(dá)的關(guān)鍵。一般情況下，葉綠體基因組DNA上的起始密碼子序列分別為ATG、ATT、ATA。本研究中矮牡丹葉綠體基因組起始密碼子中除了ATG是最常見起始密碼子外，還有ATA、GTG、ATT 3種類型，這在其他被子植物中也有報(bào)道(Bortirietal., 2008)。不同葉綠體基因組的堿基組成有一定的差異，矮牡丹葉綠體基因組偏向于使用含有A/T的密碼子。密碼子偏好性與生物長期的進(jìn)化歷史密切相關(guān)，因此研究矮牡丹密碼子的使用情況對(duì)芍藥屬物種進(jìn)化模式的探究具有重要作用。SSR是一種重要的分子標(biāo)記，常用于物種的居群遺傳學(xué)分析(Doorduinetal., 2011)。對(duì)矮牡丹葉綠體基因組中SSR的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，其SSR中含有豐富的A/T，而且多聚的A/T類型遠(yuǎn)大于多聚的G/C類型，與地黃屬(Rehmannia)植物類似(Zengetal., 2017)。矮牡丹葉綠體基因組SSR位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對(duì)芍藥屬植物鑒定、群體水平的多態(tài)性檢測及系統(tǒng)發(fā)育分析具有一定的意義。

不同物種間葉綠體基因組IR/SC邊界位置的變化是較為普遍的現(xiàn)象，這些變化通常在同一科的物種中也會(huì)有所不同。研究表明，芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組盡管在結(jié)構(gòu)和大小方面比較保守，但不同物種間IR和SC的邊界位置仍有一定變化。與其他5個(gè)種相比，鳳丹牡丹的IR(24 863 bp)是6個(gè)種中最小的，存在收縮現(xiàn)象，這主要表現(xiàn)在LSC/IR的rpl2基因上。該基因在鳳丹牡丹中有718 bp延伸至LSC區(qū)域，而其他種的rpl2基因均完整地位于IR區(qū)。所以芍藥屬LSC/IRb的邊界變化是IR區(qū)擴(kuò)張與收縮的主要原因，這與地黃屬葉綠體基因組的研究結(jié)果一致(Zengetal., 2017)。

芍藥科(Paeoniaceae)在被子植物中十分孤立，其系統(tǒng)位置一直存在激烈爭論?；诜肿酉到y(tǒng)學(xué)的被子植物系統(tǒng)發(fā)生顯示：芍藥科與虎耳草科(Saxifragaceae)、景天科(Crassulaceae)和金縷梅科(Hamamelidaceae)等構(gòu)成一大支，即虎耳草目(Saxifragales)(APG Ⅳ, 2016)。但芍藥科在虎耳草目中究竟與哪類植物最近，仍然是一個(gè)懸而未決的問題(洪德元等, 2017; Jianetal., 2008)。本研究可為今后芍藥科植物系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組為典型的包含4個(gè)區(qū)段的共價(jià)閉合雙鏈環(huán)狀分子，GC含量均為38.4%，且在LSC、SSC、IR區(qū)段GC含量一致，所有芍藥屬植物葉綠體基因組從長度到GC含量均高度保守。矮牡丹葉綠體基因組中，共有25 988個(gè)密碼子，編碼亮氨酸的密碼子數(shù)量最多，為2 716個(gè)，矮牡丹葉綠體基因組偏向于使用含有A/T的密碼子。矮牡丹葉綠體基因組中共有143個(gè)SSR位點(diǎn)，單核苷酸重復(fù)Motif位點(diǎn)最多為116個(gè)，SSR中多聚的A/T類型遠(yuǎn)大于多聚的G/C類型。明確了6種芍藥屬植物在每個(gè)區(qū)段的不同，指出LSC/IRb的邊界變化是IR區(qū)擴(kuò)張與收縮的主要原因。