李亞輝，楊欣

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

近年來心血管疾病的發(fā)病率、病死率在全球范圍內呈逐年上升趨勢。大果木姜子又名米槁,是樟科(Lauraceae)樟屬植物米槁(CinnamomummigaoH.W.Li.)的干燥果實，為苗族、布依族的民間常用藥材，主要分布于中國的貴州、廣西和云南等地[1-3]。不僅可以藥用，也可以食用，其果實、根莖和葉都有藥用價值。在多種疾病中有較好的治療效果，尤其是對冠心病、心絞痛的患者有明顯的緩解疼痛作用[4-5]。已經有研究表明：大果木姜子揮發(fā)油在急性心肌缺血、實驗性心律失常、抗缺氧等方面發(fā)揮重要作用，尤其在抗菌(細菌、真菌)、抗病毒方面具有良好的效果[6]。還可應用于生產、食品的防腐等方面，以米槁?lián)]發(fā)油為主要原料開發(fā)的米槁精油滴丸、理氣活血滴丸，被廣泛應用到冠心病、心絞痛、胸痛、心悸等疾病的治療中[7-9]。但是有關大果木姜子水煎液體外抗氧及其對心肌缺血的作用尚未研究，因此本研究采用皮下多點注射鹽酸異丙腎上腺素建立大鼠心肌缺血模型，測定大果木姜子水煎液對大鼠血清中天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的影響，同時明確體內總抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽(GSH)的含量變化，并進一步分析心肌組織的病理變化情況。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

健康SD雄性大鼠48只，體質量250～290 g。由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號SCXK(湘)20140010。

1.2 實驗藥材

所選用的貴州大果木姜子由貴州益佰制藥股份有限公司提供，經貴州中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定為樟科(Lauraceae)樟屬植物米槁(GinnamomummigaoH.W.Li.)的干燥成熟果實，標本存于貴州中醫(yī)藥大學藥理實驗室(20180003)；鹽酸異丙腎上腺素(ISO，上海禾豐制藥有限公司)；普萘洛爾(江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司)；烏拉坦(上海山浦化工有限公司)。

1.3 實驗試劑及儀器

還原型谷胱甘肽(GSH，南京建成生物工程研究所)；天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)(長春匯力生物技術有限公司)；總抗氧化能力檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國)；徠卡2135型切片機(德國)；Midray BA-88A半自動生化分析儀(中國)；Thermo Scientific Evolution 260 Bio紫外分光光度儀(美國)；雙蒸水為本實驗室用MilliQ純水儀制備。

2 方法

2.1 大果木姜子水煎液的制備

稱取一定量藥材置入圓底燒瓶中，加入10倍量蒸餾水浸泡30 min，武火(大火)加熱至沸騰，然后文火(小火)保持微沸狀態(tài)60 min，趁熱將藥渣過濾；剩余藥渣中加入 8倍量蒸餾水，武火加熱至沸騰，然后文火保持微沸60 min，趁熱將藥渣過濾。將2次濾液進行合并，濃縮后制成1 g/mL(生藥量)中藥水提液，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 急性心肌缺血模型制備及給藥

復制心肌缺血模型[10-11]，健康雄性SD大鼠48只，雄性，體質量250～290 g。由長沙市天勤生物技術有限公司提供，實驗動物適應環(huán)境后隨機分為6組，分別為空白組、模型組、陽性藥組(普萘洛爾)和大果木姜子高、中、低劑量組，每組各8只。大鼠適應7 d后開始實驗，給藥組劑量均為2015年版《中華人民共和國藥典》人用高限劑量等效劑量的3.5倍，7倍，14倍，大果木姜子組高、中、低給藥劑量分別為600 mg/kg，300 mg/kg,150 mg/kg，陽性藥(普萘洛爾)給藥劑量為20 mg/kg[12]，模型組和正常組給予相應體積雙蒸水，各組給藥第7天，除空白組外，其余各組在給藥后1 h分別皮下多點注射鹽酸異丙腎上腺素30 mg/(kg·d)，每日1次，連續(xù)3 d。空白組注射等劑量的生理鹽水。各組飼養(yǎng)過程中保持室內環(huán)境條件均衡，自由進食飲水。

2.3 實驗取材

實驗取材前大鼠禁食12 h，不禁水，次日上午大鼠通過腹腔內注射1%戊巴比妥鈉(0.15 mL/100 g)麻醉，迅速打開腹腔，腹主動脈取血，用于生化指標檢測。取出心臟切成0.5～1 cm3大小，用10%中性福爾馬林固定，使固定液能迅速而均勻地滲入組織內部，常規(guī)石蠟制片，HE染色，光鏡觀察。

2.4 對大鼠血液生化指標的影響

SD大鼠腹主動脈取血后靜置，3 500 r/min離心15 min，取1 mL上清液置2 mL離心管中。采用Midray BA-88A半自動生化分析儀檢測血液生化指標，具體指標包括：天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)。

