戢開麗　黎淑貞　婁娟　李云　郭江華

【摘 要】 目的：探索卵裂期胚胎細胞數(shù)對囊胚發(fā)育的影響，以及對凍融后單囊胚移植結局的影響。方法：回顧性選擇D3胚胎評分A和B級5754枚行囊胚培養(yǎng)的胚胎，分為三組：A組7～9細胞;B組≥10細胞;C組4～6細胞。比較三組的囊胚培養(yǎng)情況。選擇177個單囊胚解凍移植周期，按照囊胚來源的D3胚胎評分A和B級分為兩組：A組7～9細胞和B組≥10細胞，比較凍融后單囊胚移植的結局。結果：三組胚胎囊胚培養(yǎng)結局比較，囊胚形成率、優(yōu)質囊胚率、D5囊胚形成率和D5優(yōu)質囊胚率差異極顯著（P<0.01），但B組與A組比較，囊胚形成率、優(yōu)質囊胚率差異不顯著（P>0.05），D5囊胚形成率差異極顯著（P<0.01），D5優(yōu)質囊胚率差異顯著（P<0.05）。凍融后單囊胚移植，兩組D5囊胚比率和臨床妊娠率差異不顯著（P>0.05），但兩組女方年齡差異極顯著（P<0.01）。結論：在排除碎片的影響后，囊胚發(fā)育與D3胚胎細胞數(shù)有關，4～6細胞的囊胚形成率最低，而≥10細胞與7～9細胞相比則無差異;凍融后單囊胚移植雖然≥10細胞與7～9細胞比較臨床妊娠率無顯著差別，但未排除女方年齡的差異。

【關鍵詞】 體外受精;囊胚培養(yǎng);D3胚胎評分;細胞數(shù);單囊胚移植

Blastocyst culture of different cell number from cleavage embryos and pregnancy outcome of their single frozen-thawed blastocyst

Ji Kaili， Li Shuzhen， Lou Juan， Li Yun， Guo Jianghua

Center for Assisted Reproduction， Jiangmen Central Hospital， Jiangmen， Guangdong 529030

[Abstract] Objective：To investigate the influence of cell number from cleavage embryos for blastocyst development， and to know pregnancy outcome of their single frozen-thawed blastocyst. Methods： This study retrospectively analyzed 5754 embryos for blastocyst culture were classified into three groups from cell number of day 3 （D3） cleavage embryo scoring grade A and grade B：7～9 cells in A group; ≥10 cells in B group; 4～6 cell in C group. Then blastula formation was compared among the three groups. And according to cell number of D3 cleavage embryo， 177 cycles frozen embryo transfer（FET） of single blastocyst from were classified two groups： 7～9 cells in A group and ≥10 cells in B group. Then pregnancy outcome was compared between the two groups. Results： There was extremely significant difference in blastocyst formation rate， high-quality blastocyst rate， day 5 （D5） blastocyst formation rate， and D5 high-quality blastocyst rate among three groups （P<0.01）， but no difference in blastocyst formation rate and high-quality blastocyst rate， and greater difference in D5 blastocyst formation rate and significant difference in D5 high-quality blastocyst rate between B group and A group. Moreover， clinical pregnancy and D5 blastocyst rate of single blastocyst on FET had no difference between A group and B group， but female age was greater different. Conclusion： Minimizing the impact of embryonic fragmentation， there was some correlation between blastocyst development and cell number of D3 embryo， blastocyst formation rate was lowest from 4～6 cells. There was no difference in blastocyst formation rate between ≥10 cells and 7～9 cells. Clinical pregnancy of single blastocyst on FET had no significant difference between ≥10 cells and 7～9 cells， but no excluding female age factor.

[Key words]In Vitro Fertilization; Blastocyst culture; D3 embryo scoring; Cell number; Single blastocyst transfer

2011年Istanbul共識[1]和2018年中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學會《胚胎實驗室關鍵指標質控專家共識》[2]指出，D3優(yōu)質胚胎定義為來源于正常受精卵，且受精后第3天胚胎細胞數(shù)為7～9個、細胞大小符合發(fā)育階段、碎片程度小于10%、無多核化的胚胎。胚胎發(fā)育過快過慢都可能導致胚胎染色體異常發(fā)生率增加[3]。但一些報道顯示[4]，D3胚胎細胞數(shù)越多，胚胎發(fā)育速度越快，優(yōu)質囊胚形成率越高。

