周丁丁，史小玉，王杰，范元嬋，祝智威，蔣海賓，范小雪，熊翠玲，鄭燕珍，付中民，徐國(guó)鈞，陳大福，郭睿

（福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福州 350002）

0 引言

【研究意義】東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)（Nosema ceranae）是一種常見(jiàn)的蜜蜂真菌病原，特異性侵染成年蜜蜂的中腸上皮細(xì)胞，導(dǎo)致宿主產(chǎn)生諸多生理和病理變化[1-3]。目前，有關(guān)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA）的信息尤為有限[4-5]。利用組學(xué)技術(shù)探究東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的不同作用方式及潛在功能，可為探明東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子發(fā)芽以及在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖相關(guān)機(jī)制提供依據(jù)，篩選出的關(guān)鍵lncRNA有望為蜜蜂微孢子蟲(chóng)病的診斷和治療提供新型分子標(biāo)記和靶點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】真核細(xì)胞中存在大量的ncRNA，其中l(wèi)ncRNA是一類長(zhǎng)度＞200 nt，沒(méi)有長(zhǎng)閱讀框，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，同時(shí) 5′端加帽與 3′端加尾而形成的轉(zhuǎn)錄本，具有復(fù)雜而特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)支架、向?qū)Ш驼T餌等方式參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及代謝等生命活動(dòng)[4-6]。有研究表明lncRNA可通過(guò)順式（cis）作用調(diào)控同一染色體上鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)，或通過(guò)反式（trans）作用調(diào)控距離較遠(yuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄激活及表達(dá)[6-9]。此外，含有微小 RNA 反應(yīng)元件（microRNA response element，MRE）的lncRNA還能夠作為“分子海綿”吸附結(jié)合miRNA，通過(guò)發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調(diào)控作用間接影響miRNA與mRNA的靶向結(jié)合[6,10-11]。基于鏈特異性建庫(kù)策略的二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與成熟為在全基因組水平鑒定lncRNA提供了強(qiáng)大工具[6,12]。目前，已在人類[13]、小鼠[14]、擬南芥[15]、果蠅[16]等模式生物中鑒定出大量lncRNA。但相比較而言，真菌的lncRNA研究起步較晚且發(fā)展滯后。FAUQUENOY等[9]運(yùn)用生物信息學(xué)方法在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中篩選出與mRNA鄰近的68個(gè)lncRNA，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA對(duì)鄰近蛋白編碼基因具有調(diào)控作用；LIU等[17]利用RNA-seq技術(shù)對(duì)未發(fā)芽和發(fā)芽的家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，基于測(cè)序數(shù)據(jù)分別組裝出 2 756和 2 690個(gè)unigenes，進(jìn)而通過(guò)比較分析篩選出66個(gè)顯著差異表達(dá)基因。然而對(duì)于東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)等蜜蜂病原，lncRNA的相關(guān)信息極其匱乏。GUO等[18]通過(guò)基于鏈特異性cDNA文庫(kù)的lncRNA-seq技術(shù)對(duì)蜜蜂白堊病病原蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis，簡(jiǎn)稱球囊菌）的菌絲和孢子混合樣品進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定出379個(gè)lncRNA，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些lncRNA具有類似于其他物種已報(bào)道 lncRNA的結(jié)構(gòu)特征；ATKINSON[19]利用RNA-seq技術(shù)在裂殖酵母中鑒定出5 775個(gè)lnRNA，進(jìn)而通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)其中的1 557個(gè)lnRNA已被注釋，多數(shù)lncRNA表達(dá)與mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，這些lncRNA的cis作用及核內(nèi)的共轉(zhuǎn)錄功能介導(dǎo)了裂殖酵母的調(diào)控機(jī)制；GUO等[20]利用lncRNA的cDNA芯片技術(shù)對(duì)人的慢性骨髓白血病細(xì)胞的lncRNA進(jìn)行了全面分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA-BGL3作為一種 ceRNA靶向結(jié)合 miR-17家族的多個(gè)miRNA，進(jìn)而調(diào)控腫瘤抑制因子 PTEN相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)。【本研究切入點(diǎn)】目前，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的lncRNA研究非常滯后，相關(guān)信息匱乏。筆者團(tuán)隊(duì)前期已利用基于 cDNA鏈特異性文庫(kù)的lncRNA-seq技術(shù)對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)純化孢子進(jìn)行深度測(cè)序，聯(lián)用CPC、CNCI、CPAT和Pfam軟件鑒定出83個(gè)lncRNA，進(jìn)而對(duì)上述lncRNA的種類和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了初步分析，并利用RT-PCR驗(yàn)證了其中13個(gè)lncRNA的真實(shí)表達(dá)[21]。然而，這些lncRNA在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中具有怎樣的調(diào)控功能以及如何發(fā)揮作用仍未可知。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技術(shù)對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)純化孢子進(jìn)行測(cè)序，結(jié)合高質(zhì)量的 sRNA數(shù)據(jù)和前期獲得的 lncRNA數(shù)據(jù)進(jìn)一步深入分析東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)lncRNA的cis作用和ceRNA作用，為東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的lncRNA信息提供有益補(bǔ)充，并揭示 lncRNA在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中的潛在功能。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年12月至2019年4月在福建農(nóng)林大學(xué)完成。

