王鴻森，賈曉凡，徐彥浩，常晟，李麗，趙靜，郝吉福

[1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)藥學(xué)院，山東 泰安 271016； 2.山東省泰山療養(yǎng)院(山東省泰山醫(yī)院)，山東 泰安 271016]

根據(jù)生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)，超過40%的已上市產(chǎn)品和約90%的新候選化合物屬于水溶性較差的難溶性化合物[1]，而藥物溶出是吸收的必要前提，如何改善難溶性藥物溶解度成為藥劑學(xué)研究領(lǐng)域亟待解決的問題。近年來，應(yīng)用納米技術(shù)提高難溶性藥物溶解度和改善生物利用度受到廣泛關(guān)注[2-3]。納米混懸劑是通過分散法或凝聚法將難溶性藥物粒徑控制在10～1 000 nm范圍，藥物以結(jié)晶型或無定型狀態(tài)存在的分散體系[4]，具有高載藥量、制備方便、溶解速度增加等優(yōu)點[5-6]。白藜蘆醇為非黃酮的酚類物質(zhì)，難溶于水，易溶于三氯甲烷、乙醇、丙酮等有機溶劑。白藜蘆醇具有抗感染、抗氧化、抗癌、心血管保護等多種藥理作用[7-9]，但較低的水溶性限制了其應(yīng)用。因此，本研究以白藜蘆醇為模型藥物，采用反溶劑沉淀法制備白藜蘆醇納米混懸劑，以聚乙烯吡咯烷酮PVPK 17 PF為助懸劑，泊洛沙姆F188為表面活性劑，以粒徑及多分散指數(shù)(polydispersion index，PDI)為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken Design響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化白藜蘆醇納米混懸劑的最佳處方，以期改善白藜蘆醇的溶解度和溶出速度，提高白藜蘆醇的生物利用度，為白藜蘆醇的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-10A高效液相色譜儀(蘇州島津分析儀器有限公司)；ME235P電子分析天平(德國Sartorius公司)；Nano-S90激光粒度分析儀(英國Malvern公司)；HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)；3K30超速離心機(德國Sigma公司)；KQ-100DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

白藜蘆醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%，批號20170709，陜西慈緣生物有限公司)；白藜蘆醇對照品(批號111535-201703，中國食品藥品檢定研究院)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP K17PF)及泊洛沙姆188(F188)由北京鳳禮精求有限公司提供；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白藜蘆醇納米混懸劑的制備

采用反溶劑沉淀法制備白藜蘆醇納米結(jié)晶混懸劑[10]。將助懸劑PVP K17PF及表面活性劑F188溶解于蒸餾水中作為水相，白藜蘆醇溶解于無水乙醇中作為有機相，在1 500 r/min攪拌狀態(tài)下將白藜蘆醇無水乙醇溶液加至上述水相中形成均一混懸體系，即得白藜蘆醇納米混懸劑。在納米混懸劑中加入質(zhì)量濃度3%甘露醇，攪拌溶解后分裝至西林瓶中，置于超低溫冰箱中以-80 ℃冷凍24 h，置冷凍干燥機中，在10 Pa、-40 ℃條件下冷凍干燥48 h，得到白藜蘆醇納米混懸劑凍干品，備用。

2.2 處方優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計 在單因素考察試驗基礎(chǔ)上，選擇對納米混懸劑制備工藝影響顯著的3個因素，即藥物質(zhì)量濃度(mg/mL，X1)、助懸劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%，X2)與表面活性劑的質(zhì)量濃度(mg/mL，X3)，分別用代碼-1、0、+1標(biāo)識所選擇的每個因素的低、中、高3個水平。以納米混懸劑的粒徑大小和多分散指數(shù)(polydispersion index，PDI)為響應(yīng)值，采用三因素三水平的Box-Behnken設(shè)計安排試驗，因素與水平安排見表1。

表1 Box-Behnken design試驗設(shè)計因素與水平
Table1The factors and levels of Box-Behnken design experimental design

因素水平-10+1X1=藥物質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)11.52X2=助懸劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%0.20.30.4X3=表面活性劑質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)234變量限定條件Y1=粒徑/nm最小Y2=多分散指數(shù)(PDI)最小

2.2.2 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計安排采用反溶劑沉淀法制備白藜蘆醇納米混懸劑，并測定粒徑及PDI等2個響應(yīng)值，結(jié)果見表2?？梢?，白藜蘆醇納米混懸劑的粒徑變化范圍為141～277.6 nm，PDI為0.086～0.234，提示納米混懸劑粒徑大小分布相對比較均勻。