本中心的D3胚胎評分是依據胚胎的對稱性、無核碎片的比例，將胚胎評級為：A（等大，碎片≤5%）、B（不等大、無碎片或等大、碎片≤25%）、C（等大或不等大、碎片≤50%）、D（碎片>50%），同時記錄胚胎的卵裂球細胞數(shù)。其中7～9細胞A和B級為優(yōu)質胚胎，D級和≤5細胞數(shù)C級胚胎為不可用胚胎。由于少量的碎片不影響發(fā)育，可能裂解或吸收，在發(fā)育中消失掉[5]。而當卵裂球胚胎碎片>25%時，很少有胚胎發(fā)育到囊胚[6]。尹太郎等[7]認為碎片率、卵裂球細胞數(shù)與囊胚培養(yǎng)的結局密切相關，在影響囊胚形成的作用上，當碎片率<20%時，卵裂球細胞數(shù)效應相對較大，而當碎片率>20%時，碎片的影響效應可能更大。故本文選擇D3評分為A、B級（碎片≤25%）胚胎，盡量消除碎片影響，從而了解不同細胞數(shù)卵裂期胚胎的囊胚培養(yǎng)情況，以及不同細胞數(shù)卵裂其胚胎來源的單囊胚解凍后移植結局。

1 資料與方法

1.1 對象與分組

選擇江門市中心醫(yī)院生殖中心2016年1月至2018年12月女方年齡≤38歲、進行囊胚培養(yǎng)的784對輔助生殖治療不孕夫婦。按照D3胚胎評分分為三組：A組7～9細胞A和B級胚胎共3723枚;B組≥10細胞A和B級胚胎共954枚;C組4～6細胞A和B級胚胎共1077枚。其中C和D級以及融合（Compact）胚胎未納入。

選擇2017年1月至2018年11月女方年齡≤38歲177個單囊胚解凍后移植周期。按照囊胚來源的D3胚胎評分分為兩組：A組7～9細胞A和B級胚胎134周期;B組≥10細胞A和B級胚胎43周期。4～6細胞A和B級胚胎只有12周期，未納入分析。

1.2 方法

1）體外受精和胚胎培養(yǎng)促排卵采用短效長方案、卵泡期長方案、拮抗劑方案等，卵泡發(fā)育成熟后，注射HCG 5000～10000IU，于35～36h在超聲引導下經陰道穿刺取卵。

禁欲2～7d，手淫法獲取精液，采用梯度離心后上游或直接離心后上游方法處理后行常規(guī)體外受精（IVF）或胞漿內單精子注射（ICSI）。IVF 3～4h去除顆粒細胞或ICSI結束轉移到平衡好的卵裂期胚胎培養(yǎng)液中，置于6%CO2、5%O2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng);D3移植或冷凍2枚卵裂期胚胎后剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，轉移到過夜平衡的囊胚液中。試劑采用Quinns Advantage序貫培養(yǎng)基（SAGE，美國），卵裂期胚胎培養(yǎng)液為1026，囊胚期胚胎培養(yǎng)液為1029。

2）胚胎評分D3卵裂期胚胎根據卵裂球大小均勻及碎片等情況評估胚胎質量：A（等大，碎片≤5%）、B（不等大、無碎片或等大、碎片≤25%）、C（等大或不等大、碎片≤50%）、D（碎片>50%），同時記錄胚胎的卵裂球細胞數(shù)，如8A，表示卵裂球細胞數(shù)為8個，等大且碎片≤5%。其中7～9細胞A和B級為優(yōu)質胚胎，D級和≤5細胞數(shù)C級胚胎為不可用胚胎。

D5/D6囊胚期胚胎評分采用Gandner評分法，根據囊胚發(fā)育階段、內細胞團和滋養(yǎng)層細胞的數(shù)量及排列的綜合情況來對囊胚的質量進行評定。按照囊胚腔的擴張程度分為1～6期，將2期及2期以上囊胚納入囊胚形成率的計算;按照內細胞團大小分A、B、C級;按照滋養(yǎng)層細胞數(shù)量的多少分為A、B、C級。如4AA表示擴張期囊胚，內細胞團數(shù)目多，排列緊密，滋養(yǎng)層細胞數(shù)目較多，結構致密。其中D5和D6 3BC或3CB以上的囊胚為可用囊胚，D5 3BB以上或D6 4BB以上的囊胚為優(yōu)質囊胚。囊胚形成率為D5和D6形成的2期以上囊胚總數(shù)與培養(yǎng)卵裂期胚胎數(shù)之比，優(yōu)質囊胚率=優(yōu)質囊胚數(shù)/形成的囊胚總數(shù)。

