張睿，周浩鑾，張雪娟，胡軍華，王冠林，陳茜，譚文

(1．廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006； 2．中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

支氣管哮喘是常見的呼吸疾病，具有氣道高反應(yīng)性、炎癥、氣流受限、喘息、氣促、咳嗽等癥狀[1]。班布特羅(Bambuterol，BMB)是一種長效選擇性β2受體激動(dòng)劑，口服后在體內(nèi)經(jīng)血漿水解為特布他林而發(fā)揮支氣管擴(kuò)張作用，其半衰期較長(約13 h)[2]，藥效持久(約24 h)，尤其適用于支氣管哮喘的治療[3-5]。班布特羅具有消旋體、右旋體(S型)及左旋體(R型)3種異構(gòu)體。本課題組前期研究表明，左旋班布特羅(R-BMB)相對(duì)其他2種異構(gòu)體，具有更強(qiáng)及更持久地氣道舒張作用，同時(shí)可有效防止氣道過敏性炎癥的發(fā)生。班布特羅右旋體能增加豚鼠的氣道反應(yīng)，而消旋體及左旋體則無此現(xiàn)象[6-7]。

班布特羅目前臨床給藥途徑通常為口服，具有生物利用度低、用藥量大、副作用高、起效緩慢等缺點(diǎn)。肺部吸入制劑是將藥物以氣溶膠形式遞送至肺部或呼吸道發(fā)揮局部或全身作用的制劑[8]，具有起效快、靶向、無首過效應(yīng)等優(yōu)勢(shì)[9]。目前，肺部吸入制劑主要包括吸入粉霧劑、吸入氣霧劑及吸入水霧劑3種常見的制劑形式[10]。相比其他2種吸入制劑，吸入水霧劑具有使用方便、噴霧量可調(diào)整及患者依從性好等優(yōu)點(diǎn)。噴射型霧化裝置相比較超聲霧化及振動(dòng)篩孔霧化裝置具有霧化粒徑均一等優(yōu)勢(shì)，已廣泛使用于臨床治療[11]。

粒徑大小及分布是吸入制劑關(guān)鍵指標(biāo)，直接影響吸入藥物在肺部的有效沉積率。2015年版《中國藥典》規(guī)定粒徑大小須控制在10 μm以內(nèi)，大多數(shù)小于5 μm[12]。顆粒大于5 μm，沉積于上呼吸道及口咽部。粒徑小于1 μm，則易隨呼氣呼出體外。此外，影響水霧劑粒徑大小及分布因素很多，如溫度、呼吸模式、濕度及表面張力等[11,13]。

基于吸入水霧劑及BMB左旋體的優(yōu)勢(shì)，本研究以甘油及丙二醇為輔料，以正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)9個(gè)處方，測(cè)試各處方pH值、滲透壓、表面張力及粒徑大小及分布，并運(yùn)用方差分析法分析粒徑測(cè)試結(jié)果，進(jìn)而探討丙二醇及甘油對(duì)霧化粒徑大小及分布的影響，篩選出肺部有效沉積率較優(yōu)的處方，為R-BMB吸入水霧劑的開發(fā)提供參考。

1 試劑與儀器

R-BMB(東莞市凱法生物醫(yī)藥有限公司,批號(hào)：20180705，純度≥99%)；1，2-丙二醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20171008，純度≥99%)；甘油(天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20180601，純度≥99%)；生理鹽水(河南雙鶴華利藥業(yè)有限公司，批號(hào)：19081706F)；甲醇(美國Fisher，批號(hào)：178507，HPLC級(jí))；乙腈(美國Fisher，批號(hào)：178497，HPLC級(jí))；磷酸(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20130411，純度≥85%)；NaH2PO3(美國Sigma，批號(hào)：SLBS6288，純度≥99%)；庚烷磺酸鈉(美國Fisher，批號(hào)：1730886，HPLC級(jí))。

Model 5600露點(diǎn)滲透儀(美國WESCOR)；BZY-1全自動(dòng)表面張力儀(上海平軒科學(xué)儀器有限公司)；Seven compact pH離子計(jì)(瑞士Mettle Rtoledo)；Waters e2695高效液相色譜；NGI藥用粒子撞擊器(美國Copley)；新帕泰克HELOS激光粒度儀(德國新帕泰克)；Pari?LC sprint噴射霧化器(德國百瑞)；Pari?BOY SX空氣壓縮泵(德國百瑞)。