以粒徑大小及PDI作為響應(yīng)值，利用Design expert實驗設(shè)計軟件對各變量與響應(yīng)值之間進行數(shù)學(xué)模型的擬合，根據(jù)獨立變量與響應(yīng)值之間的相互關(guān)系，分別進行線性方程(Linear)、兩因素交叉方程(2F)及二項式指數(shù)方程(Quadratic)的擬合，分析各變量之間的相關(guān)系數(shù)、調(diào)整參數(shù)及預(yù)測參數(shù)以確定擬合方程的歸屬，結(jié)果見表3。

可見，當(dāng)選擇粒徑及PDI為響應(yīng)值時，與線性方程、2F交叉方程相比較，二項式方程模型各參數(shù)值較大，故選擇該數(shù)學(xué)模型來描述各變量對響應(yīng)值的作用。

由方差分析及各參數(shù)的P值大小可知，白藜蘆醇的質(zhì)量濃度(X1)、PVP K 17質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)、交互項(X1X2，X1X3)及白藜蘆醇質(zhì)量濃度的二項式模型(X12)為影響粒徑的顯著性因素，所擬合的方程為：Y1= 172.54 + 27.72X1+ 23.66X2- 33.48X1X2+ 33.59X1X3+ 31.57X12，經(jīng)F值檢驗顯示模型方程顯著(r2=0.914 9)，可選擇該方程預(yù)測白藜蘆醇納米混懸劑的最優(yōu)處方。

在納米混懸劑遞送體系中，PDI為評價體系分散均勻程度的重要參數(shù)，當(dāng)PDI<0.3時認(rèn)為體系呈均一分散狀態(tài)。影響PDI的主要因素包括白藜蘆醇的質(zhì)量濃度(X1)、PVP K 17(X2)及表面活性劑F188質(zhì)量濃度(X3)，交互項(X1X2，X1X3)及表面活性劑的二項式模型(X32)。所擬合的方程用公式表述為：Y2= 0.11 + 0.03X1- 0.031X2- 0.023X3- 0.036X1X2- 0.022X1X3+ 0.013X32，經(jīng)F值檢驗表明模型方程顯著(r2=0.971 0)，可選擇該方程預(yù)測白藜蘆醇納米混懸劑的最優(yōu)處方。

2.2.3 效應(yīng)面分析預(yù)測與處方優(yōu)化 根據(jù)納米混懸劑的要求，目標(biāo)希望獲得較小的粒徑及PDI的處方，應(yīng)用Design expert試驗設(shè)計軟件繪制不同變量對響應(yīng)值影響的三維曲面圖，探討各因素對粒徑及PDI的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1 A 可知，納米混懸劑的粒徑隨藥物質(zhì)量濃度的增加以非線性模式增加，高濃度的藥物會產(chǎn)生較大的粒徑；隨表面活性劑F188質(zhì)量濃度的增加，粒徑呈減少趨勢；隨助懸劑比例的增加，粒徑呈增加趨勢。

由圖1 B可知，隨藥物質(zhì)量濃度的增加，納米混懸劑的PDI呈增加趨勢，提示藥物質(zhì)量濃度會影響到納米混懸劑的分布情況；助懸劑PVP K17的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，對PDI的影響呈遞減趨勢；而表面活性劑F188質(zhì)量濃度的變化，對PDI的影響不明顯。

按設(shè)計的限定目標(biāo)對納米混懸劑進行處方優(yōu)化，期望使納米混懸劑的粒徑與PDI處于最小值，根據(jù)Design expert試驗設(shè)計軟件確定所設(shè)定因素X1、X2、X3的代碼值，并制備了4批白藜蘆醇納米混懸劑，測定其粒徑大小及PDI，結(jié)果見表4。

由表4可知，處方1與處方3所得實測值和模型預(yù)測值之間的偏差較小，表明模型在該條件下具有良好的預(yù)測性，與實際值接近。另考慮到為提高處方中的藥物含量，故選擇處方1作為最終優(yōu)化處方。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The Box-Behnken design experimental design and results (n=3)

表3 響應(yīng)值模型方程擬合結(jié)果Table 3 The results of response value model equation fitting

粒徑/nmPDIρ(表面活性劑)/(mg?mL-1)ρ(表面活性劑)/(mg?mL-1)ρ(藥物)/(mg?mL-1)ρ(藥物)/(mg?mL-1)助懸劑/%)助懸劑/%)ρ(藥物)/(mg?mL-1)ρ(藥物)/(mg?mL-1)ρ(表面活性劑)/(mg?mL-1)ρ(表面活性劑)/(mg?mL-1)助懸劑/%)助懸劑/%)AB

圖1各因素變量對粒徑(A)及PDI(B)影響的效應(yīng)面圖

Figure1Response surface model (RSM) presenting the influence of the independent variables on the particle size (A) and PDI (B)

