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新型殼寡糖γ-氨基丁酸衍生物的制備及其對小麥幼苗抗旱作用的研究

2020-06-03 09:21尹秀晶秦玉坤邢榮娥于春林李克成李鵬程
海洋科學 2020年5期
關鍵詞:氨基丁酸寡糖丙二醛

尹秀晶 , 劉 松 秦玉坤 邢榮娥 于春林 , 李克成 李鵬程

(1. 中國科學院海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學院 海洋大科學研究中心, 山東青島 266071; 4. 中國科學院大學, 北京 100049)

植物在生長周期內(nèi)總是會受到高溫、干旱、鹽漬和病蟲害等非生物和生物脅迫的影響。其中土地干旱或種植期間少雨是常見的非生物環(huán)境脅迫, 這極大的限制了世界各地部分地區(qū)作物產(chǎn)量。近年來,全球氣溫變暖、土壤沙漠化等環(huán)境問題日益突出, 我國干旱、半干旱地區(qū)占陸地面積的52.5%, 干旱缺水對我國農(nóng)業(yè)造成嚴重影響, 據(jù)中華人民共和國應急管理部發(fā)布的“2019年上半年全國自然災害基本情況”記載, 干旱災害在全國范圍內(nèi)共造成1 585.7公頃農(nóng)作物受災, 直接經(jīng)濟損失 71.2億元, 干旱脅迫已成為制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。

小麥不僅是世界上重要的糧食作物, 也是我國第二大糧食作物, 小麥的產(chǎn)量直接關系到人民的生活狀態(tài), 與國民經(jīng)濟發(fā)展緊密相關。在小麥的萌發(fā)、發(fā)育、生長期內(nèi)常常受到干旱、少雨等脅迫, 尤其在萌發(fā)期和幼苗期, 小麥的抵抗力較弱, 容易造成大面積的不出苗以及幼苗失水萎蔫、葉片衰退早、光合系統(tǒng)受到損傷等不良狀態(tài), 不利于小麥后期的生長和發(fā)育, 最終影響產(chǎn)量。

目前, 人們對于天然來源的植物生長調(diào)節(jié)劑關注密切, γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric amino acid, GABA)屬于非蛋白質(zhì)氨基酸, 植物如參屬、豆薯等的種子中含有GABA, 此外在一些植物的根莖中也都含有GABA。近年來發(fā)現(xiàn)外源GABA對植物在干旱[1-2]、鹽壓[3]、低溫[4]、低氧[4]等逆境抵抗中有重要作用[5]。殼聚糖是由來源于蝦、蟹等節(jié)肢動物外骨骼中的甲殼素脫乙酰得到, 據(jù)文獻報道,殼聚糖可以促進植物的生長[6]、提高植物抗旱、寒、鹽的能力[7], 作為潛在的作物抗逆劑、種子包衣劑、土壤改良劑、植物生長調(diào)節(jié)劑[8-9]。殼寡糖是殼聚糖經(jīng)過降解得到的聚合度在2~20之間的低聚糖[10], 與殼聚糖相比殼寡糖有更好的水溶性,應用范圍更廣, 殼聚糖與殼寡糖在植物抗非生物脅迫方面活性相差較大[11-12]。

但是這些活性物質(zhì)單獨使用往往作用效果有限,因此利用活性分子拼接原理, 將具有抗旱活性的殼寡糖、γ-氨基丁酸有機合成為一個分子, 設計合成具有更高抗旱活性的新型殼寡糖 γ-氨基丁酸衍生物,并研究衍生物處理對小麥出苗期干旱脅迫下生理生化指標的影響。

1 實驗部分

1.1 主要實驗藥品與試劑

殼寡糖(COS 1K, 相對分子量1 000 Da)購買于青島云宙生物科技有限公司; γ-氨基丁酸(G), 源葉生物, BR; 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC·HCl), Solarbio; N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS),源葉生物, BR; 嗎啉乙磺酸(MES), aladdin, 99%; 透析袋(Spectra/Por CE dialysis tubing, 截留分子量100-500 Da), 光譜醫(yī)藥; 小麥種子(長豐2112)。