3）凍融后單囊胚移植囊胚凍融按照加藤試劑（Kitazato，日本）說明書操作，采用玻璃化冷凍技術：冷凍時在ES液平衡12～15min后，轉VS液于60s內裝入載桿投到液氮中;解凍時從液氮中取出迅速投到TS液，1min后轉入DS液，3min后轉入WS1和WS2分別3min和1min，解凍結束后放在平衡好的1029中培養(yǎng)2h再移植。

胚胎移植后10d查血β-HCG，4～5周后B超檢查，見孕囊和胎心，且胎心有博動的為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 19.0軟件對數(shù)據進行χ2檢驗和t檢驗，P<0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同細胞數(shù)卵裂期胚胎囊胚培養(yǎng)情況比較

從表1可以看出三組不同細胞數(shù)卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)在囊胚形成率（78.8%，77.3%和46.1%）、優(yōu)質囊胚率（44.8%，44.8%和26.0%）、D5囊胚形成率（51.2%，58.8%和17.7%）、D5優(yōu)質囊胚率（45.4%，50.8%和27.7%）差異都極顯著（P<0.01），其中C組4～6細胞卵裂期囊胚培養(yǎng)情況最差，囊胚形成率、優(yōu)質囊胚率、D5囊胚形成率和D5優(yōu)質囊胚率都明顯低于A組7～9細胞和B組≥10細胞。

B組與A組比較，其囊胚形成率（77.3% vs 78.8%）和優(yōu)質囊胚率（44.8% vs 44.8%）差異不顯著（P>0.05），而D5囊胚形成率（58.8% vs 51.2%）差異極顯著（P<0.01），D5優(yōu)質囊胚率（50.8% vs 45.4%）差異顯著（P<0.05），B組D5囊胚形成率和D5優(yōu)質囊胚率均比A組高，說明B組胚胎發(fā)育快，在D5更快形成囊胚以及更容易形成優(yōu)質囊胚。

C組與A組比較，囊胚形成率、優(yōu)質囊胚率、D5囊胚形成率和D5優(yōu)質囊胚率都差異極顯著（P<0.01）。

2.2 不同細胞數(shù)卵裂球胚胎來源的囊胚凍融不同后單囊胚移植結局

從表2可以看出A組7～9細胞和B組≥10細胞的不孕年限、基礎FSH和基礎E2差異不顯著（P>0.05），但兩組的女方年齡差異極顯著（P<0.01）。兩組D5囊胚比率（76.9% vs 88.4%）和臨床妊娠率（61.2% vs 62.8%）差異也不顯著（P>0.05）。由于未能排除女方年齡因素的影響，不能確定是否兩組臨床結局是否一致。

另外因為數(shù)據來源截至2018年11月，有些早期流產情況還可能發(fā)生，故兩組的早期流產未做比較，僅供參考。

3 討論

在輔助生殖助孕治療中，囊胚更適合子宮環(huán)境，移植囊胚可獲得更高的妊娠率，而且囊胚培養(yǎng)能夠實現(xiàn)對胚胎的進一步篩選和修復，其非整倍體率明顯下降，有利于挑選更具發(fā)育潛力的胚胎。影響囊胚形成的因素很多，如患者年齡[8]、原核數(shù)目情況[9-10]、卵裂期胚胎質量[11-12]、不同的授精方式[12-13]和囊胚培養(yǎng)體系等。目前仍沒有準確的指標預測囊胚培養(yǎng)的結局[14]，囊胚形成率從0%～100%都有可能。D3胚胎質量與囊胚形成的關系不是絕對相吻合的，Istanbul共識[1]和中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學會專家共識[2]將D3優(yōu)質胚胎定義為D3胚胎細胞數(shù)為7～9個。因為如Magli等[3]研究的結果顯示，D3胚胎7～8細胞染色體異常率50%最低，與5～6細胞73%、≥9細胞78%比較差異顯著，胚胎發(fā)育過慢或過快，染色體異常率都高于卵裂球細胞數(shù)8個的胚胎，染色體異常率高會影響囊胚形成。另外碎片也影響胚胎染色體，隨著碎片含量的增加，染色體異常率也增加。Hardy等[6]認為當D3胚胎碎片>25%，就很少有胚胎能發(fā)育到囊胚。故本文選擇D3評分碎片≤25%的A和B級胚胎，盡可能消除碎片對囊胚發(fā)育的影響，找出D3胚胎細胞數(shù)對囊胚發(fā)育的差別。