2 方法

2.1 處方設(shè)計(jì)及制備方法

目前，市售BMB劑量為每天20 mg[14]，綜合吸入制劑起效優(yōu)勢(shì)及吸入水霧劑霧化時(shí)損耗情況，本研究R-BMB劑量設(shè)為2.5 mg/mL，霧化2 min，總量為5 mg。CFDA批準(zhǔn)的吸入輔料甘油及丙二醇的限度分別為7.30%和25.00%[15]。在限度范圍內(nèi)選取3個(gè)跨度值：甘油0%、1%及2%，丙二醇0%、8%和15%。以此選取正交試驗(yàn)因素和水平，見表1。正交試驗(yàn)處方設(shè)計(jì)見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

取R-BMB 25 mg置于10 mL棕色容量瓶，按表2加入相應(yīng)的甘油及丙二醇，用生理鹽水定容，得到R-BMB溶液。BMB在水中溶解度為33 mg/mL，所有處方藥物濃度為2.5 mg/mL，不同實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目前重新配制溶液。

表2 正交試驗(yàn)處方設(shè)計(jì)Table 2 Prescription design of orthogonal test

2.2 HPLC法測(cè)定R-BMB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[16]

2.2.1R-BMB對(duì)照品溶液的制備 精密稱取R-BMB原料藥25 mg，放于10 mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相定容，配制成2.5 mg/mL的工作液，將工作液逐級(jí)稀釋，得到500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906、1.953、0.488 μg/mL10個(gè)等梯度的對(duì)照品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長：220 nm；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液-甲醇-乙腈(體積比500∶309∶100，加入0.12%的庚烷磺酸鈉)。R-BMB的HPLC色譜圖見圖1。可見，R-BMB保留時(shí)間為6.2 min，主峰分離良好，陰性溶液色譜圖對(duì)主峰測(cè)試無影響。

0.250.200.150.100.050.00AU2.52.01.51.00.50.0?10-3AB02468100246810t/mint/min

A.R-BMB溶液； B.陰性溶液。

圖1R-BMB及陰性溶液HPLC色譜圖

Figure1HPLC chromatograms ofR-BMB and reference solution

2.3 理化性質(zhì)測(cè)試

2.4 粒徑測(cè)試

2.4.2 碰撞法測(cè)定粒徑 根據(jù)2015年版《中國藥典》吸入制劑微細(xì)粒子空氣動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定法[12]，采用NGI進(jìn)行空氣動(dòng)力學(xué)粒徑測(cè)試，將NGI各收集盤的含量計(jì)算結(jié)果通過軟件(CITDAS，copley_V310，美國Copley)分析，可得到9個(gè)處方霧化吸入溶液的質(zhì)量中位直徑(mass median aerodynamic diameter，MMAD)和細(xì)顆粒百分比(fine particle fraction，F(xiàn)PF)參數(shù)。每個(gè)處方重復(fù)測(cè)試3次。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)方法

肺部有效沉積率是吸入制劑的關(guān)鍵指標(biāo)，而d0.5及MMAD直接決定肺部有效沉積率。正交試驗(yàn)中方差分析能精確估計(jì)各因素的影響程度，應(yīng)用廣泛。本研究選用方差分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果中d0.5及MMAD進(jìn)行分析，計(jì)算得出F值，篩選R-BMB吸入水霧劑中的丙二醇及甘油最優(yōu)配比[20]。

3 結(jié)果

3.1 理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

9個(gè)處方的pH值、滲透壓和表面張力測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 9個(gè)處方的理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 3 Physical and chemical properties of nine prescriptions

從表3可見：在丙二醇等量的條件下，隨著甘油的增加或減少，pH值沒有明顯變化，可知甘油對(duì)pH值的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在甘油等量的條件下，隨著丙二醇用量的增加，pH值有降低趨勢(shì)，可知丙二醇對(duì)pH值的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；所有處方pH值均在3～8.5范圍內(nèi)，符合《中國藥典》規(guī)定[12]。在丙二醇等量的條件下，隨著甘油及丙二醇量的增加，滲透壓值有升高趨勢(shì)，可知甘油及丙二醇對(duì)滲透壓的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在丙二醇等量的條件下，隨著甘油的增加或減少，表面張力值均沒有明顯變化，可知甘油對(duì)表面張力的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在甘油等量的條件下，隨著丙二醇用量的減少表面張力有升高趨勢(shì)，可知丙二醇對(duì)表面張力的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.2 粒徑測(cè)試