1.2 主要儀器與設備

PHS-3C型pH計, 上海雷磁公司; HH-ZK4型恒溫水浴鍋, 鞏義市予華儀器有限責任公司; 超低溫冰箱, 北京天寒科技有限公司; 冷凍干燥機, 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司; 78-1 型磁力加熱攪拌器,常州國華電器有限公司; TU-1810 型紫外可見分光光度計, 北京普析通用儀器有限責任公司; iMark 酶標儀, 美國BIO-RAD 公司; SARTORIUS 電子天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司; 紅外光譜儀(Nicolet Magna-Avatar 360), Nicolet Magna 公司核磁共振光譜儀(JNM-ECP600NMR spectrometer), 日本JEOL 公司; CT18RT臺式高速冷凍離心機, 上海天美生化儀器設備工程有限公司; DDA-11A型電導率儀, 上海錦幻儀器儀表公司。

1.3 殼寡糖氨基丁酸衍生物的合成

參照前期研究的方法進行改進[13-14], γ-氨基丁酸(G)和殼寡糖(COS 1K)的摩爾比參照殼寡糖的聚合度設置為 7∶1, γ-氨基丁酸和 EDC·HCl、NHS的摩爾比為1∶3∶3。稱取0.360 9 g γ-氨基丁酸溶于50 mL 0.1 mol/L pH 5.5的MES緩沖液中, 加入2.012 9 g EDC·HCl作為縮合劑, 加入1.208 4 g NHS作為偶聯(lián)劑, 全部溶解后室溫攪拌 3小時對氨基丁酸的羧基進行活化, 然后向混合溶液中加入0.500 0 g的1 000 Da的殼寡糖, 2 000 r/min室溫攪拌24小時進行酰胺化反應, 反應結(jié)束后將反應液轉(zhuǎn)移到截留分子量為100~500 Da的透析袋中, 用去離子水透析4天, 然后將透析液冷凍干燥。合成路線如圖1所示。

圖1 殼寡糖γ-氨基丁酸衍生物的合成路線Fig. 1 Synthesis scheme of basic γ-aminobutyric acid-modified chitooligosaccharide derivatives

1.4 殼寡糖γ-氨基丁酸衍生物的抗干旱實驗

浸種: 選取品相均一的小麥種子約300粒, 室溫下用25 mL 500 mg/L的各處理組溶液對小麥種子進行浸種8小時處理, 浸種液編號和成分表如表1所示。

表1 浸種液組別和成分表Tab. 1 Numbers and ingredients used in liquid to soak seeds

催芽: 將浸種液倒掉后吸干種子上的水分, 擺放在鋪了四層紗布的大培養(yǎng)皿中, 紗布上加8 mL去離子水潤濕, 室溫下在暗處避光處理 24小時, 期間不斷補充水分保持紗布濕潤。

土壤處理: 將土壤和細沙高溫滅菌后, 按土∶沙=3∶1混合均勻, 設置干旱組土壤重量含水量為10%,即混合均勻的土壤中加入的水占總重的 10%, 正常組設置為30%。

播種: 本研究共六個處理組, ① c ontrol:正常組,土壤含水量為30%, 去離子水浸種; ②drought: 干旱組, 土壤含水量10%, 去離子水浸種; ③G + drought:土壤含水量10%, γ-氨基丁酸浸種; ④ COS 1K + drought:土壤含水量10%, 1 000 Da殼寡糖浸種; (1K⑤-G) +drought: 土壤含水量 10%, 殼寡糖 γ-氨基丁酸衍生物浸種。每盆播種發(fā)芽的小麥種子50粒, 播種于土壤下3 cm深。每天20: 00稱重補充水分。

培養(yǎng): 此實驗是在光照培養(yǎng)箱中進行, 光照設置情況: 光照周期14/10 h(晝/夜)、溫度25/20(℃晝/夜)、光照強度 60%/0(晝/夜)、相對濕度 70%。培養(yǎng)至兩葉一心后進行相關指標的測定。

1.4.1 抗干旱相關指標測定

將小麥的倒二葉剪下后用液氮研磨成粉保存于超低溫冰箱中備用。參考張憲政[15]的方法, 利用硫代巴比妥酸和三氯乙酸試劑進行試驗, 測定 450 nm、532 nm、600 nm波長的吸光度, 計算葉片中丙二醛的含量; 利用電導率儀測定細胞膜電解質(zhì)滲出率。參考鄒平[7]的方法, POD活性利用愈創(chuàng)木酚和過氧化氫測定在470 nm處每分鐘吸光度變化; CAT活性利用過氧化氫測定在 240 nm處每分鐘吸光度的變化。SOD的活性利用超氧化物歧化酶試劑盒測定。參考李和生[16]的方法, 提取色素試劑為 95%乙醇, 測定665 nm、649 nm、470 nm波長下的吸光度, 計算光合色素含量。參考張憲政[15]的方法, 利用濃硫酸和苯酚試劑進行試驗, 測定485 nm波長的吸光度, 計算葉片中可溶性糖的含量; 利用磺基水楊酸和酸性茚三酮試劑進行試驗, 測定520 nm波長的吸光度, 計算葉片中游離脯氨酸的含量。

