任玲萱， 方 琰， 孫 雙， 白 歡， 卿人韋， 蘭利瓊

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065;(2.國網(wǎng)四川省電力公司電力科學(xué)研究院，成都 610065)

1 引 言

輪藻植物(Charophyte)是一種大型的淡水藻類，其外觀形態(tài)復(fù)雜，有類似“根、莖、葉”的分化.輪藻的營養(yǎng)體由假根(rhizoid)、莖(stem)、小枝(branchlet)構(gòu)成，而莖主要由節(jié)(node)、節(jié)間(internode)、皮層(cortex)、托葉(stipulode)構(gòu)成.輪藻的生殖器官為藏精器(antheridium)和藏卵器(oogonium)，藏卵器頂端有5個(gè)排成一層或是10個(gè)排成兩層的冠細(xì)胞(coronular cell)[1-5].上述形態(tài)均是傳統(tǒng)輪藻植物分類的重要依據(jù).

輪藻門(Charophyta)僅有一綱一目一科，即輪藻綱(Charophyceae)，輪藻目(Charales)，輪藻科(Characeae).輪藻科分為麗藻族(Nitelleae)和輪藻族(Chareae)，其中前者的莖與小枝無皮層，冠細(xì)胞10個(gè)排列成2層；后者的莖與小枝有或無皮層，冠細(xì)胞5個(gè)排列成1層.又根據(jù)部分位置的細(xì)微結(jié)構(gòu)，將麗藻族分為麗藻屬(Nitella)和鳥巢藻屬(Tolypella)；將輪藻族分為擬麗藻屬(Nitellopsis)、麗枝藻屬(Lamprothamnium)、燈枝藻屬(Lychnothamnus)和輪藻屬(Chara)[1-5].輪藻科分類的研究雖是藻類中開始較早的一個(gè)類群，但因其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生殖方式比較特殊，以至于在植物分類系統(tǒng)中的位置以及其內(nèi)部的系統(tǒng)分類至今還存在爭論.除此之外，輪藻在水生植物向陸地植物演化的過程中也扮演著重要的角色[6]，因此進(jìn)一步闡述輪藻植物內(nèi)部系統(tǒng)發(fā)育對(duì)闡釋整個(gè)植物界的起源與演化歷程意義重大.在傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類研究中，常根據(jù)托葉，皮層，冠細(xì)胞和小枝的形態(tài)進(jìn)行分類，但是在其亞屬(subgenus)和組(section)的分類上，分類群之間有形態(tài)特征交叉重復(fù)，界線不分[2-3].因此找到合適的基因片段對(duì)輪藻物種進(jìn)行鑒別，可提高物種鑒定的成功率，了解輪藻植物多樣性，同時(shí)有助于進(jìn)一步探討其在植物進(jìn)化過程中的地位.早在1996年Mccourt等利用rbcL基因?qū)喸逯参锱c其他植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究[7].近年來，國際輪藻學(xué)者也將分子系統(tǒng)手段運(yùn)用于輪藻植物物種再鑒定的研究中，Kato等利用rbcL序列進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育研究，進(jìn)一步驗(yàn)證了C. altaica的分類地位[8].Casanova從新修訂了澳大利亞地區(qū)Chara-Charopsis亞屬中部分輪藻藻種的分類地位，為澳大利亞今后的輪藻研究奠定了基礎(chǔ)[9].

我國曾是輪藻資源大國[10]，但對(duì)輪藻的研究較為薄弱，有長時(shí)間的研究空白階段，僅有關(guān)于輪藻化石，輪藻與環(huán)境污染以及輪藻功能性的研究[11-14]，在輪藻科植物的分類方面無詳細(xì)報(bào)道.與此同時(shí)，因輪藻對(duì)生境水體的清潔度要求較高，對(duì)水質(zhì)變化較為敏感[15-16]，且由于近年來人類活動(dòng)范圍的擴(kuò)大，環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，輪藻棲息地消減，使得輪藻植物正在逐年減少，變得稀有罕見，甚至瀕臨滅絕，很多國家將其列入瀕危物種名錄[17]，同時(shí)也側(cè)面說明了當(dāng)今對(duì)輪藻植物研究的重要性.

本研究對(duì)中國西南地區(qū)輪藻科5個(gè)屬，8種輪藻進(jìn)行18S rDNA，rbcL及atpB基因擴(kuò)增，并結(jié)合GenBank中其他地區(qū)輪藻的已知序列，針對(duì)中國輪藻植物的系統(tǒng)發(fā)育展開研究，并進(jìn)一步討論其內(nèi)部分類結(jié)構(gòu).