1.1 生物材料

供試東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)純化孢子由福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）蜜蜂保護(hù)實(shí)驗(yàn)室制備和保存[18,21]。

1.2 LncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)源

前期研究中，筆者團(tuán)隊(duì)通過(guò)Percoll不連續(xù)密度梯度離心獲得了東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的純化孢子，利用lncRNA-seq技術(shù)對(duì)純化孢子（NcL-1、NcL-2、NcL-3）進(jìn)行了深度測(cè)序，獲得了高質(zhì)量的 lncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)[21]。鏈特異性cDNA文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序委托北京百邁克生物科技有限公司完成，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq Xten。LncRNA-seq的原始數(shù)據(jù)已上傳 NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，BioProject號(hào)：PRJNA395264。

1.3 sRNA-seq及數(shù)據(jù)質(zhì)控

在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的純化孢子中加入適量液氮充分研磨至粉末，利用Trizol法分別抽提3份純化孢子樣品（NcS-1、NcS-2、NcS-3）的總 RNA，通過(guò) Nanodrop超微量測(cè)定儀（Thermo公司，美國(guó)）檢測(cè)上述RNA的濃度，通過(guò)Qubit 2.0（Life公司，美國(guó)）和Agilent 2100 bioanalyzer（Agilent公司，美國(guó)）分別檢測(cè)上述RNA的純度和完整性。對(duì)于檢測(cè)合格的RNA，以1.5 μL的量作為RNA樣本起始量，用無(wú)菌水補(bǔ)充體積至6 μL，使用small RNA Sample Pre Kit試劑盒（Illumina公司，美國(guó)）進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。由于 sRNA 的 5′端含磷酸基團(tuán)，3′端含羥基，利用T4 RNA Ligase 1和T4 RNA Ligase 2分別在sRNA的3′端和5′端連接上接頭序列，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用膠分離技術(shù)篩選目的片段，切膠回收得到的片段即為sRNA文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Qubit 2.0對(duì)文庫(kù)的濃度進(jìn)行檢測(cè)，將文庫(kù)濃度稀釋至1 ng·μL-1，使用Agilent 2100 bioanalyzer（Agilent公司，美國(guó)）對(duì)Insert Size進(jìn)行檢測(cè)，使用qPCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。委托北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行sRNA-seq，測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq，sRNA的測(cè)序讀長(zhǎng)為single-end (SE) 50 nt。sRNA-seq的原始數(shù)據(jù)已上傳 NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，BioProject號(hào)：PRJNA395137。

對(duì)于下機(jī)的原始數(shù)據(jù)，因含有接頭序列或低質(zhì)量序列，首先以以下流程進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控：（1）去除低質(zhì)量值的讀段（reads）；（2）去除未知堿基（N）含量≥10%的reads；（3）去除沒(méi)有3′接頭序列的reads；（4）剪切掉3′接頭序列；（5）去除長(zhǎng)度＜18 nt和＞30 nt的序列。經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)控后得到的數(shù)據(jù)即為有效讀段（clean reads）。

進(jìn)一步通過(guò) Bowtie軟件將 clean reads分別與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.arb-silva.de/）、GtRNAdb數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bigd.big.ac.cn/databasecommons/database/id/1306）、Rfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rfam.xfam.org/）和Repbase數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.repeatmasker.org/）進(jìn)行序列比對(duì)，過(guò)濾掉其他 ncRNA及重復(fù)序列，得到含miRNA的未注釋有效讀段（unannotated clean reads）映射（mapping）到東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)參考基因組（assembly ASM98816v1），獲得clean reads在參考基因組上的位置信息。