3.2.1 激光衍射法測(cè)試粒徑結(jié)果 從表4可見，R-BMB霧化吸入溶液9個(gè)處方的粒徑分布皆符合吸入水霧劑的處方要求，其中處方F3、F4、F6、F7及F8測(cè)試結(jié)果d0.5在2.553 μm左右[11]，具有較好的肺部沉積率；且隨著丙二醇用量的增加，d0.5有減小的趨勢(shì)；當(dāng)丙二醇為0%和8%時(shí)，隨著甘油的增加d0.5同樣有減小的趨勢(shì)，而丙二醇為15%時(shí)，隨著甘油的增加d0.5有增加的趨勢(shì)。所有處方Span值均較小，表明此水霧劑粒徑分布相對(duì)均一。

表4 9個(gè)處方的激光衍射法測(cè)定粒徑結(jié)果Table 4 Determination of particle size by laser diffraction in nine prescriptions

3.2.2 碰撞法測(cè)定粒徑結(jié)果 由從表5可見，所有處方的FPF值和MMAD值皆滿足吸入水霧劑藥物顆粒粒徑要求[12]，表明其肺部有效沉積率較高。處方F3、F5及F8的MMAD小于4 μm，F(xiàn)PF在60%以上。當(dāng)甘油的量為0%和2%時(shí)，隨著丙二醇量的增加，MMAD有減小的趨勢(shì)，而甘油的量為1%時(shí)，隨著丙二醇量的增加，MMAD有增加的趨勢(shì)。當(dāng)丙二醇為0%和8%時(shí)，隨著甘油量的增加，MMAD先減小后增加，而當(dāng)丙二醇為15%時(shí)，隨著甘油量的增加，MMAD先增加后減小。

從圖2各處方藥物在NGI各盤的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果可見，F(xiàn)3、F4、F6、F7及F8在Stage4～Stage6級(jí)段(其截留粒徑1.36～3.30 μm)[11]藥物沉積較多，表明隨著甘油和丙二醇的加入，有助于藥物的肺部遞送及沉積，丙二醇的影響程度較大。

3.3 正交試驗(yàn)分析結(jié)果

采用L9(34)正交表，方差分析法分析d0.5及MMAD數(shù)值，結(jié)果見表6及表7。

表5 9個(gè)處方的FPF和MMAD測(cè)定結(jié)果Table 5 FPF and MMAD of nine prescriptions

4530150質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%F1F2F3F4F5F6F7F8F9Stage1Stag2Stage3Stage4Stage5Stage6Stage7裝置喉MOC

表7 d0.5及MMAD方差分析表Table 7 Variance analysis of d0.5 and MMAD

在1～5 μm范圍內(nèi)，d0.5及MMAD越小，沉積效率越高[11]。表6的d0.5方差分析結(jié)果表明最優(yōu)處方為A3B3(F8)，即2%甘油和15%丙二醇；而MMAD方差分析結(jié)果表明最優(yōu)處方為A2B3(F4)，即1%甘油和15%丙二醇。方差分析不僅可以看因素影響的主次，同時(shí)可以看出其影響是否顯著，從2個(gè)指標(biāo)分析結(jié)果的F值可見，丙二醇對(duì)試驗(yàn)的影響明顯大于甘油，但沒有達(dá)到顯著程度。

將處方F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7及F9與處方F8(2%甘油和15%丙二醇)的d0.5及MMAD進(jìn)行處方間單獨(dú)顯著性分析，結(jié)果見表8?？梢?，F(xiàn)8處方與其余處方的d0.5及MMAD的差異隨著甘油及丙二醇的添加，有由極顯著性到無顯著性的趨勢(shì)。

注：以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證上述方差分析得出輔料配比的可行性，以處方4(1%甘油和15%丙二醇)制備3批樣品，并進(jìn)行吸入水霧劑指標(biāo)驗(yàn)證，結(jié)果見表9?？梢姡幏礁黜?xiàng)指標(biāo)均符合《中國藥典》要求。肺部有效遞送效率是吸入制劑的關(guān)鍵指標(biāo)。在d0.5和MMAD方面，由表6可知F4處方較其他處方有較低的數(shù)值，表明它有更高的肺部有效遞送效率。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 9 Verification of experimental results

