方開秀 侯亞杰 許曉茹 賈森 魏洪波 宋文

鈦種植體表面誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成骨分化是其體內(nèi)骨結(jié)合建立的生物學(xué)基礎(chǔ)[1-2]。種植體表面物理形貌優(yōu)化是最為經(jīng)典的方式，也是目前臨床上廣泛采用的方法，其中利用陽極氧化的方法建立的可控納米管結(jié)構(gòu)是研究的重要分支之一[3-4]。然而另有一部分研究指出，單純的形貌因素缺乏主動的骨誘導(dǎo)特性，利用功能性生物分子進(jìn)行種植體表面功能化，直接參與MSCs的成骨分化過程，勢必具有更顯著的優(yōu)勢[5]。本研究前期利用RNA干擾(RNA inteference，RNAi)技術(shù)對種植體表面功能化進(jìn)行了系統(tǒng)性探索，發(fā)現(xiàn)在不同的加載方式下，siRNA(靶向CKIP-1)或miRNA(antimiR138)均可誘導(dǎo)種植體表面MSCs的成骨分化[6-7]，這提示利用RNAi技術(shù)進(jìn)行種植體表面生物功能化修飾具有較強的可行性。在RNAi技術(shù)的研究中，安全、高效、經(jīng)濟(jì)的納米載體是制約其應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。天然或人工合成的非病毒載體可在一定程度上實現(xiàn)高效、安全的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，然而存在成本過高、潛在毒性等不足，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)單純應(yīng)用鈣離子即可在MSCs中實現(xiàn)高效的RNAi過程[7]，這提示應(yīng)用鈣離子進(jìn)行種植體表面RNAi功能化修飾具有極佳的應(yīng)用前景。本研究觀察了鈣離子轉(zhuǎn)運siRNA的特點，并將Ca-antimiR138復(fù)合物吸附于鈦種植體表面，證實了其誘導(dǎo)MSCs成骨分化的能力。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備

靶向GFP的siRNA(siGFP)、陰性對照siRNA(siNC)、Cy3熒光標(biāo)記siGFP(siCy3)、antimiR138以及脂質(zhì)體2000(lipof)(上海吉瑪公司)； 氯化鈣、氫氟酸、PBS、DMSO(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)； Opti-MEM、胎牛血清、青鏈霉素、胰蛋白酶(Gibco，California，USA)；MTT、4%多聚甲醛、BCIP/NBT染色液(北京雷根生物)； 純鈦試樣(1 cm邊長正方形，西安西北有色金屬研究院)； 倒置熒光顯微鏡(Olympus，Tokyo，日本)； 流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，Indianapolis，IN，USA)；酶標(biāo)儀(FLUOstar，Ortenberg，Germany)；掃描電鏡(S-4800 HITACHI，Tokyo，Japan)；激光共聚焦(Carl Zeiss Meditec AG，Jena，Germany)；體式顯微鏡(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

端粒酶缺失永生化、穩(wěn)定表達(dá)GFP的MSCs細(xì)胞由丹麥奧胡斯大學(xué)納米中心贈送，細(xì)胞培養(yǎng)在常規(guī)培養(yǎng)基中，即在EMEM中加入10%胎牛血清和1%青鏈霉素。細(xì)胞密度達(dá)80%左右時進(jìn)行胰酶消化傳代，細(xì)胞按照2×104/cm2密度進(jìn)行接種。

1.3 細(xì)胞常規(guī)轉(zhuǎn)染過程

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后在其中額外加入氯化鈣溶液，依據(jù)文獻(xiàn)報道[8]，使得鈣離子濃度區(qū)間為0～50 mmol/L，再分別加入不同的siRNA，使得siRNA終濃度為40 nmol/L，同時采用標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體2000作為陽性對照、未處理細(xì)胞作為陰性對照；轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)液換成常規(guī)培養(yǎng)基，完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測