1.4 LncRNA上下游基因的功能注釋

基于東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)純化孢子的 lncRNA-seq數(shù)據(jù)，筆者團(tuán)隊(duì)前期已聯(lián)用 CPC、CNCI、CPAT和Pfam軟件分別預(yù)測(cè)出162、295、342和206條lncRNA，四者的交集為83條lncRNA[21]。位于編碼蛋白基因上下游的lncRNA可能在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)具有調(diào)控作用[8-9]。因此，將lncRNA上下游100 kb范圍內(nèi)的鄰近基因作為其調(diào)控的潛在靶基因。利用 Blast軟件對(duì) lncRNA的上下游基因進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)（http://geneontology.org/）和 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.kegg.jp/）注釋。

1.5 LncRNA的靶miRNA預(yù)測(cè)與ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

參照郭睿等[22]的方法，利用Target Finder軟件[23]預(yù)測(cè)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中 lncRNA 靶向結(jié)合的miRNA及miRNA靶向結(jié)合的mRNA，軟件參數(shù)設(shè)置為：自由能≤-20 kcal·mol-1，空位開(kāi)度=-0.9，空位擴(kuò)展=-4.0。利用三者之間的靶向結(jié)合關(guān)系構(gòu)建lncRNA-miRNA及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape v3.7.2軟件[24]對(duì)上述調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.6 LncRNA和靶mRNA的RT-PCR驗(yàn)證

根據(jù) 1.5中靶向預(yù)測(cè)的結(jié)果，隨機(jī)選取 2個(gè)lncRNA（MSTRG.3636.1和 MSTRG.4883.1）和8個(gè)靶 mRNA（gene565、gene1719、gene1695、gene1563、gene1439、gene1366、gene1360和 gene1134）進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。根據(jù)上述lncRNA和mRNA的核酸序列利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物（表 1）。參照GUO等[21]的方法，利用RNA抽提試劑盒（TaKaRa，中國(guó)）提取東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子的總RNA，作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA 模板 1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，PCR mix 10 μL，無(wú)菌水 7 μL。將無(wú)菌水設(shè)為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系（20 μL）：無(wú)菌水模板1 μL，上述2個(gè)lncRNA和8個(gè)靶mRNA的混合上游引物 1 μL（每種 0.1 μL）、混合下游引物 1 μL（每種0.1 μL），PCR mix 10 μL，無(wú)菌水 7 μL。PCR 程序：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 50 s，55℃退火 30 s，72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.6%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像儀（上海培清，中國(guó)）檢測(cè)。

1.7 MiRNA的Stem-loop RT-PCR驗(yàn)證

通過(guò)Stem-loop RT-PCR驗(yàn)證對(duì)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中 3個(gè)靶 miRNA（nce-miR-7502、nce-miR-7729和nce-miR-8565）的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。利用RNA抽提試劑盒（TaKaRa公司，日本）提取東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子的總RNA。參照郭睿等[25]和杜宇等[26]的方法，利用DNAMAN軟件（LynnonBiosoft公司，美國(guó)）設(shè)計(jì)miRNA的Stem-loop引物、上游和下游引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物（表 1）。利用Stem-loop引物經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系（20 μL）：上下游引物（1.67 μmol·L-1）和 cDNA 模板各 1 μL，PCR mix 10 μL，無(wú)菌水7 μL。將DEPC水設(shè)為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系（20 μL）：DEPC水模板1 μL，上述3個(gè)靶miRNA的混合上游引物0.9 μL（每種0.3 μL）、混合下游引物0.9 μL（每種 0.3 μL），PCR mix 10 μL，無(wú)菌水 7.2 μL。PCR 程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，46℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 LncRNA-seq及sRNA-seq的數(shù)據(jù)質(zhì)控

前期研究中，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)純化孢子樣品（NcL-1、NcL-2、NcL-3）的lncRNA-seq得到的clean reads數(shù)分別為107 123 113、117 688 499和116 776 007條，占 raw reads的比例分別為 79.75%、78.84%和76.15%；Q30分別達(dá)到90.39%、90.49%和89.79%[21]。高質(zhì)量的 lncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)可用于本研究中 lncRNA的生物信息學(xué)分析。

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)純化孢子樣品的 sRNA-seq分別得到16 597 883、15 451 791和12 248 316條raw reads，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格過(guò)濾得到的clean reads數(shù)分別為15 608 370（94.04%）、14 249 255（92.22%）和11 440 684（93.41%），Q30分別為98.61%、98.65%和98.58%（表2），說(shuō)明本研究得到的sRNA數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可進(jìn)行下一步分析。將各孢子樣品的unannotated reads比對(duì)到東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的參考基因組，比對(duì)上的reads總數(shù)為22 000 837條，比對(duì)率≥52.87%（表3）。