1.4.2 統(tǒng)計分析

采用 Origin 8.5對數(shù)據(jù)進行處理, 采用 SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析和差異顯著性分析。柱狀圖中不同字母代表具有顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖氨基丁酸衍生物的結(jié)構表征

2.1.1 紅外光譜測定

殼寡糖(COS 1K)與 γ-氨基丁酸的衍生物(1K-G)的紅外光譜圖如圖2所示。從圖中可以看出, 殼寡糖原料中在 1 603 cm-1有一個-NH2的吸收峰, 對比殼寡糖(COS 1K)發(fā)現(xiàn), 衍生物(1K-G)在1 603 cm-1處的峰消失, 反而在1 630~1 640 cm-1以及1 540~1 555 cm-1之間出現(xiàn)兩個明顯的吸收峰, 經(jīng)查閱文獻[13, 17]可知, 1 630~1 640 cm-1是仲酰胺的酰胺Ⅰ帶吸收峰, 1 540~ 1 555 cm-1是酰胺Ⅱ帶的N-H變形振動吸收峰,說明衍生物中存在新的酰胺鍵, 證明 γ-氨基丁酸通過羧基與殼寡糖的氨基進行了酰化反應接枝到了殼寡糖上。

圖2 殼寡糖及γ-氨基丁酸修飾殼寡糖的紅外譜圖(FT-IR)Fig. 2 FT-IR spectra of chitooligosaccharide and γ-aminobutyric acid-modified chitooligosaccharide

2.1.2 核磁共振氫譜(1H-NMR)測定

殼寡糖(COS 1K)與 γ-氨基丁酸的衍生物(1K-G)的核磁共振氫譜(1H-NMR)如圖 3所示。根據(jù)文獻[13,18-19]記載, 在兩個譜圖中3.45 ppm~3.92 ppm為殼寡糖糖環(huán)中的H6, H4, H3, H5的重疊峰, 4.60 ppm為殼寡糖糖環(huán)上的H1的吸收峰, 3.00 ppm附近的峰為殼寡糖糖環(huán)上的H2的吸收峰, 1.78 ppm為殼寡糖上未脫乙?;募谆|(zhì)子吸收峰。γ-氨基丁酸修飾的殼寡糖的產(chǎn)物(1K-G)除保持殼寡糖(COS 1K)的各質(zhì)子峰之外, 在3.27 ppm, 2.27 ppm, 1.61 ppm處多了三個質(zhì)子的吸收峰, 經(jīng)研究[13,18], 這三個質(zhì)子峰分別對應γ-氨基丁酸接枝到殼寡糖上之后的H9, H7, H8的吸收峰。氨基丁酸成功接枝到殼寡糖上。

圖3 殼寡糖及γ-氨基丁酸修飾殼寡糖衍生物的核磁共振氫譜(1H-NMR)Fig. 3 1H-NMR spectra of chitooligosaccharide and γ-aminobutyric acid-modified chitooligosaccharide