在設(shè)定檢測點，采用胰酶將細(xì)胞消化收集，離心后用PBS清洗，離心、棄上清；采用適量PBS重懸細(xì)胞沉淀，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，分析10 000 個細(xì)胞，利用細(xì)胞折光性進(jìn)行圈門，在FL1通道上分析GFP熒光分布狀況，在FL2通道上分析Cy3熒光分布狀況，同時進(jìn)行平均熒光強度的定量分析。

1.5 熒光顯微鏡觀察

在設(shè)定檢測點，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入預(yù)熱的PBS，立即在倒置熒光顯微鏡下觀察，曝光時間設(shè)定為100 ms并保持一致，每組隨機采集5 張照片。

1.6 細(xì)胞活力檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS漂洗，加入MTT工作液，37 ℃孵育4 h；將上清輕輕吸棄，加入DMSO充分溶解紫色結(jié)晶，于580 nm出讀取吸光度。

1.7 鈦種植體表面修飾

采用20 V電壓下陽極氧化30 min在鈦種植體表面制備親水納米管表面，浸泡在Ca-siRNA復(fù)合物中6 h后室溫干燥，采用掃描電鏡和激光共聚焦進(jìn)行種植體表面觀察。

1.8 ALP染色及圖像分析

采用Ca-antimiR138進(jìn)行種植體表面修飾，將MSCs培養(yǎng)在種植體表面并誘導(dǎo)成骨分化7 d后，MSCs在種植體表面誘導(dǎo)分化7 d后，采用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS充分清洗后加入BCIP/NBT染色工作液，覆蓋鈦試樣，室溫避光； 30 min后吸棄染色液，加入去離子水終止反應(yīng)，體式顯微鏡拍照；采用ImageJ軟件對圖像藍(lán)紫色深淺進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同鈣離子濃度下siRNA的沉默效率及對細(xì)胞活力的影響

可見當(dāng)鈣離子濃度超過5 mmol/L之后，siGFP處理組細(xì)胞GFP熒光強度顯著下降，siNC處理組無顯著變化，同時脂質(zhì)體2000作用下GFP熒光強度也減弱(圖 1A)；當(dāng)超過10 mmol/L之后沉默效率可達(dá)90%以上，與脂質(zhì)體2000效果相當(dāng)(圖 1B)；各組濃度作用下細(xì)胞活力未受到顯著抑制，而脂質(zhì)體2000則表現(xiàn)出一定的細(xì)胞活力抑制作用(圖 1C)?；诖?，后期實驗以20 mmol/L的鈣離子濃度進(jìn)行。

A：不同濃度鈣離子條件下siRNA轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡觀察； B：GFP沉默效率定量； C：不同鈣離子作用下細(xì)胞活力狀況

圖 1 不同鈣離子濃度下siRNA的沉默效率及對GFP-MSCs細(xì)胞活力的影響(×100)

A: The fluorescence microscope images after 48 h siRNA transfection under different calcium concentrations； B: The GFP fluorescence intensity knockdown efficiency quantification； C: Cell viability under different calcium concentrations

Fig 1 The siRNA knockdown efficiency and cell viability under different calcium concentrations in GFP-MSCs(×100)

2.2 細(xì)胞攝取siRNA觀察

熒光顯微鏡觀察可見明場下每個細(xì)胞內(nèi)均有siCy3的進(jìn)入，表明細(xì)胞攝取率接近100%(圖 2A、 2B)；流式細(xì)胞儀檢測可見在Ca-siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞紅色熒光分布幾乎全部右移(圖 2C)，平均熒光強度增強約2 倍(圖 2D)。

2.3 血清在Ca-siRNA轉(zhuǎn)染中的作用

在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，可見細(xì)胞在6 h后已經(jīng)發(fā)生破裂，與siCy3的位置分布一致，而在有血清培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)完整，siCy3與細(xì)胞輪廓一致(圖 3A)；轉(zhuǎn)染48 h后，無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞破裂死亡，在有血清培養(yǎng)基中細(xì)胞表現(xiàn)出GFP沉默效果(圖 3B)。