4 討論

本文結(jié)果顯示，甘油對(duì)pH值無顯著影響，而丙二醇則有極顯著影響，可能是由于甘油是三元醇，丙二醇是二元醇，在自身及促進(jìn)溶液中離子電離程度不同，溶液中的離子主要是R-BMB離子、氫離子、氫氧根離子及甘油和丙二醇電離的離子，處方中丙二醇加入量跨度較大，可能引起了R-BMB、甘油、水及其本身的電離動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)了氫離子的產(chǎn)生，從而降低了溶液的pH值。滲透壓與溶液濃度有關(guān)，甘油與丙二醇的添加均會(huì)改變?nèi)芤簼舛?，所以二者?duì)滲透壓均有極顯著影響。對(duì)于表面張力而言，甘油對(duì)其影響不顯著，而丙二醇則有顯著影響，可能是因?yàn)楸际浅Ｒ姷谋砻婊钚詣?，也可能跟甘油和丙二醇添加量有關(guān)。

綜合pH、滲透壓、表面張力與d0.5及MMAD結(jié)果，總體上隨著甘油和丙二醇的增加，d0.5與MMAD有下降趨勢(shì)，從而使得藥物有較好的肺部沉積率。激光衍射法測(cè)試粒徑結(jié)果，當(dāng)丙二醇的量為不同值時(shí)，隨著甘油的增加d0.5有減小或者增加的趨勢(shì)。碰撞法測(cè)試粒徑結(jié)果，當(dāng)甘油的量為不同值時(shí)，隨著丙二醇量的增加，MMAD有減小或增加的趨勢(shì)。當(dāng)丙二醇的量為不同值時(shí)，隨著甘油量的增加，MMAD先減小后增加或者先增加后減小。此現(xiàn)象說明不同原理的粒徑測(cè)試方法之間存在一定的差異性，同時(shí)溶液性質(zhì)能顯著影響吸入水霧劑的粒徑大小，從而影響其肺部有效沉積率。此結(jié)果與McCallion等[13]研究結(jié)果類似。從本研究結(jié)果來看，甘油及丙二醇加入量的不同能使pH、滲透壓及表面張力發(fā)生改變，從而影響吸入水霧劑的粒徑大小及分布，最終影響肺部有效沉積率。但溶液體系復(fù)雜，理化性質(zhì)眾多，這也是粒徑大小沒有和甘油及丙二醇加入的量成線性的原因。除pH、滲透壓及表面張力3種理化性質(zhì)以外的其他因素也需要考慮，本團(tuán)隊(duì)后續(xù)將進(jìn)一步研究。

粒徑大小及分布影響因素較多，除藥物溶液本身理化性質(zhì)以外，霧化環(huán)境[11]等也是重要影響因素。本研究正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果表明，處方A3B3(2%甘油和15%丙二醇)和A2B3(1%甘油和15%丙二醇)為較優(yōu)處方，由于碰撞法為吸入制劑粒徑測(cè)試的“金標(biāo)法”[11]，且根據(jù)輔料最低用量原則，推薦處方4(1%甘油和15%丙二醇)為R-BMB吸入水霧劑處方。從表7方差分析結(jié)果可見，甘油及丙二醇均無表現(xiàn)出顯著影響，但表8處方間單獨(dú)顯著性分析結(jié)果顯示隨著甘油及丙二醇的加入，影響呈顯著性上升趨勢(shì)，其中丙二醇更為明顯。這可能與輔料選用的添加量較少有關(guān)，此外，甘油和丙二醇之間的相互干擾也可能引發(fā)這種差異。

吸入水霧劑霧化器主要有噴射霧化器、超聲霧化器及振動(dòng)篩孔霧化器3種類型，而噴射型霧化器較其他2種具有使用簡(jiǎn)便、霧化出的氣溶膠粒徑大小均一穩(wěn)定、肺部有效沉積率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)院和家庭[11]。因此，本研究中使用的霧化器為噴射型霧化器，但吸入制劑的霧化粒徑大小除與處方工藝有關(guān)之外，還在很大程度上取決于霧化裝置，本研究局限于噴射型霧化器，后續(xù)研究需增加對(duì)不同類型裝置影響的考察。