2.1.3 核磁共振碳譜(13C-NMR)測定

殼寡糖(COS 1K)與殼寡糖 γ-氨基丁酸衍生物(1K-G)的核磁共振氫譜(1H-NMR)如圖 4所示。根據(jù)文獻[13-14, 20]記載, 在兩個譜圖中180.00 ppm為殼寡糖未脫乙?;恤驶?-C=O)的吸收峰, 97.86~98.76 ppm、76.50 ppm、74.60 ppm、70.30~71.20 ppm、59.85 ppm、56.13 ppm分別為殼寡糖糖環(huán)上的C1, C4,C5, C3, C6, C2的吸收峰, 22.83 ppm為殼寡糖上未脫乙?;募谆?CH3)的吸收峰。γ-氨基丁酸修飾的殼寡糖衍生物(1K-G)除保持殼寡糖的吸收峰之外, 在173.70 ppm、38.00~39.00 ppm、35.00 ppm、25.00 ppm多了四個位置的吸收峰, 經(jīng)研究[14,21], 這四個位置的吸收峰分別為γ-氨基丁酸接枝到殼寡糖上新形成的酰胺鍵的羰基碳(C=O), 以及γ-氨基丁酸上的亞甲基碳(C9, C7, C8), 核磁碳譜上每一個峰對應一個碳原子, 分析譜圖發(fā)現(xiàn)173.70 ppm、38.00~39.00 ppm、35.00 ppm、25.00 ppm四個位置都不止一個峰, 通過合成實驗的原理: 氨基丁酸的羧基經(jīng)過縮合劑和偶聯(lián)劑活化后與殼寡糖中的氨基進行?;磻纬甚0锋I可知, 由于 γ-氨基丁酸中也存在氨基基團, 所以游離 γ-氨基丁酸中活化了的羧基也會和接枝到殼寡糖上的氨基丁酸的氨基進行反應, 所以合成的衍生物中部分為多聚氨基丁酸取代, 圖 1所示的衍生物中 n1為 2, 即衍生物中部分取代基團為兩個氨基丁酸鏈, 部分取代基團為一個氨基丁酸。γ-氨基丁酸成功接枝到殼寡糖上。

圖 4 殼寡糖及 γ-氨基丁酸修飾殼寡糖的核磁共振碳譜(13C-NMR)Fig. 4 13C-NMR spectra of chitooligosaccharide and γ-aminobutyric acid-modified chitooligosaccharide

2.1.4 衍生物取代度計算

根據(jù)核磁共振氫譜計算衍生物的取代度結(jié)果如表2所示。

表2 殼寡糖氨基丁酸衍生物的取代度Tab. 2 Substitution of aminobutyric acid-modified chitooligosaccharide

2.2 殼寡糖氨基丁酸衍生物的抗干旱實驗

2.2.1 殼寡糖及其衍生物對小麥幼苗丙二醛含量的影響

干旱脅迫會促使植物產(chǎn)生大量的活性氧, 加劇脂質(zhì)過氧化程度, 而丙二醛作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一, 其含量代表膜過氧化程度[7]。干旱脅迫下殼寡糖、γ-氨基丁酸及其衍生物等對小麥幼苗丙二醛含量的影響如圖5所示, 干旱脅迫下(drought)小麥幼苗中的丙二醛含量較正常對照組(control)高 52.9% (P<0.05,下同), 而經(jīng)過 γ-氨基丁酸、殼寡糖、衍生物等浸種處理后都明顯降低了小麥幼苗葉片中丙二醛含量,分別較干旱脅迫組低 4.2%、17.4%、12.6%, 三個處理組之間的差異均顯著(P<0.05)。綜上, COS 1K組、1K-G組作用效果好于 G組。研究表明, 殼寡糖 γ-氨基丁酸衍生物可以顯著降低丙二醛含量, 緩解干旱脅迫對小麥幼苗的活性氧損傷。

圖5 殼寡糖及其衍生物處理對干旱脅迫下的小麥幼苗葉片丙二醛含量的影響Fig. 5 Effect of chitooligosaccharide and derivatives on malonaldehyde (MDA) of wheat leaves under drought stress

2.2.2 殼寡糖及其衍生物對小麥幼苗細胞膜透性的影響

干旱脅迫會造成大量活性氧的產(chǎn)生, 而這些過量的活性氧會進一步損傷細胞膜, 從而造成細胞膜透性增加[22], 細胞內(nèi)的電解質(zhì)大量外滲從而導致電導率增加, 所以小麥幼苗細胞膜透性通常用相對電導率表示。殼寡糖及其衍生物對小麥幼苗細胞膜透性的影響如圖6所示, 干旱脅迫下(drought)小麥細胞膜透性較正常對照組(control)高 41.8%(P<0.05), 而小麥種子經(jīng)過不同物質(zhì)浸種處理后小麥幼苗的細胞膜透性會顯著下降。結(jié)果如圖所示, 各處理除了COS 1K組之外與干旱組之間存在顯著性差異, 細胞膜透性分別較干旱組低 11.2%、24.5%(P<0.05), 1K-G處理組甚至降低到正常組水平以下??芍? 殼寡糖 γ-氨基丁酸衍生物可以緩解干旱脅迫對細胞膜的損傷程度, 作用效果明顯好于其他處理組。