表4 白藜蘆醇納米混懸劑模型驗證實驗中的實測值和預(yù)測值Table 4 Predicted values and actual values of resveratrol nanosuspension formulation

注：偏差=(預(yù)測值-實測值)/預(yù)測值。

將代碼優(yōu)化數(shù)值通過下列公式轉(zhuǎn)化成優(yōu)化的實際數(shù)值，所以對于每一個變量，優(yōu)化后的實際值為：

選擇從2016年1月—2017年12月收治的100例肺部真菌感染患者納入此次研究工作。100例肺部真菌感染患者中，有男性患者53例，有女性患者47例；患者年齡最小20歲，年齡最大78歲，平均年齡為（38.50±10.35）歲；患者病程時間最短1年，病程時間最長25年，平均病程時間為（7.50±5.45）年。此次研究工作征得患者本人的知情同意，簽署知情同意書。

代碼值=(實際值-實際值的平均值)/實際值的差值，

藥物的量(mg/mL) = 10(X1)+ 30，

穩(wěn)定劑用量(%) = 0.1(X2)+ 0.3，

表面活性劑量(mg/mL) = 1(X3)+ 3，

即優(yōu)化后的處方為：白藜蘆醇的質(zhì)量濃度為29.2 mg/mL，PVP K17 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.38%，Poloxmer 188質(zhì)量濃度為3.63 mg/mL。采用“2.1”項下方法制備白藜蘆醇納米混懸劑3批，測得3批制劑的平均粒徑為(145.7 ± 7.07) nm，平均PDI為0.0826± 0.0015。

2.3 白藜蘆醇納米混懸劑粒徑測定及形貌觀察

將所制備的白藜蘆醇納米混懸劑加入適量蒸餾水稀釋及納米混懸劑凍干品復(fù)溶后，置于激光粒度分析儀中測定粒徑分布，結(jié)果見圖2。粒徑測定結(jié)果顯示，白藜蘆醇納米混懸劑在凍干前、凍干后的粒徑分別為(145±6.56) nm和(241± 3.01) nm，粒徑有所增加，這與凍干過程中納米粒子發(fā)生聚集有關(guān)。

采用透射電鏡觀察白藜蘆醇納米混懸劑的形態(tài)。將白藜蘆醇納米混懸劑滴于銅網(wǎng)上，滴加1%磷鎢鉬酸負(fù)染，用濾紙吸去多余的液體，室溫自然晾干后，將銅網(wǎng)置于透射電鏡下進行觀察，結(jié)果見圖3?？梢?，白藜蘆醇納米混懸劑呈不規(guī)則顆粒狀。

2.4 白藜蘆醇納米混懸劑穩(wěn)定性考察

光密度/%151050光密度/%20151050100806040200100806040200凍干前凍干后10010001001000D/nm

圖2白藜蘆醇納米混懸劑凍干前與凍干后的粒徑分布

Figure2Particle size distribution of resveratrol nanosuspension before and after lyophilization

圖3白藜蘆醇納米混懸劑透射電鏡圖

Figure3TEM image of resveratrol nanosuspension

表5 白藜蘆醇納米混懸劑穩(wěn)定性試驗結(jié)果
Table5The stability results of resveratrol nanosuspension (n=3)

t/d粒徑/nmPDI1243.6±3.610.210±0.00710255.7±4.550.223±0.01320259.6±2.830.215±0.00930281.9±4.130.236±0.007

2.5 體外釋藥性能研究

參照2015年版《中國藥典》第四部通則中0931項下溶出度與釋放度測定法中的槳法進行體外溶出實驗。分別取白藜蘆醇納米混懸劑、白藜蘆醇原料藥和物理混合物(按納米混懸劑處方將其余輔料與白藜蘆醇混合均勻)3組樣品，每組3份，每份均含有等量的10 mg白藜蘆醇。將樣品分別加入至(37±0.5) ℃的200 mL PBS溶液(pH 7.4，0.1%吐溫80)中，調(diào)整攪拌速度為100 r/min，在5、15、30、45 min和1、2、3、4、5 h等時間點取樣2 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，采用HPLC測定白藜蘆醇的含量，計算不同時間藥物的累積釋放量，以時間為橫坐標(biāo)，累積釋放量為縱坐標(biāo)，繪制白藜蘆醇體外釋放曲線，結(jié)果見圖4。

藥物累計釋放率/%100908070605040302010012345t/h納米混懸劑組原料藥組物理混合物組

圖4白藜蘆醇體外釋放速率曲線

Figure4The cumulative release profiles of resveratrol nanosuspensioninvitro

可見，納米混懸劑可顯著提高白藜蘆醇的溶出速率。在pH7.4的PBS中，納米混懸劑在30 min內(nèi)累積溶出接近50%，并在1 h累積溶出接近80%；而原料藥在30 min內(nèi)累積溶出不到15%，1 h內(nèi)的累積溶出僅為20%。此外，與原料藥相比，物理混合物組的溶出速率比原料組稍快，提示處方中的輔料具有一定的助溶作用，但溶出速率改善不明顯。

