丁旭 王方方 王皓煜 梁雅坤 常海雙 黃治物 華云峰2, 吳皓，

耳蝸是重要的聽覺器官，負責將外界的聲音刺激編碼成神經(jīng)電沖動并傳導給聽神經(jīng)。對耳蝸開展系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)學研究有助于認識各類聽力損失的發(fā)病機制。作為研究生物樣品超微結(jié)構(gòu)的主要手段，電鏡技術已被廣泛應用于聽覺神經(jīng)科學的諸多領域，其中包括毛細胞靜纖毛、帶狀突觸、聽神經(jīng)髓鞘及血管紋。但目前研究集中在使用常規(guī)電鏡對耳蝸組織的超薄切片進行結(jié)構(gòu)表征[1～4]，電鏡三維成像也局限于對耳蝸細胞間隙、內(nèi)毛細胞中的線粒體及帶狀突觸的研究[5～8]，尚無大尺寸耳蝸神經(jīng)組織三維結(jié)構(gòu)的報道。關鍵技術瓶頸在于耳蝸組織由堅硬的骨質(zhì)包裹，不采取解剖分離的方法，無法獲得染色均一的電鏡樣品；而前者機械性破壞了耳蝸的三維結(jié)構(gòu)，導致耳蝸超微結(jié)構(gòu)的研究只在極有限的體積內(nèi)開展，一般為1～2個細胞的跨度[4,6,8]。

使用還原性鋨進行塊染是目前三維電鏡樣品制備的首選方法。相對于其它重金屬染色，鋨元素會高度富集在細胞膜內(nèi)，可提高圖像對比度并縮短成像時間；同時鋨的導電性強，可避免掃描電鏡成像過程中電荷在樣品表面富集造成圖像偽跡；此外，由于避免了切片染色，大大降低了由于暴露在空氣中以及轉(zhuǎn)移樣品所導致的樣品污染和機械損傷的風險。然而還原性鋨在細胞膜致密的生物樣品中擴散緩慢，在有限的時間內(nèi)傳統(tǒng)塊染方法在大尺寸生物樣品上無法實現(xiàn)均一的染色，而簡單延長染色時間會造成樣品污染[9～12]。近期有研究突破了這一瓶頸，將還原鋨酸染色中的鋨酸滲透和還原的步驟進行分析，使可均一制備的腦組織樣品的最大厚度從約200微米提高到了1毫米[11]。通過該方法制備的腦組織樣品具有優(yōu)異的導電性和細胞膜對比度，被廣泛應用于高通量三維電鏡成像[13～17]，本研究在此基礎上，針對耳蝸樣品的結(jié)構(gòu)特殊性，優(yōu)化了實驗條件，包括：①進行低溫耳蝸灌注脫鈣；②采用短暫脫鈣；③調(diào)整染色和樹脂包埋所需的時間；最終實現(xiàn)了完整小鼠耳蝸樣品的電鏡制備，所得樣品適用于X射線顯微鏡、掃描及透射電鏡多種成像手段，且具有染色均一、細胞膜結(jié)構(gòu)對比度高和結(jié)構(gòu)保存完好的特點，為耳科疾病的研究提供了基礎，報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 采用3只野生型CBA/ca小鼠(4～8周齡)，雌雄不限，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。動物飼養(yǎng)以及實驗方案由所在單位的動物倫理委員會審查和批準通過，并嚴格按照規(guī)范進行 (SH9H-2019-A387-1)。

1.2小鼠耳蝸的取材和固定 動物經(jīng)腹腔注射麻醉(5%水合氯醛，1毫升/100克體重)，頸椎離斷處死后，快速解剖分離出兩側(cè)耳蝸，在含有0.08 M二甲胂酸鈉緩沖液(pH 7.4, Sigma, C0250-100G)、2%多聚甲醛(Sigma, P6148-500G)、2.5%戊二醛(Sigma，G7776-10X10ML)的4 ℃混合固定液中使用顯微精細鑷暴露出圓窗和卵圓窗，利用微量注射泵(Harvard, 70-3007)以約50微升/分鐘的速度灌注，分別從圓窗和卵圓窗灌注0.5毫升預冷的4 ℃混合固定液，完成后將樣品轉(zhuǎn)移至裝有混合固定液的離心管中，在4 ℃冰箱中靜置5小時，接著轉(zhuǎn)移到添加了5%乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich, EDS-500G) 的上述混合固定液中置于4 ℃度冰箱中4小時。此操作先充分固定再脫鈣，將最大程度的保留耳蝸的超微結(jié)構(gòu)，同時增加樣品的通透性，對樣品的后續(xù)塊染和樹脂包埋至關重要。