2 材料與方法

2.1 材 料

本研究共收集到8種輪藻的12株樣本，其中含輪藻族4個(gè)種，麗藻族2個(gè)種，根據(jù)《中國淡水藻志》鑒定.同時(shí)結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中已知輪藻序列，共有12種輪藻的24株樣本用于本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析中，具體樣本信息見表1.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序 稱取新鮮藻株前5節(jié)，稱取0.5 g(濕重)，經(jīng)液氮充分研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech(Beijing)Co.，Ltd，Beijing，PA，China)提取全基因組DNA.以樣本DNA為模板，對(duì)18S rDNA、rbcL及atpB基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并擴(kuò)增，使用引物分別為：18S p1 (5′-GCCGAAAGACT-AAGCCATGC-3′)，18S p2 (5′-CAGACACTTC ACCGGACCATT-3′)，Tm=57.5 ℃；rbcL p1：(5′-TCGTGTAACTCCACAACCTG-3′)，rbcL p2：(5′-TACTCGGTTAGCTACAGCTC-3′)，Tm=55.4 ℃；atpB p1(5′-GCGGTCGTATTTTCAATGT ATTAGGAG-3′)，atpB p2：(5′-CGCTTCTTCAGATAATTCGTCTAAACC-3′),Tm=58.2 ℃.PCR體系參照PCR反應(yīng)試劑(Vazyme(Nanjing)Co.)，反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[18-19].PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆并送至擎科公司進(jìn)行測(cè)序.

2.2.2 數(shù)據(jù)處理 將測(cè)序獲得的序列采用相似性搜索法(BLAST)檢查根據(jù)傳統(tǒng)分類學(xué)鑒定方法鑒定的成功率，將鑒定正確的序列上傳至GenBank.結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫相關(guān)序列，使用MEGA 7.0中的ClustaW軟件進(jìn)行多序列對(duì)比，計(jì)算和分析種內(nèi)及種間的K2P(Kimura 2-parameter)遺傳距離、總平均遺傳距離，并分析保守位點(diǎn)(conserved site)、變異位點(diǎn)(variable site)，信息位點(diǎn)(informative site)以及GC%[20].使用MEGA 7.0，基于18S rDNA，rbcL，atpB及18S rDNA-rbcL-atpB(3-loci)序列構(gòu)建ML、NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹[18]，對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性通過自展法(bootstrap, BS)進(jìn)行1 000次的重復(fù)取樣.使用MrBayes 3.2.5構(gòu)建BI樹，通過馬爾科夫鏈(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)隨機(jī)選取進(jìn)化樹，以四條鏈(nchains=4)共運(yùn)行2 000 000代，每隔1 000代保存一棵樹，所得進(jìn)化樹的前25%被舍棄(burn-in)[21].進(jìn)化樹所得支持率(ML/BI/NJ)≥50%的分枝可信度較高[22]，“*”表示BS值為100，“-”表示進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為平行支.以上系統(tǒng)進(jìn)化樹中均已Chaetosphaeridium pringsheimii(KU130815、KJ395939、KJ395821)，Chlorella sorokiniana(KP726221、KT777994、EF113498)和Chlorella vulgaris(KX495055、AB260909、D10997)作為外類群(outgroup)[23].

3 結(jié)果與分析

3.1 18S rDNA，rbcL及atpB序列多樣性分析

18S rDNA，rbcL及atpB序列多樣性分析結(jié)果如表2所示，18S rDNA基因的保守位點(diǎn)比例最高，變異位點(diǎn)及簡約信息位點(diǎn)比例最小，同時(shí)GC%最高，以上均表明18S rDNA序列較為保守.且18S rDNA序列的種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離重疊，差異較小，計(jì)算得T.intricata與T.prolifera的種間距離為0.rbcL與atpB基因的分析結(jié)果相似，兩者序列變異度高于18S rDNA，信息位點(diǎn)較多.但atpB序列種間與種內(nèi)遺傳距離重疊，計(jì)算得C.connivens與C.globularis的種間遺傳距離為0.001.rbcL及三基因聯(lián)合序列種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離無重疊，有一定差異.

表2 18S rDNA，rbcL及atpB序列多樣性分析結(jié)果

3.2 分子進(jìn)化樹分析

3.2.1 基于18S rDNA基因的輪藻科植物系統(tǒng)發(fā)育研究 基于18S rDNA基因分析所得的進(jìn)化樹樹主要分成了兩個(gè)分支(圖1)，第Ⅰ分支由輪藻族(Chareae)植株構(gòu)成，第Ⅱ分支由麗藻族(Nitelleae)植物構(gòu)成，輪藻族與麗藻族分別形成單系群，這與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類所得輪藻科植物的分類結(jié)構(gòu)一致[2-4].