分別以零級動力學(xué)方程、一級動力學(xué)方程、Higuchi方程、Weibull方程、Peppas方程和Niebergull方程對體外釋藥數(shù)據(jù)進行擬合，判斷描述藥物釋放的最佳模型，所得到擬合方程見表6。相關(guān)系數(shù)(r)越接近1，表明擬合效果越好。

由擬合方程的相關(guān)系數(shù)可知，pH7.4的溶出介質(zhì)中白藜蘆醇納米混懸劑的體外釋藥符合一級速率方程，白藜蘆醇原料藥符合Higuchi模型，物理混合物組的釋藥方程符合Weibull方程。根據(jù)Peppas方程，可以探討藥物的釋放機理，當(dāng)0.450.89時為骨架溶蝕。試驗結(jié)果通過曲線的擬合可得，n值為0.3215，說明該藥物的釋放為Fick's擴散，釋放機制為擴散作用為主。

表6 白藜蘆醇體外溶出不同釋藥模型擬合方程Table 6 The release regression equations of resveratrol in vitro

3 討論

納米混懸劑與傳統(tǒng)高分子材料的納米載體不同，它不需要載體材料，僅通過表面活性劑與助懸劑的穩(wěn)定作用，是采用分散技術(shù)(Top-down)或者凝聚技術(shù)(Bottom-up)將藥物顆粒分散在水中形成的穩(wěn)定的納米分散體系[11-12]。《歐洲藥典》中根據(jù)溶解度的定義認(rèn)為白藜蘆醇屬于“幾乎不溶性”藥物[13]，白藜蘆醇具有較好的脂溶性，按照溶解性與透膜性將白藜蘆醇?xì)w屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中的Ⅱ類藥物[14]。因此，本課題組擬將白藜蘆醇制備成納米混懸劑，以增加其溶解度從而提高生物利用度。

本研究重點在于應(yīng)用Box-Behnken Design響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化白藜蘆醇納米混懸劑的最佳處方。在試驗中，以粒徑大小及粒徑PDI為響應(yīng)值，采用三因素三水平的Box-Behnken Design響應(yīng)面試驗設(shè)計，通過建立數(shù)學(xué)二項式模型及數(shù)理統(tǒng)計分析考察藥物質(zhì)量濃度、助懸劑聚維酮PVP K17質(zhì)量分?jǐn)?shù)及表面活性劑F188質(zhì)量濃度對響應(yīng)值的影響，以優(yōu)化最佳處方。結(jié)果表明優(yōu)化后最佳的處方組成為：白藜蘆醇的質(zhì)量濃度為29.2 mg/mL、PVP K17質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.38%及乳化劑Poloxmer 188的質(zhì)量濃度為3.63 mg/mL。

在采用反溶劑沉淀法制備納米混懸劑的過程中，乙醇擴散到水相中，白藜蘆醇由于在水中的溶解度小會析出結(jié)晶，形成藥物的微小晶核，而助懸劑PVPK17PF可以增加體系的黏度，表面活性劑F188可以降低藥物與溶劑之間的表面張力，兩者可以吸附在白藜蘆醇晶核的表面，防止晶核之間的聚集，阻礙藥物結(jié)晶發(fā)生沉降，從而形成穩(wěn)定的納米混懸劑。

從體外釋藥測定結(jié)果來看，白藜蘆醇溶出速率的加快與粒徑減少有關(guān)。 納米混懸劑之所以能增加難溶性藥物的溶解度和提高溶出速度，可以用經(jīng)典的Noyes-Whitney及Ostwald-Freundlich方程說明。納米顆粒比表面積和溶解度與顆粒的粒徑大小成反比，溶出速率與顆粒的粒徑成反比，即藥物的溶出速率和溶解度隨著藥物顆粒粒徑的減小而提高。當(dāng)將白藜蘆醇制備成納米混懸劑后，可以提供比較大的分散面積與較小的藥物粒徑，兩者共同改善藥物的溶出度[15]。體外溶出結(jié)果說明將白藜蘆醇制備成納米混懸劑可以提高白藜蘆醇的溶出度，為難溶性藥物白藜蘆醇的進一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究采用反溶劑沉淀法制備白藜蘆醇納米混懸劑，制備過程簡單，可以獲得粒徑在150 nm左右的納米混懸劑，后續(xù)工作將進行白藜蘆醇納米混懸劑體內(nèi)藥動學(xué)的研究。