1.3耳蝸電鏡塊染 完成固定及脫鈣后的樣品使用二甲胂酸鈉緩沖液(0.15 M，pH 7.2～7.4)清洗兩次，各30分鐘后，依次浸沒于2% 四氧化鋨(二甲胂酸鈉緩沖液配制，Ted Pella)2小時，2.5%亞鐵氰化鉀(二甲胂酸鈉緩沖液配制，Sigma，P3289-100G)2小時，2%四氧化鋨(二甲胂酸鈉緩沖液配制)1.5小時。接著使用緩沖液清洗兩次，各30分鐘，浸沒于1%硫代甲肼1小時，之后使用去離子水清洗兩次，各30分鐘，再次浸沒于2%四氧化鋨(去離子水配制，Sigma, 223220-5G)2小時，并用去離子水清洗兩次各30分鐘，置于4 ℃冰箱中過夜。次日，樣品轉(zhuǎn)移到新鮮配置的天冬氨酸鉛溶液(0.03 M，使用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至5.00)，在50 ℃溫度下浸沒2小時，之后使用去離子水清洗兩次，各30分鐘。

1.4脫水及樹脂包埋 使用丙酮(上海凌峰化學試劑有限公司)對樣品進行脫水，濃度梯度依次為：50% (4 ℃)、75% (4 ℃)、90% (4 ℃) 丙酮溶液, 以及3次100% (室溫)無水丙酮，每個梯度脫水時間30～45分鐘。脫水后的樣品使用Spurr樹脂(Sigma-Aldrich, EM0300-1KT)與無水丙酮混合液進行梯度包埋，比例為1∶1和2∶1各6小時，再將樣品轉(zhuǎn)移到純樹脂中浸沒8～12小時后, 放入烤箱中在70 ℃高溫聚合72小時以上。

1.5X射線顯微鏡成像 完成樣品制備后，對耳蝸樣品使用X射線顯微鏡(Xradia 520 Versa)進行成像，成像參數(shù)如下：加速電壓60 kV，分辨率0.7微米，成像視野1.4毫米，曝光時間10 秒，共收集3 201張。圖片數(shù)據(jù)由商業(yè)版軟件Dragonfly(Objective Research Systems Inc.)進行處理。

1.6掃描電鏡成像 使用Leica-TRIM2修塊機對耳蝸樣品進行打磨，至顯微鏡下可以看出暴露的耳蝸內(nèi)部切面，再用Leica-UC7型超薄切片機拋光表面。耳蝸縱切面噴炭后(型號：208carbon，TED PELLA)，使用場發(fā)射掃描電鏡 (型號: Gemini300, 蔡司)，Onpoint背散射探測器(Gantan)對樣品表面的形貌進行觀察成像，大視野拼圖的成像條件為：電壓2 kV，像素33納米，單像素駐留時間2微秒。高分辨率圖像成像條件為：電壓2 kV，像素11納米，單像素駐留時間1 微秒。使用Image J軟件(NIH)將圖片整合成完整的耳蝸切面圖，并分析高分辨率圖像。

1.7透射電鏡成像 對已經(jīng)拋光的耳蝸切面繼續(xù)使用超薄切片機(Leica-UC7)切片，切片厚度70納米，用100目帶方華膜銅網(wǎng)撈取3～5張切片，晾干后再經(jīng)醋酸雙氧鈾染色7分鐘，清洗晾干后拿到透射電鏡(FEI TALOS L 120 C)下觀察。先在低倍鏡下找到目標區(qū)域后，再對目標區(qū)域進行局部放大，并用4 k×4 k CCD 相機進行拍照(加速電壓120 kV)。

2 結(jié)果

按照改進后的電鏡塊染方法制備得到的耳蝸樣品在X射線顯微鏡下表現(xiàn)出良好的均一性和對比度(圖1a、b)。亞微米的掃描體素大小(0.7 微米)使外毛細胞可在橫斷面方向進行自動峰值信號檢測，實現(xiàn)細胞的自動計數(shù)(圖1c)。

圖1 耳蝸X射線顯微鏡成像 a. 耳蝸蝸軸切面X 射線顯微鏡成像圖。OC為Corti器,OHC為外毛細胞,AN為聽神經(jīng),標尺:100 μm;b. 在0.7 μm 的體素大小下,耳蝸電鏡樣品的3D重構(gòu)圖以及虛擬切片的耳蝸內(nèi)部結(jié)構(gòu)(小圖為Corti器),標尺: 200 μm;c. a圖中白色方框區(qū)域的外毛細胞橫截面圖,標尺:10 μm;耳蝸底回、中回、頂回的信號強度表明整個耳蝸樣品的對比度接近且可實現(xiàn)單個毛細胞計數(shù),每個區(qū)域的強度最大值(曲線峰值)為外毛細胞所在區(qū)域(底部:7.1 μm,中部:6.43 μm,頂部:6.44 μm) 圖2 耳蝸蝸軸切面掃描電鏡拼圖 Apex:耳蝸頂回,Middle:耳蝸中回,Base:耳蝸底回;標尺: 200 μm