2.2 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中l(wèi)ncRNA上下游基因的GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中56個(gè)lncRNA共預(yù)測(cè)出 310個(gè)上下游基因。對(duì)這些上下游基因進(jìn)行 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，結(jié)果顯示它們可注釋到生物學(xué)進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞組分相關(guān)的35個(gè)功能條目；在生物學(xué)進(jìn)程中，注釋基因數(shù)最多的條目分別為代謝進(jìn)程（105）、細(xì)胞進(jìn)程（100）、單組織進(jìn)程（45）、生物學(xué)調(diào)控（19）和生物學(xué)進(jìn)程調(diào)控（18）；在分子功能中，注釋基因數(shù)最多的分別為催化活性（96）、結(jié)合（95）、結(jié)構(gòu)分子活性（9）、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（3）和轉(zhuǎn)運(yùn)器活性（3）；在細(xì)胞組分中，注釋基因數(shù)最多的分別為細(xì)胞（64）、細(xì)胞組件（64）、細(xì)胞器（46）、大分子復(fù)合物（34）和細(xì)胞器組件（13）（圖1）。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字代表注釋到該功能條目的上下游基因數(shù)。

圖1 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中l(wèi)ncRNA的上下游基因的GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Fig. 1 GO database annotation of upstream and downstream genes of lncRNAs in N. ceranae spore

表2 sRNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)Table 2 Overview of sRNA-seq datasets

表3 sRNA-seq數(shù)據(jù)比對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)參考基因組的信息統(tǒng)計(jì)Table 3 Summary of mapping information of sRNA-seq data to the reference genome of N. ceranae

2.3 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中l(wèi)ncRNA上下游基因的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

進(jìn)一步對(duì)lncRNA的上下游基因進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，結(jié)果顯示310個(gè)上下游基因可注釋到56條通路，注釋基因數(shù)最多的前10位分別是新陳代謝途徑（25）、抗生素的生物合成（12）、次生代謝產(chǎn)物的生物合成（11）、核糖體（10）、嘌呤代謝（7）、蛋白酶體（7）、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)（7）、真核生物中核糖體的生物發(fā)生（7）、碳代謝（6）和嘧啶代謝（6）（圖2）。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字代表注釋到該通路的上下游基因數(shù)。

圖2 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中l(wèi)ncRNA的上下游基因的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Fig. 2 KEGG database annotation of upstream and downstream genes of lncRNAs in N. ceranae spore

2.4 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中l(wèi)ncRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中 lncRNA進(jìn)行靶miRNA預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)lncRNA與4個(gè)miRNA存在靶向結(jié)合關(guān)系，其中 MSTRG.3636.1靶向 nce-miR-8565，MSTRG.4498.1靶向nce-miR-7502和nce-miR-8639，MSTRG.4883.1靶向nce-miR-7729（圖3）。

2.5 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中 lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

利用軟件預(yù)測(cè) lncRNA靶向結(jié)合 miRNA的靶mRNA，綜合lncRNA、miRNA與mRNA的靶向結(jié)合關(guān)系構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析發(fā)現(xiàn)MSTRG.4883.1靶向的nce-miR-7729共結(jié)合16個(gè)mRNA，MSTRG.3636.1靶向的nce-miR-8565共結(jié)合15個(gè)mRNA，lncRNA、miRNA和mRNA之間形成密切的調(diào)控關(guān)系；3個(gè)lncRNA的4個(gè)靶miRNA可結(jié)合59個(gè)mRNA，其中MSTRG.4498.1靶向的nce-miR-7502和nce-miR-8639共結(jié)合28個(gè)mRNA，三者形成更為復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系（圖4）。

圖3 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中的lncRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig. 3 LncRNA-miRNA regulatory network in N. ceranae spore

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上述靶mRNA在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋皆為假定蛋白；但在Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)中均有功能注釋信息，如gene2014、gene1662和gene1383分別注釋為轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白1、微管蛋白γ鏈和V型質(zhì)子ATP酶催化亞基A（表4）。

2.6 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中l(wèi)ncRNA、靶miRNA和靶mRNA的分子驗(yàn)證