A：明場細(xì)胞照片(×100)； B：同一視野下在Cy3通道觀察(×100)； C：流式細(xì)胞儀進(jìn)行Cy3熒光分布檢測； D：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)平均熒光強度

圖 2 在20 mmol/L鈣離子作用下細(xì)胞攝取siRNA(Cy3標(biāo)記)效率觀察

A: Bright field image of cells(×100); B: The Cy3 channel at the identical scope(×100); C: Flow cytometry analysis of Cy3 fluorescence distribution; D: The average intracellular fluorescence intensity measured by flow cytometry

Fig 2 The siRNA (Cy3 labeled) uptake observation under 20 mmol/L calcium treatment

2.4 種植體表面Ca-siRNA加載觀察

經(jīng)過陽極氧化后純鈦表面形成規(guī)則的納米管結(jié)構(gòu)，管徑約100 nm，進(jìn)行Ca-siRNA吸附后表面呈現(xiàn)大量高密度復(fù)合物(圖 4A)；采用siCy3進(jìn)行加載，激光共聚焦觀察并3D重建，可見紅色熒光分布較為均一(圖 4B)。

2.5 種植體表面修飾后誘導(dǎo)MSCs成骨分化檢測

采用Ca-antimiR138進(jìn)行種植體表面修飾，MSCs在其表面誘導(dǎo)分化7 d后可見ALP活性顯著增強(圖 5A)，半定量分析可見修飾后種植體表面ALP活性增強可達(dá)10 倍以上(圖 5B)。

A：Ca-siRNA分別在無血清和有血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后進(jìn)行攝取觀察； B：48 h后觀察細(xì)胞GFP熒光強度的變化

圖 3 血清對Ca-siRNA復(fù)合物作用的影響(×100)

A: The fluorescence microscope images of Ca-siRNA transfection in the medium with and without serum for 6 h; B: The GFP fluorescence intensity observation after 48 h

Fig 3 Influence of serum on Ca-siRNA complex(×100)

A：掃描電鏡觀察Ca-siRNA在NTs表面的分布； B：激光共聚焦觀察Ca-siRNA(Cy3)的分布

A: Scanning electron microscope images of the Ca-siRNA complex distribution on NTs surface; B: Confocal laser scanning microscope images of Ca-siRNA (Cy3 labeled) distribution

Fig 4 Surface characterization of the decorated titanium implant

A：誘導(dǎo)分化7 d后ALP染色； B：ALP染色圖的半定量分析相對活性

3 討 論

種植體表面生物修飾自提出后就備受關(guān)注，被認(rèn)為是未來種植體表面設(shè)計的重要趨勢之一[8]，不同于生長因子、粘附分子等非特異性作用，RNAi的應(yīng)用極大程度上解決了靶向骨形成的問題[9-10]，因此siRNA/miRNA功能化的植入材料具有良好的應(yīng)用前景。然而裸露的siRNA/miRNA依賴于高效的轉(zhuǎn)運載體，也成為其在材料功能化中應(yīng)用的瓶頸。因此，大量的研究集中在納米載體的開發(fā)，主要包括以陽離子脂質(zhì)體為代表的lipoplex復(fù)合物以及以陽離子聚合物為代表的polyplex兩大類[11]。這些納米載體的設(shè)計、合成較為復(fù)雜，成本較高且作用機理難以完全闡明，制約了其應(yīng)用范圍。