在第Ⅰ分支中，輪藻屬植物聚類到一支，形成單系群；燈枝藻屬與擬麗藻屬親緣關(guān)系較近，成為輪藻屬植物的姐妹群.輪藻屬內(nèi)Chara-Grovesia分支的分類結(jié)構(gòu)發(fā)生混亂，其中C.connivens與C.globularis平行交錯(cuò)，無法分開.Chara-Chara分支的四個(gè)樣本以較高的支持率聚類到一支，與其他藻種分開.在第Ⅱ分支中，麗藻族被分為麗藻屬和鳥巢藻屬兩個(gè)分支，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類也將麗藻族劃分為兩個(gè)屬，分子進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)支持形態(tài)學(xué)分類[2-4].鳥巢藻屬內(nèi)部Tolypella-Rothia與Tolypella-Tolypella以很高的支持率將鳥巢藻屬分為兩支，但在Tolypella-Rothia內(nèi)部，由于18S rDNA較為保守，序列變異較小，導(dǎo)致T.intricata與T.prolifera聚類到一支，無法分開.

18S rDNA雖較為保守，無法區(qū)分屬內(nèi)個(gè)別藻種，但較適于輪藻科植物族與屬之間的分類研究，但進(jìn)一步對(duì)屬內(nèi)輪藻植物進(jìn)行分類研究需要利用變異程度更高的序列.

3.2.2 基于rbcL基因的輪藻科植物系統(tǒng)發(fā)育研究 圖2為基于rbcL基因的輪藻科植物系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與18S rDNA所得分析結(jié)果有一定差異，進(jìn)化樹沒有明顯形成兩大支，輪藻族和麗藻族沒有聚類形成單系群，各屬分支形成并系群，鳥巢藻屬作為輪藻族與麗藻屬的姐妹群出現(xiàn)，rbcL基因分析所得進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)形態(tài)分類結(jié)構(gòu)差異較大，分子分析結(jié)果不支持形態(tài)學(xué)分類[2-4]，因此rbcL基因不適用于討論輪藻科植物科內(nèi)族與屬間的分類關(guān)系.

圖1 基于18S rDNA基因的輪藻科植物分子系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 The phylogenetic analysis of characeae based on 18S rDNA gene

在輪藻族分支內(nèi)，燈枝藻屬與擬麗藻屬以100%的支持率聚類到一支，Chara-Grovesia分支的分類仍然存在混亂.在鳥巢藻屬分支中，18S rDNA基因無法區(qū)分開的T.intricata與T.prolifera兩種藻種，經(jīng)過rbcL基因分析后，屬內(nèi)的分類結(jié)構(gòu)得到改善，因此rbcL基因較適用于鳥巢藻屬藻種的分類研究.

圖2 基于rbcL序列的輪藻科植物分子系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 The phylogenetic analysis of characeae based on rbcL gene

3.2.3 基于atpB基因的輪藻科植物系統(tǒng)發(fā)育研究 基于atpB基因的輪藻科植物系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖3)與rbcL基因分析結(jié)果基本一致，輪藻族與麗藻族沒有形成兩大分支，且與rbcL基因分析結(jié)果相比，各分支的支持率較低，同時(shí)Chara-Grovesia分支輪藻植物的分類結(jié)果沒有得到改善.綜上所述，僅利用atpB單基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析不能得到較好的輪藻科植物的分類結(jié)果.

圖3 基于atpB序列的輪藻科植物分子系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 The phylogenetic analysis of characeae based on atpB gene

圖4 基于3-loci序列的輪藻科植物分子系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 The phylogenetic analysis of characeae based on 3-loci gene

3.2.4 基于3-loci基因的輪藻科植物系統(tǒng)發(fā)育研究 圖4為基于18S rDNA-rbcL-atpB三基因聯(lián)合(3-loci)的輪藻科植物系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果.3-loci所得進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與18S rDNA分析所得進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)類似，進(jìn)化樹被分為輪藻族(第Ⅰ分支)與麗藻族(第Ⅱ分支)兩大分支.在第Ⅰ分支中，燈枝藻屬與擬麗藻屬聚類到一起，作為輪藻屬植物的姐妹群，三基因聯(lián)合后，輪藻屬中Chara-Grovesia分支分類混亂的問題得到解決，C. connivens與C. globularis分別以較高的支持率分開.在第Ⅱ分支中，麗藻族被分為麗藻屬和鳥巢藻屬兩大分支，兩屬內(nèi)輪藻均以各自的亞屬分類到一起，得到較好的進(jìn)化樹結(jié)構(gòu).