通過(guò)RT-PCR對(duì)上述ceRNA網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA和靶mRNA的進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示8個(gè)靶mRNA均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶，陰性對(duì)照未擴(kuò)增出片段；2個(gè) lncRNA也能擴(kuò)增出預(yù)期片段，陰性對(duì)照未擴(kuò)增出片段；利用Stem-loop RT-PCR對(duì)上述ceRNA網(wǎng)絡(luò)中靶miRNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示3個(gè)靶miRNA均擴(kuò)增出大小約100 bp的目的片段，陰性對(duì)照未擴(kuò)增出片段（圖 5）。上述結(jié)果表明東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中l(wèi)ncRNA、靶miRNA和靶mRNA真實(shí)表達(dá)。

圖4 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中3個(gè)lncRNA的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig. 4 Competing endogenous network of three lncRNAs in N. ceranae spore

表4 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中l(wèi)ncRNA靶向miRNA的靶mRNA的Swissprot和Nr數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Table 4 Swissprot and Nr database annotations of target mRNAs of miRNAs targeted by lncRNAs in N. ceranae spore

圖5 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中l(wèi)ncRNA、靶miRNA和靶mRNA的RT-PCR驗(yàn)證Fig. 5 RT-PCR verification of lncRNAs, target miRNAs and target mRNAs in N. ceranae spore

3 討論

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子處于休眠態(tài)，人們對(duì)于孢子中是否存在轉(zhuǎn)錄、翻譯和新陳代謝等生命活動(dòng)的認(rèn)識(shí)十分有限。前期研究中，筆者團(tuán)隊(duì)證實(shí)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子同樣存在一定水平的轉(zhuǎn)錄，并基于高質(zhì)量的lncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定出83條lncRNA，同時(shí)對(duì)這些lncRNA的種類和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了全面分析[21]，為東方蜜蜂微孢子蟲(chóng) lncRNA的深入研究提供了必要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究結(jié)合前期獲得的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)lncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)和測(cè)序得到的sRNA組學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步深入探究東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中 lncRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及潛在功能。目前，動(dòng)植物和微生物等物種的sRNA-seq數(shù)據(jù)在相應(yīng)參考基因組上的比對(duì)率一般介于50%—70%[27-29]，原因在于 sRNA的長(zhǎng)度很短，比對(duì)參考基因組時(shí)要求每個(gè)堿基均要匹配上，因此導(dǎo)致比對(duì)率偏低。本研究中，NcS-1、NcS-2和NcS-3的clean reads在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)參考基因組上的比對(duì)率介于 52.87%—60.36%，與其他物種的研究報(bào)道類似，屬于正常的比對(duì)率范圍。目前，NONCODE[30]、LncRNAdb[31]和 LncRNome[32]等lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中有限的功能注釋信息局限于人類和其他少數(shù)模式物種（如小鼠、果蠅和擬南芥等）。GUO等[33]構(gòu)建了家蠶微孢子蟲(chóng)感染家蠶（Bombyx mori）卵巢BmN細(xì)胞的連續(xù)感染系，進(jìn)而利用脂質(zhì)體介導(dǎo)將含gfp的轉(zhuǎn)座子載體 piggyBac和非轉(zhuǎn)座子載體pIZT/V5-His轉(zhuǎn)染感染細(xì)胞，通過(guò)分子生物學(xué)手段證實(shí)外源gfp被成功導(dǎo)入家蠶微孢子蟲(chóng)基因組；此外，GUO等[33]還通過(guò)飼喂家蠶微孢子蟲(chóng)孢子感染家蠶個(gè)體，然后通過(guò)無(wú)菌操作將蠶血加入正常 BmN細(xì)胞，再進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法也成功將gfp導(dǎo)入了家蠶微孢子蟲(chóng)基因組；這是對(duì)微孢子蟲(chóng)直接進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的首例報(bào)道，為東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)等其他微孢子蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因研究提供了重要的思路和方法借鑒。目前，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的基因功能研究仍處于初步階段。PALDI等[34]利用飼喂的方法將人工合成的靶向 ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)器蛋白編碼基因的雙鏈RNA（dsRNA）導(dǎo)入被東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染的西方蜜蜂體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)病原的ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)器蛋白轉(zhuǎn)錄本受到干擾而沉默，該沉默影響了病原增殖水平和宿主生理狀態(tài)；HUANG等[35]通過(guò)飼喂小干擾RNA（siRNA）對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染的西方蜜蜂的Dicer進(jìn)行敲減，發(fā)現(xiàn)病原孢子數(shù)顯著下降，此外超過(guò)10%的病原蛋白編碼基因呈現(xiàn)顯著性差異表達(dá)。對(duì)于包括東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在內(nèi)的絕大多數(shù)物種，通過(guò)分析和驗(yàn)證 lncRNA的cis、trans和ceRNA作用，從而間接推測(cè)lncRNA的潛在功能仍是常用方法[6-11]。較多的研究表明lncRNA可以與一些較遠(yuǎn)基因上的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子結(jié)合，通過(guò)trans作用行使其對(duì)編碼蛋白基因表達(dá)的調(diào)控[7]。然而，本研究并沒(méi)有預(yù)測(cè)到表達(dá)量存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系的lncRNA和mRNA，暗示lncRNA在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的休眠態(tài)孢子中不行使trans作用。鑒于lncRNA的表達(dá)具有時(shí)空特異性[36]，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在孢子發(fā)芽和侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程中是否存在trans作用或通過(guò)哪些方式發(fā)揮主要作用，值得進(jìn)一步深入研究。利用鏈特異性建庫(kù)的 lncRNA-seq技術(shù)對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染的蜜蜂中腸組織進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)連續(xù)比對(duì)宿主蜜蜂參考基因組和東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)參考基因組過(guò)濾得到病原的 lncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)而分析病原lncRNA的trans作用是具有可行性的方法。為探究東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中l(wèi)ncRNA的潛在功能，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)lncRNA的上下游基因和靶向結(jié)合的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)而對(duì)lncRNA的cis作用方式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中 56條lncRNA可能調(diào)控310個(gè)上下游基因，它們涉及代謝進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程、催化活性、結(jié)合和細(xì)胞組件等 35條功能條目，說(shuō)明lncRNA可能廣泛參與孢子休眠狀態(tài)的基礎(chǔ)生命活動(dòng)，但其具體功能仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