鈣離子作為內(nèi)源性的陽離子，發(fā)揮重要的生理功能，Hori等[12]首先報道了富含鈣離子的培養(yǎng)液中寡核苷酸的作用得到顯著增強；隨后Ruvinov等[13]首次系統(tǒng)性闡明了鈣離子轉(zhuǎn)運siRNA相關(guān)的納米材料學(xué)特性；本課題前期的研究首次在MSCs中也觀察到了該現(xiàn)象，證實了鈣離子的特殊效應(yīng)[7]。本研究也發(fā)現(xiàn)在一定鈣離子濃度的培養(yǎng)基中，裸露的siRNA對靶基因的沉默效率可顯著提升，與前期的研究結(jié)果一致；當(dāng)鈣離子濃度控制在合適的范圍內(nèi)時，可出色的實現(xiàn)靶基因高效沉默，同時對細(xì)胞活力不產(chǎn)生顯著影響，這在一定程度上優(yōu)于商品化的脂質(zhì)體2000，而鈣離子成本低廉，這為后期的應(yīng)用提供了可能性。關(guān)于鈣離子的作用機制雖有相關(guān)報道，但對于血清的關(guān)鍵作用缺乏描述。事實上，高濃度鈣離子可對細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，一方面高濃度鈣離子引起細(xì)胞外滲透壓增加，引起細(xì)胞損傷[14]；另一方面，帶正電的鈣離子可與帶負(fù)電的生物大分子結(jié)合，高濃度鈣離子引起生物分子功能障礙[15]。本研究在無血清培養(yǎng)基中可以觀察到大量細(xì)胞破裂，且破裂的碎片與siRNA的分布一致，這提示高濃度鈣離子可能與某些細(xì)胞成分相結(jié)合造成細(xì)胞破裂。而當(dāng)有血清存在時，高濃度鈣離子的損傷則被完全消除，出現(xiàn)了理想的RNAi現(xiàn)象，這一方面證實了血清對高濃度鈣離子的損傷具有保護(hù)作用，另一方面可能對siRNA作用的發(fā)揮至關(guān)重要。事實上，血清中BSA可與鈣離子結(jié)合，緩沖其對細(xì)胞造成的滲透壓損傷[16]，可以推測，鈣離子-siRNA-血清蛋白三者可共同形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮siRNA功能，這也是許多利用鈣離子作為橋接作用制備聚陰離子-Ca-siRNA納米復(fù)合物的基礎(chǔ)[17]。在脂質(zhì)體2000等許多商品化轉(zhuǎn)染試劑的使用中，均建議使用無血清或低血清培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，而鈣離子則與之相反，這也為實際的應(yīng)用提供了便利。

鈦種植體陽極氧化后可形成規(guī)則的納米管結(jié)構(gòu)，本身對MSCs的功能具有調(diào)控作用，更為重要的是氧化后的表面呈現(xiàn)超親水特性，為水溶性的Ca-siRNA復(fù)合物吸附提供了基礎(chǔ)。掃描電鏡觀察證實Ca-siRNA復(fù)合物可成功吸附于NTs表面，呈現(xiàn)相對均勻分布，與前期的研究觀察一致。簡單吸附的方法加載可在短期內(nèi)將Ca-siRNA復(fù)合物釋放出來，局部形成足夠的鈣離子濃度，這是siRNA功能的發(fā)揮的前提；采用antimiR138修飾后的種植體表面顯著提升了MSCs的ALP活性，提示其成骨分化得到顯著增強。事實上利用siRNA/miRNA分子促進(jìn)MSCs的成骨分化研究已有廣泛報道[18]，然而如何選擇合適的分子進(jìn)行加載尚缺乏特定要求。本研究所采用的細(xì)胞為端粒酶缺失永生化的MSCs，antimiR138最早被證實在該細(xì)胞的成骨分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]，本課題前期的研究篩查也證實了這一點[7]，然而后期對于特定細(xì)胞以及特定功能的需求狀態(tài)下，具體siRNA/miRNA的選擇尚需要進(jìn)一步明確。

綜上所述，本研究探明了單純應(yīng)用鈣離子轉(zhuǎn)運siRNA的相關(guān)特性，即安全、高效、簡便、廉價；應(yīng)用Ca-antimiR138進(jìn)行種植體表面修飾后，可顯著提升其骨誘導(dǎo)特性，為種植體表面生物修飾的應(yīng)用提供了新思路。