通過三基因聯(lián)合分析后，進(jìn)化樹各分支的支持率得到明顯的提高，BS值多為100.同時(shí)三基因聯(lián)合可以很好的解決輪藻科植物的分類問題，無論是族與屬的分類關(guān)系，還是屬內(nèi)易混種的分類，均以較高的支持率分開，得到較完美的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，分子分類結(jié)構(gòu)與形態(tài)學(xué)分類結(jié)構(gòu)基本一致，支持形態(tài)學(xué)分類結(jié)構(gòu)[2-4].

4 討 論

本研究的研究結(jié)果表明，從種內(nèi)、種間遺傳距離和進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來看，18S rDNA基因可將輪藻科植物分為輪藻族與麗藻族兩大支，與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)構(gòu)一致，較適用于輪藻科內(nèi)族與屬分類關(guān)系的研究.基于rbcL，atpB基因的分析后，進(jìn)化樹沒有形成明顯的兩大支，而是輪藻科各屬形成并系群，但利用rbcL與atpB基因分析后可以得到較好的鳥巢藻屬植物分類結(jié)構(gòu).三基因聯(lián)合后輪藻科植物得到較完美的進(jìn)化樹，族與屬的分子分類結(jié)構(gòu)與形態(tài)分類一致，同時(shí)可將易混淆的C.connivens與C.globularis區(qū)分開，從而解決輪藻屬植物分類混亂的問題.C.connivens與C.globularis兩者除分子分類上常存在混淆外，其外觀形態(tài)也有很多相似之處：莖中等粗壯，均為三列式皮層，原生列與次生列直徑相等；托葉雙輪，均退化為瘤狀突起；刺細(xì)胞單生，不發(fā)達(dá).唯一較為突出的差別是C.connivens為雌雄異株，而C.globularis為雌雄同株.Wood和Imahori認(rèn)為應(yīng)將C.connivens視為C.globularis的一個(gè)變種，命名為C.globularis f. connivens R. D. Wood，且在形態(tài)學(xué)分類上他們認(rèn)為雌雄是否異株不應(yīng)作為輪藻植物分類的重要標(biāo)準(zhǔn)[2].但本研究結(jié)果表明，C.connivens與C.globularis兩者雖易混淆，但經(jīng)過18S rDNA-rbcL-atpB三基因聯(lián)合后，可以將兩者分開，在分子水平上證明二者為不同種藻類，因此在形態(tài)學(xué)分類上應(yīng)將雌雄是否異株應(yīng)作為輪藻形態(tài)分類的重要標(biāo)準(zhǔn).

除此之外，在傳統(tǒng)輪藻植物分類中，Wood和Imahori認(rèn)為燈枝藻屬是輪藻屬與麗枝藻屬的姐妹群，同時(shí)擬麗藻屬作為輪藻屬與燈枝藻屬的姐妹群被分到較遠(yuǎn)的一支[2].Meiers認(rèn)為燈枝藻屬應(yīng)作為輪藻屬植物的一種[24].但在本研究中，18S rDNA，rbcL，atpB以及三基因聯(lián)合分析所得進(jìn)化樹結(jié)果均表明燈枝藻屬和擬麗藻屬的親緣關(guān)系最近，這與傳統(tǒng)輪藻植物分類系統(tǒng)較為不同.在Pérez等人的研究中也提出燈枝藻屬和擬麗藻屬可能具有較強(qiáng)的親緣關(guān)系[25]，同時(shí)兩者在外觀形態(tài)上也有一定的相似之處，均為托葉單輪、無皮層等[3].但由于樣本數(shù)量較少，兩者在分類上的確切問題還需進(jìn)一步深入研究.

在不同的環(huán)境下，輪藻植物的外觀形態(tài)可能受到光強(qiáng)、水溫、營養(yǎng)條件、水流速度以及生長在淡水域或淡咸水域等因素的影響，但具體的作用機(jī)制尚未明確[26-27]，因此僅靠形態(tài)學(xué)對(duì)輪藻植物進(jìn)行分類是不夠完善的，且不同輪藻之間有形態(tài)特征交錯(cuò)，導(dǎo)致分類界限不清.因此在今后的研究中，應(yīng)對(duì)輪藻植物分類開展更深入的研究，將傳統(tǒng)形態(tài)特征分類與分子分類相結(jié)合，這是今后國內(nèi)輪藻植物分類研究的方向.本研究對(duì)輪藻科植物的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了初步研究、作出了有益的嘗試，對(duì)今后輪藻分類系統(tǒng)的完善有一定借鑒意義，希望能夠引起更多學(xué)者對(duì)日漸稀少、有瀕臨滅絕危險(xiǎn)的輪藻植物研究的關(guān)注.