圖6 殼寡糖及其衍生物處理對干旱脅迫下的小麥幼苗葉片細胞膜透性的影響Fig. 6 Effect of chitooligosaccharide and derivatives on cell membrane permeability of wheat leaves under drought stress

2.2.3 殼寡糖及其衍生物對小麥抗氧化酶活性的影響

過量活性氧的清除主要通過酶促清除系統(tǒng)和非酶促清除系統(tǒng)[16,23], 其中酶促清除系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等; 非酶促清除系統(tǒng)包括抗壞血酸、谷胱甘肽、維生素E、甘露醇等。本研究測定了超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性。殼寡糖及其衍生物對小麥幼苗抗氧化酶的影響如圖 7所示, 干旱脅迫下(drought)SOD和POD的活性顯著上升, 分別較正常組(control)高 23.1%、96.9%(P<0.05), 干旱脅迫下CAT的活性較正常組沒有顯著變化。

各處理組對小麥葉片中 SOD活性的影響分析:經(jīng)過G、COS 1K、1K-G處理后, SOD的活性與正常組有顯著性差異(P<0.05), 活性均明顯提高, 1K-G和COS 1K效果強于G, 但均小于干旱脅迫組; 各處理組對小麥葉片中CAT活性的影響分析: 經(jīng)過G、COS 1K處理后, CAT活性與正常組和干旱脅迫組沒有明顯差異(P>0.05), 1K-G處理后與正常組有顯著性差異, CAT活性提高 36.7%(P<0.05), 與干旱脅迫組沒有明顯差異; 各處理組對小麥葉片中POD活性的影響分析: 經(jīng)過G、1K-G處理后, POD活性較正常組分別高61.2%、48.8%(P<0.05), 經(jīng)過COS 1K處理后,POD活性與正常組無明顯差異。

圖7 殼寡糖及其衍生物處理對干旱脅迫下的小麥幼苗葉片超氧化物歧化酶(a)、過氧化氫酶(b)、過氧化物酶(c)的影響Fig. 7 Effect of chitooligosaccharide and derivatives on superoxide dismutase (a), catalase (b), and peroxidase (c) of wheat leaves under drought stress

2.2.4 殼寡糖及其衍生物對小麥光合色素含量的影響

光合色素的含量會因外界環(huán)境變化而變化, 與植物進行光合作用的強度有關。殼寡糖及其衍生物對小麥葉片中光合色素含量的影響如表 3所示, 干旱脅迫下(drought)小麥葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別較正常對照組(control)高 5.6%、11.1%、6.0%(P<0.05), 而葉綠素a /葉綠素b較正常對照組低5.4%(P<0.05)。

各處理組對小麥葉片中葉綠素 a的影響分析:干旱脅迫增加了葉綠素 a的含量, 而經(jīng)過不同物質(zhì)處理后葉片中葉綠素 a的含量較干旱脅迫(drought)組低, 逐漸接近正常組(control), G、COS 1K、1K-G處理組葉綠素a含量分別較干旱組低2.5%、1.5%、4.5%(P<0.05); 各處理組對小麥葉片中葉綠素b的影響分析: 干旱脅迫增加了葉綠素b的含量, 而經(jīng)過不同物質(zhì)處理后葉片中葉綠素 b的含量較干旱脅迫(drought)組低, 逐漸接近正常組(control), G、COS 1K、1K-G處理組葉綠素 b含量分別較干旱組低4.4%、1.9%、6.3% (P<0.05); 各處理組對小麥葉片中葉綠素a /葉綠素b的影響分析: 干旱脅迫降低了葉綠素a /葉綠素b的值, 而經(jīng)過不同物質(zhì)處理后葉片中葉綠素a /葉綠素b的值較干旱脅迫(drought)組高,逐漸接近正常組(control), G、COS 1K、1K-G處理組葉綠素a /葉綠素b的值分別較干旱組高2.5%、2.5%、1.7%(P<0.05)。