本文研究結果顯示，排除碎片的影響后，D3胚胎細胞數(shù)不同對囊胚形成有影響，囊胚形成率4～6細胞46.1%最低，與另外兩組比較差異極顯著。但與7～9細胞的囊胚形成率78.8%和優(yōu)質囊胚率44.8%比較，≥10細胞分別是77.3%和44.8%，差異不顯著。而D5囊胚形成率和D5優(yōu)質囊胚率，≥10細胞比7～9細胞更高，分別是58.8%和51.2%，50.8%和45.4%。≥10細胞胚胎發(fā)育快，在D5更快形成囊胚以及更容易形成優(yōu)質囊胚。這個結果與多篇報道類似。Wang等[15]認為D3胚胎的囊胚形成率7～9卵裂球顯著高于≤6卵裂球，與≥10卵裂球差異不顯著。Langley等[16]研究發(fā)現(xiàn)囊胚形成率與D3胚胎細胞數(shù)有一定的關系，在自體IVF周期中6細胞和8細胞的囊胚形成率分別是54.1%和75.6%，差異顯著;≥10細胞的囊胚形成率是69.5%與8細胞比較，差異不顯著。來自供體IVF周期，6細胞和8細胞的囊胚形成率同樣差異顯著，≥10細胞與8細胞幾乎差不多分別是89.2%和89.5%。尹太郎等[7]認為當碎片率≤20%時，卵裂球細胞數(shù)效應相對囊胚形成影響較大，碎片率<5%時，>8細胞胚胎與8細胞囊胚形成率及優(yōu)質囊胚率無顯著差異;6%≤碎片率≤20%時，>8細胞胚胎囊胚形成率和優(yōu)質囊胚率顯著高于與8細胞。嚴鳳英等[17]研究結果顯示，D3≥10個細胞的優(yōu)質囊胚形成率為38.9%，7～9個細胞43.1%，比較無顯著差異（P>0.05）;7～9個細胞的優(yōu)質囊胚形成率為43.1%，顯著高于4～6個細胞10.2%。

為進一步驗證D3不同細胞數(shù)來源的單囊胚移植的臨床結局是否有差異，本文還選取了凍融后單囊胚移植比較囊胚來源D3 7～9細胞和≥10細胞的臨床結局，結果顯示≥10細胞的臨床妊娠率62.8%與7～9細胞61.2%差異不顯著，但是受到樣本數(shù)的影響，≥10細胞僅43周期，未能排除女方年齡差異的因素[≥10細胞（29.4±3.2）歲] vs [7～9細胞（31.3±3.5）歲]（P<0.01）。因此不足以說明7～9細胞和≥10細胞來源的凍融后單囊胚臨床結局一致，但≥10細胞單囊胚移植的臨床妊娠率達到62.8%，也說明≥10細胞的D3胚胎臨床價值較高。

綜上所述，在降低碎片的影響后，可見囊胚形成與D3胚胎細胞數(shù)有很大的關系，細胞數(shù)低（4～6細胞）囊胚形成率最低，但7～9細胞與≥10細胞卻無差異，甚至≥10細胞的D5囊胚形成情況更好。從凍融后單囊胚的結局看，≥10細胞的臨床妊娠率與7～9細胞也差異不顯著，雖然沒有排除年齡差異的影響，但是≥10細胞單囊胚移植（平均年齡29.4歲）的臨床妊娠率62.8%也是較高水平。另外隨著凍融單囊胚移植周期的增加，還需進一步分析其流產率、活產率等妊娠結局，以確定≥10細胞低碎片的胚胎的價值是否與7～9細胞優(yōu)質胚胎相當。故建議D3胚胎評分時進一步細化細胞數(shù)，或放寬優(yōu)質胚胎僅限定于7～9細胞，能夠更加合理地選擇移植或冷凍的胚胎，防止在臨床應用時受冷凍費帶來經濟原因限制而丟棄了價值較高的≥10細胞低碎片的胚胎。

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