目前，lncRNA的相關(guān)研究主要集中在少數(shù)模式生物，如人類[13]、小鼠[14]、果蠅[16]、酵母[7,9]等；其中多數(shù)研究集中在lncRNA的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析，僅少數(shù)研究涉及l(fā)ncRNA的功能驗(yàn)證，有限的技術(shù)手段是最大的限制因素。ZHAN等[37]研究發(fā)現(xiàn)山羊骨骼肌細(xì)胞中的1 153個(gè)lncRNA潛在調(diào)控1 455個(gè)上游及下游基因，部分上下游基因可能參與了骨骼肌細(xì)胞的發(fā)育，說(shuō)明相應(yīng)的lncRNA在山羊骨骼肌細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中具有潛在的cis調(diào)控作用；FAUQUENOY等[9]通過(guò)對(duì)野生型和缺失一個(gè)拷貝rse1等位基因的雜合二倍體突變型裂殖酵母菌株進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)lncRNA通過(guò)抑制復(fù)合物的支架結(jié)構(gòu)特異性抑制鄰近的rse1等位基因表達(dá)，表明lncRNA通過(guò)cis作用抑制裂殖酵母的細(xì)胞分化。本研究中，對(duì)于東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的lncRNA，分別有105、100和45個(gè)上下游基因注釋在代謝進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程和單組織進(jìn)程，說(shuō)明相應(yīng)的lncRNA通過(guò)cis作用維持東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子處于休眠態(tài)期間的基礎(chǔ)新陳代謝。此外，分別有64、64和46個(gè)上下游基因涉及細(xì)胞組件、細(xì)胞和細(xì)胞器，表明lncRNA對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子的細(xì)胞生命活動(dòng)中具有潛在的調(diào)節(jié)功能。還發(fā)現(xiàn)有96個(gè)上下游基因涉及催化活性，進(jìn)一步表明lncRNA可能參與東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子內(nèi)新陳代謝過(guò)程的生化反應(yīng)。LncRNA通過(guò)與 DNA、RNA或蛋白質(zhì)的相互作用而發(fā)揮調(diào)控作用[4,36]。東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在進(jìn)行發(fā)芽和極絲彈射之前，首先需要識(shí)別和接觸宿主細(xì)胞，進(jìn)而與宿主細(xì)胞相互作用[38-41]，上述過(guò)程必然也伴隨著不同生物大分子之間的結(jié)合。本研究中，有 95個(gè)上下游基因涉及分子功能中的結(jié)合，暗示lncRNA在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子內(nèi)可能通過(guò)與其他生物大分子的相互結(jié)合發(fā)揮特定的調(diào)控功能，也可能在病原識(shí)別和接觸宿主細(xì)胞中扮演特定角色。微孢子蟲(chóng)具有一層堅(jiān)硬的孢子壁，能夠保護(hù)內(nèi)部結(jié)構(gòu)免受外界不良環(huán)境破壞[41]。東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖的過(guò)程需要不斷適應(yīng)外部環(huán)境并作出應(yīng)激反應(yīng)。本研究中，有14個(gè)上下游基因涉及應(yīng)激反應(yīng)，說(shuō)明相應(yīng)的 lncRNA（MSTRG.4856.1、MSTRG.5126.1、MSTRG.5617.1、MSTRG.6243.1、MSTRG.6290.1、MSTRG.6328.1、MSTRG.6473.1、MSTRG.6633.1、MSTRG.6654.2、MSTRG.6688.1、MSTRG.6683.1、MSTRG.6692.1和 MSTRG.6703.1）在孢子的環(huán)境應(yīng)激方面發(fā)揮一定作用。