2.2.5 殼寡糖及其衍生物對小麥葉片中脯氨酸和可溶性糖的影響

脯氨酸和可溶性糖可以作為植物中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)存在, 調(diào)節(jié)細胞滲透勢進而緩解干旱脅迫。圖8顯示的是干旱脅迫下殼寡糖及其衍生物處理的小麥葉片脯氨酸和可溶性糖的含量, 子圖 a是對脯氨酸的含量的影響, 子圖b是對可溶性糖含量的影響。干旱脅迫(drought)下脯氨酸含量較正常對照組(control)高368.4%(P<0.05), 干旱脅迫下(drought)可溶性糖含量較正常對照組(control)低46.8%。從圖7中子圖a、b可知, 不同物質(zhì)浸種處理對于小麥葉片中兩種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響不同, 經(jīng)過COS 1K處理后脯氨酸含量較干旱組增加 15.3%(P<0.05), 而經(jīng)過 G和 1K-G處理后脯氨酸含量較干旱組稍低分別低6.3%、10.2%,但是較正常組提高338.8%、320.7%; 經(jīng)過G、COS 1K處理后可溶性糖的含量較干旱組增加 4.3%、19.8%(P>0.05), 經(jīng)過 1K-G處理后可溶性糖的含量較干旱組增加 54.3%(P<0.05)??芍? 殼寡糖 γ-氨基丁酸衍生物對可溶性糖含量的影響大于對脯氨酸含量的影響, 其中殼寡糖衍生物提高小麥葉片可溶性糖含量的效果較其他處理組顯著。

表3 殼寡糖及其衍生物處理對干旱脅迫下的小麥幼苗葉片光合色素含量的影響Tab. 3 Effect of chitooligosaccharide and derivatives on photosynthetic pigment content of wheat leaves under drought stress

圖8 殼寡糖及其衍生物處理對干旱脅迫下的小麥幼苗葉片脯氨酸(a)、可溶性糖(b)含量的影響Fig. 8 Effect of chitooligosaccharide and derivatives on proline content (a) and soluble sugar content (b) of wheat leaves under drought stress

3 討論

本研究合成的新型殼寡糖 γ-氨基丁酸衍生物對小麥浸種可以提高小麥對出苗期干旱的抵抗能力,且作用效果較殼寡糖和γ-氨基丁酸顯著。

植物體內(nèi)存在天然的清除活性氧的系統(tǒng), 如一些抗氧化酶SOD、CAT等, 使活性氧維持動態(tài)平衡,但是當植物遭受逆境時活性氧代謝就會失調(diào), 產(chǎn)生加快而清除降低, 致使大量活性氧的積累[16], 過量的自由基會對植物造成損傷, 損傷細胞結(jié)構和功能,抑制植物生長, 誘發(fā)膜脂質(zhì)過氧化, 產(chǎn)生大量的丙二醛, 造成質(zhì)膜流動性降低、透性增加, 破壞植物內(nèi)的蛋白質(zhì)(酶)、核酸等生物大分子[15]。

本研究結(jié)果顯示干旱增加了丙二醛的含量(圖5)和細胞膜透性(圖 6), 經(jīng)過衍生物等物質(zhì)處理后可以顯著降低丙二醛含量和細胞膜透性, 衍生物處理的細胞膜透性顯著低于殼寡糖和氨基丁酸處理, 而丙二醛含量顯著低于氨基丁酸處理、高于殼寡糖處理,實驗證明1 000 Da殼寡糖可以明顯提高多種抗氧化酶基因的表達[24], 衍生物處理的丙二醛含量高于殼寡糖處理可能是因為衍生物對不同種抗氧化酶活性的影響不同, 總體上清除活性氧的能力不如殼寡糖,導致丙二醛含量較高, 具體原因需要實驗驗證。理論上來說, 部分外源物的施用會增加抗氧化酶的活性清除植物體內(nèi)因外界脅迫而產(chǎn)生的過量的自由基,降低丙二醛含量和質(zhì)膜透性, 緩解對細胞膜的損傷。例如外源的 γ-氨基丁酸增加了干旱脅迫下甜瓜幼苗的抗氧化酶 SOD、CAT等活性, 降低了丙二醛含量和質(zhì)膜傷害度[4], 降低了鹽脅迫下玉米幼苗的超氧陰離子和丙二醛含量[25]。又如硫酸鹽殼寡糖[24]可以通過增加超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶活性, 降低丙二醛含量。這些文獻都證實了這一觀點。但是本研究測定了三種抗氧化酶活性(圖 7), 結(jié)果顯示除 CAT外, SOD和POD的活性與干旱組相比不同物質(zhì)處理后并沒有顯著提高。考慮可能是由于本研究從播種開始就進行了干旱脅迫處理, 在整個生長到兩葉一心期的時間都處于脅迫環(huán)境, 處理組植株體內(nèi)的活性氧逐漸趨于平衡, 而未經(jīng)處理的植株活性氧繼續(xù)積累[26]從而促進抗氧化酶活性增加。鄒平[24]研究發(fā)現(xiàn)不同分子量的殼聚糖處理會顯著增加鹽脅迫下小麥葉片的SOD、CAT、POD的活性, 且1 000 Da的殼寡糖有最顯著的影響。李艷[27]發(fā)現(xiàn)低聚殼寡糖可以提高干旱脅迫下油菜葉片中的 SOD、POD活性。因此, 丙二醛含量降低以及細胞膜透性的降低是活性氧清除系統(tǒng)累積清除后的結(jié)果。這兩個實例均是在植株生長到穩(wěn)定的狀態(tài)后進行短期的脅迫處理, 目前猜測抗氧化酶活性變化可能和本研究的測定時間有關,具體的原因有待探究。