由于X射線顯微成像是無損的，然后，樣品可使用掃描電鏡進行背反射電子成像，拼接后的高分辨大視野圖像(圖2)再次驗證了樣品良好的染色均一性。進一步放大局部，聽神經(jīng)上髓鞘(圖3a)，內(nèi)毛細胞內(nèi)帶狀突觸(圖3b)以及外毛細胞頂部纖毛(圖3c)均清晰可見，且圖像具有較好的對比度，可滿足形態(tài)學分析。

該方法制備的耳蝸樣品同樣適用于透射電鏡成像(圖4)，可見，樣品中聽神經(jīng)髓鞘層狀結(jié)構(gòu)(圖4a)、傳出突觸中突觸囊泡及線粒體(圖4b)以及外毛細胞頂端纖毛結(jié)構(gòu)同樣清晰可見(圖4c)。

圖3 高分辨率下的掃描電鏡圖片 a:蝸軸聽神經(jīng);b:帶狀突觸(箭頭所示);c:外毛細胞靜纖毛(箭頭所示)。標尺: 1 μm

圖4 透射電鏡圖片 a:聽神經(jīng)上髓鞘;b:傳出神經(jīng)突觸;c:靜纖毛在透射電鏡下的高分辨圖片。 AN 為聽神經(jīng),OHC 為外毛細胞,EF 為傳出神經(jīng),黑色箭頭為側(cè)連接。標尺大小如圖。

3 討論

電鏡成像廣泛運用于生命科學研究，制樣的質(zhì)量直接影響到成像和后期對結(jié)構(gòu)細節(jié)的解釋。與其它生物樣品相比，耳蝸組織的制備難度更大，其主要原因在于其為堅硬的骨質(zhì)包裹及內(nèi)部大量的空腔結(jié)構(gòu)，阻礙了染料的滲透和樹脂包埋的均一性。雖然長時間脫鈣可以增加結(jié)構(gòu)的通透性，但容易導致細胞膜和細胞骨架結(jié)構(gòu)的破壞。而內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的電鏡研究需解剖分離出目標組織進行樣品制備，增加了樣品機械性損傷的風險，且不可避免地破壞了組織的三維結(jié)構(gòu)。

近期高通量三維電鏡成像技術[18]的出現(xiàn)，提高了大尺寸腦組織的三維重構(gòu)的可行性[10,12,19]，已應用于模式動物以及臨床樣品，如視網(wǎng)膜、大腦、脊椎等[13，16，20，21]，但耳蝸神經(jīng)回路相關的三維電鏡研究目前還是空白。本研究在總結(jié)前期工作的基礎上[3，11，22～26]，根據(jù)耳蝸的結(jié)構(gòu)特點進行了一系列改進和優(yōu)化：首先，在低溫下通過圓窗和卵圓窗對耳蝸進行混合固定劑的灌注，固定過程中最大程度的降低細胞活性；其次，耳蝸在經(jīng)過4小時的充分固定后再進行脫鈣，這樣在增加樣品通透性的同時減少了細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞[22]。另外，還針對小鼠耳蝸的尺寸，相應延長塊染、脫水以及樹脂包埋的時間，確保樣品染色和樹脂包埋的均一性[7]。通過上述改進方法所制備的樣品具有優(yōu)異的染色對比度，利用小型X射線顯微鏡，實現(xiàn)了毛細胞分辨率的全耳蝸三維成像，獲得了過去需要借助更強大的同步輻射器光源才能得到的類似實驗結(jié)果[27,28]，顯著降低了實驗成本。同時X射線顯微鏡可以對樣品進行無損的快速預掃，從而評估樣品的質(zhì)量以及立體定位目標區(qū)域[29]。

本研究采用掃描和透射電鏡對得到的樣品中各個特征部位進行了觀察，圖像質(zhì)量均達到超微結(jié)構(gòu)解析的要求。后期將嘗試利用三維電鏡對耳蝸組織進行重構(gòu)，獲取包括各類聽神經(jīng)的連接方式、帶狀突觸形態(tài)、線粒體分布等一系列結(jié)構(gòu)信息，用于聲音編碼機制的研究。前期研究表明，水楊酸鹽誘導的耳鳴[30]以及噪聲暴露造成的隱性聽力損失都和耳蝸神經(jīng)回路中的突觸可塑性有著密切的關系。耳蝸神經(jīng)回路的三維結(jié)構(gòu)解析將幫助人們進一步揭示能量及代謝相關結(jié)構(gòu)可能存在的改變，如線粒體[15]、自噬小體[31]和多泡體，來鎖定相關信號通路。