在糖酵解途徑中，2-磷酸甘油酸可在烯醇化酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖幔M(jìn)而在丙酮酸激酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橄┐际奖?，過(guò)程中產(chǎn)生兩分子的H2O，同時(shí)兩分子 ADP轉(zhuǎn)化為兩分子 ATP[42]。DOLGIKH等[43]檢測(cè)了黃斑黑蟋蟀微孢子蟲(chóng)（Nosema grylli）孢子中6-磷酸葡萄糖脫氫酶、葡萄糖磷酸變位酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、6-磷酸果糖激酶及3-磷酸甘油酸激酶等14種酶的活性，并分析了相關(guān)能量代謝途徑，發(fā)現(xiàn)黃斑黑蟋蟀微孢子蟲(chóng)可能利用自身儲(chǔ)備的碳水化合物而不是外源物質(zhì)，推測(cè)糖酵解是黃斑黑蟋蟀微孢子蟲(chóng)碳水化合物分解代謝的主要途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，gene1402、gene2290、gene2665和gene926這4個(gè)上下游基因涉及糖酵解/糖異生途徑，其中 gene926和gene2290分別注釋到 Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)中的胃瘤真菌的烯醇化酶基因和兔腦炎微孢子蟲(chóng)（Encephalitozoon cuniculi）的丙酮酸激酶基因，表明相應(yīng)的 lncRNA（MSTRG.6328.1和MSTRG.4700.1）具有調(diào)節(jié)糖酵解/糖異生途徑的潛在功能，可能在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子的能量代謝方面發(fā)揮作用。此外，共有85個(gè)上下游基因注釋在10條碳水化合物代謝相關(guān)通路，包括代謝途徑（25）、抗生素的生物合成（12）和次生代謝產(chǎn)物的生物合成（11）等，進(jìn)一步說(shuō)明相應(yīng)的 lncRNA參與調(diào)節(jié)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子的能量代謝。核苷酸是組成DNA和RNA的重要部分，并作為電子信號(hào)和能量載體在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用[44]。HEINZ等[45]研究了來(lái)自 HIV/AIDS患者的人氣管普孢子蟲(chóng)（Trachipleistophora hominis）中的4種核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，驗(yàn)證了這些蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)有放射性標(biāo)記的2種嘌呤核苷酸，并未發(fā)現(xiàn)嘧啶核苷酸；作者進(jìn)一步將人工合成酶與細(xì)胞內(nèi)人氣管普孢子蟲(chóng)、兔腦炎微孢子蟲(chóng)和東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)酶比較，發(fā)現(xiàn)存在嘌呤和嘧啶核苷酸在磷酸化和氧化作用之間相互轉(zhuǎn)換的一類核心酶，表明微孢子蟲(chóng)中的此類酶能夠保持嘌呤和嘧啶處于不同的激活狀態(tài)滿足生命活動(dòng)過(guò)程中的相關(guān)代謝途徑。本研究中，分別有7和6個(gè)上下游基因注釋到嘌呤代謝和嘧啶代謝，其中的共有基因?yàn)?6個(gè)，分別為gene2676、 gene2395、gene1404、gene2450、gene1439和gene1058，說(shuō)明相應(yīng)的lncRNA（MSTRG.6703.1、MSTRG.6459.2、MSTRG.6459.1、MSTRG.5334.1、MSTRG.6512.1、MSTRG.5375.1、MSTRG.4883.1 和MSTRG.4883.1）具有通過(guò)調(diào)控東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中的嘌呤代謝和嘧啶代謝影響遺傳信息傳遞、電子傳遞、信號(hào)通路及能量代謝的潛在作用。還發(fā)現(xiàn)分別有6、2、1、1和1個(gè)上下游基因分別注釋到碳代謝、丙酮酸代謝、磷酸肌醇代謝、脂肪酸代謝和果糖甘露糖代謝等物質(zhì)代謝通路；有 2、1和1個(gè)基因分別注釋到甲烷代謝、氧化磷酸化和過(guò)氧化物酶體等能量代謝通路；上述結(jié)果進(jìn)一步表明相應(yīng)的 lncRNA（MSTRG.4700.1、MSTRG.5292.1、MSTRG.5334.1、MSTRG.6328.1、MSTRG.6383.1、MSTRG.6688.1、MSTRG.6692.1和MSTRG.6703.1）通過(guò)cis作用參與東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中的基本物質(zhì)和能量代謝的調(diào)控。