光合作用中重要的一個階段——光反應的發(fā)生需要葉綠體中的光合色素參加, 將光能轉(zhuǎn)化成化學能。研究發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)的鹽脅迫[24]和干旱脅迫[26]可以顯著降低植物葉片中的葉綠素含量, 而經(jīng)過殼寡糖[28]、水楊酸[26]、脫落酸[26]和多胺[29]等處理后光合色素含量顯著增加。但是本研究出現(xiàn)了不一樣的結(jié)果, 干旱脅迫一段時間后增加了葉綠素 a和葉綠素b的含量(表3), 降低了葉綠素a /葉綠素b的值, 可能的原因是出苗期的持續(xù)干旱使得葉片含水量低從而造成葉綠素含量濃縮而含量升高。

脯氨酸和可溶性糖屬于植物內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),據(jù)文獻記載滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)還包括糖醇、甜菜堿、有機酸、鈣離子、鉀離子、氯離子等[30], 這些溶質(zhì)的增加可以提高細胞對外界水分吸收的膨壓, 增強植物對水分的主動吸收能力, 增加植物水分利用率, 從而最大限度的減少干旱的有害影響[30]。當植物處于干旱環(huán)境下, 脯氨酸和可溶性糖的增加[30-31]可以緩解脅迫對植物的影響。本研究測定了脯氨酸(圖 8a)和可溶性糖(圖 8b)的含量, 結(jié)果顯示脯氨酸在正常狀態(tài)下積累特別少, 可溶性糖在正常情況下積累量很大, 經(jīng)過干旱脅迫處理后脯氨酸含量急劇上升,可溶性糖含量降低。而經(jīng)過不同物質(zhì)處理后發(fā)現(xiàn):COS 1K可以顯著增加脯氨酸含量, 1K-G可以顯著增加可溶性糖的含量。由此可見不同物質(zhì)對脯氨酸和可溶性糖的作用效果不一致, 與多胺及其合成抑制劑[29]對干旱脅迫下幼苗脯氨酸和可溶性糖的含量影響結(jié)果類似, 而本研究中的殼寡糖γ-氨基丁酸衍生物對干旱脅迫下小麥幼苗可溶性糖的含量影響更大。

本研究的重點放在干旱脅迫持續(xù)到小麥出苗后一個月左右的時間點的生理生化指標變化, 所以相關數(shù)據(jù)僅代表出苗期的持續(xù)干旱對小麥幼苗期的影響, 只是從幾個指標簡單的評價了各種物質(zhì)的抗旱活性與小麥整個生長期還是會有一定的差別, 所以要想確定對小麥整個生育期的影響還需進行大田試驗。

4 結(jié)論

利用酰胺化反應將具有抗旱活性的殼寡糖、γ-氨基丁酸有機合成為一個分子, 以期制備出具有更高抗旱活性的新型化合物, 并通過FT-IR、1H-NMR、13C-NMR證明, 成功地合成了新型殼寡糖 γ-氨基丁酸衍生物, 并且利用衍生物和殼寡糖、氨基丁酸對小麥種子浸種處理后評價抗旱作用, 結(jié)果證明新合成的衍生物可以降低丙二醛的含量, 減少其對細胞膜的傷害, 增加可溶性糖的含量提高植物對土壤中少量水分的吸收緩解出苗期持續(xù)干旱脅迫對小麥幼苗生長的抑制作用。本研究成功合成了具有較強抗旱作用的新型殼寡糖 γ-氨基丁酸衍生物, 為新型植物抗逆制劑開發(fā)提供了思路。

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