SALMENA等[46]于 2011年提出了“ceRNA 假說(shuō)”，該假說(shuō)認(rèn)為含有 MRE的 mRNA、假基因和lncRNA等RNA，能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，從而間接影響靶基因的表達(dá)量[46-47]。隨后，越來(lái)越多的研究結(jié)果證實(shí)了這一主流假說(shuō)[22,46-48]。WANG 等[48]利用熒光素酶RNA免疫沉淀技術(shù)探究在低氧或炎癥因子處理下 lncRNA的ceRNA機(jī)制，結(jié)果顯示 lncRNA H19和HULC可作為ceRNA靶向結(jié)合let-7a/let-7b和miR-372/miR-373，從而參與炎癥反應(yīng)促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲。前期研究中，筆者團(tuán)隊(duì)曾對(duì)意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）工蜂7 d和10 d中腸發(fā)育過(guò)程中l(wèi)ncRNA和circRNA差異表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究，分析發(fā)現(xiàn)此2種ncRNA均可作為潛在的ceRNA吸附miRNA，從而減少對(duì)靶mRNA的抑制或降解[22,49]。本研究發(fā)現(xiàn)，MSTRG.4498.1、MSTRG.4883.1和MSTRG.3636.1與4個(gè)miRNA（nce-miR-8565、nce-miR-7502、nce-miR-8639和nce-miR-7729）之間存在靶向結(jié)合關(guān)系；此外，上述4個(gè)miRNA與59個(gè)mRNA也存在靶向結(jié)合關(guān)系，表明lncRNA可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA調(diào)控mRNA的表達(dá)量，進(jìn)而影響東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子休眠態(tài)下的諸多生命活動(dòng)。對(duì)于 lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過(guò) RT-PCR證實(shí)了2個(gè) lncRNA和8個(gè)靶mRNA的真實(shí)表達(dá)，通過(guò)Stem-loop RT-PCR證實(shí)了3個(gè)靶miRNA的真實(shí)表達(dá)（圖5）。但本研究中的靶向結(jié)合關(guān)系是基于生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)出來(lái)的，上述靶向結(jié)合關(guān)系是否真實(shí)存在仍需通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)加以驗(yàn)證。對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶mRNA進(jìn)行功能和代謝通路注釋，結(jié)果顯示它們涉及19條功能條目，包括代謝進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程和催化活性等，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)對(duì)于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中間接調(diào)控靶mRNA的lncRNA，其中部分lncRNA也參與了對(duì)上下游基因的調(diào)控；此外，有24個(gè)靶mRNA富集在18條代謝通路，涉及嘌呤代謝、嘧啶代謝、脂肪酸代謝、過(guò)氧化物酶體及氧化磷酸化等。上述結(jié)果表明部分 lncRNA能同時(shí)通過(guò)cis和ceRNA作用影響靶基因的表達(dá)水平，從而對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子的新陳代謝和基本生命活動(dòng)進(jìn)行靈活調(diào)控。

4 結(jié)論

部分lncRNA可能通過(guò)cis作用調(diào)控上下游基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子中的物質(zhì)代謝、能量代謝和環(huán)境應(yīng)激等生物學(xué)過(guò)程；部分lncRNA可能作為 ceRNA參與調(diào)節(jié)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子休眠態(tài)下的諸多生命活動(dòng)；此外，少數(shù)lncRNA能同時(shí)通過(guò)cis和ceRNA作用影響靶基因的表達(dá)水平，從而對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子的新陳代謝和基本生命活動(dòng)進(jìn)行靈活調(diào)控。