2.5 血清總抗氧化能力(T-AOC)

取適量100 mmol/L FeSO4-7H2O溶液稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L繪制標準曲線，血液樣本采集后需及時分離血清，每個樣本取5 μL，按照試劑盒標準操作方法進行檢測，37 ℃孵育3～5 min，采用酶標儀在波長593 nm測定樣品濃度。用作圖軟件制得曲線公式，把樣本測定管測得的OD代入計算公式，求得結果。在酸性條件下抗氧化物質可以還原Fe3+-TPTZ產生藍色的Fe2+-TPTZ，在593 nm處讀取吸光度可以計算出樣品中的總抗氧化能力。

2.6 檢測血清中還原型谷胱甘肽(GSH)的含量

谷胱甘肽(GSH)使用南京建成96T試劑盒，依據說明書進行操作，取適量1 mmol/L GSH標準品稀釋至100、50、20、10、5、0 μmol/L繪制標準曲線，取樣本血清50 μL按照標準操作方法進行檢測，采用酶標儀在405 nm的吸光度測定樣品濃度，單位為μmol/L。

2.7 病理組織學觀察

取完整心臟組織，將其放入4%多聚甲醛中固定24 h后進行石蠟包埋。沿心尖連續(xù)做冠狀切片，切成0. 5～1 cm3大小，蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin)染色，用中性樹膠進行封片，排除氣泡，光鏡觀察并拍照。

2.8 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 各組大鼠血清中CK、LDH和AST的含量比較

大鼠注射ISO后，與空白對照組相比，模型組血清中CK極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，大果木姜子高、中、低劑量血清中CK明顯降低(P<0.05)，尤其中劑量、低劑量具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與空白對照組相比，各實驗組血清中AST沒有發(fā)生較大變化；與空白對照組相比，模型組LDH含量增高，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與模型組相比，大果木姜子高劑量顯著降低(P<0.05)，中劑量、低劑量具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見表1。

表1 各組大鼠血清中CK、AST、LDH的含量變化比較

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 各組大鼠血清還原型谷胱甘肽(GSH)和總抗氧化能力(T-AOC)的比較

大果木姜子對大鼠血清中還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)和總抗氧化能力 (T-AOC)的影響結果見圖1。與空白對照組比較，模型組GSH含量降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，大果木姜子、中劑量、低劑量能提高GSH含量，高劑量、中劑量具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低劑量具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與空白對照組比較，模型組T-AOC含量降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組比較，大果木姜子中劑量、低劑量能提高T-AOC的含量，中劑量具極顯著有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低劑量具有極顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見表2。

表2 各組大鼠血清中GSH和T-AOC的含量比較

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 組織病理學檢查

心臟病理結果顯示：空白對照組大部分心肌細胞排列比較整齊、成束排列，緊密沒有發(fā)生病理改變(圖2A)。急性心肌缺血模型大鼠有明顯缺血性損傷，可見炎性細胞浸潤，小灶性肌纖維壞死，心肌壞死面積較大，證實皮下注射異丙腎上腺素能致心肌急性缺血性損傷(圖2B)。陽性藥組和大果木姜子高、中、低劑量組均可改善ISO引起的大鼠心臟組織細胞形態(tài)變化，以大果木姜子中劑量、低劑量對心臟病理損害改善較為明顯(圖2C～F)。結果見圖2。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 GSH和T-AOC在各大鼠血清中的含量比較

注：A：空白組；B：模型組(30 mg/kg)；C：陽性藥組(20 mg/kg)；D：大果木姜子低劑量(150 mg/kg)；E：大果木姜子中劑量(300 mg /kg)；F：大果木姜子高劑量(600 mg/kg)。圖2 大鼠心臟HE染色圖(×200)

4 討論

目前，心腦血管疾病已經成為危害人類健康的重大疾病。而缺血性心臟病占有較大的比例，由冠狀動脈發(fā)生病變而導致其心肌缺血和壞死，其心肌彌漫性纖維化與硬化，出現(xiàn)心臟腔室變大及心力衰竭[13-14]。中藥具有多成分、多靶點、多調節(jié)等特點，讓其在多種疾病中發(fā)揮重要作用，受到研究者的重視。心血管疾病與氧化應激關聯(lián)密切，很多研究表明通過抗氧化系統(tǒng)、調節(jié) Ca2+平衡、保護內皮細胞、促血管新生等發(fā)揮保護心肌的作用，心血管疾病在治療過程中迫切需要開發(fā)多靶點、毒性低的天然藥物。

已有研究表明,大果木姜子揮發(fā)油在急性心肌缺血、實驗性心律失常、抗缺氧等方面發(fā)揮重要作用，尤其在抗菌(細菌、真菌)、抗病毒具有良好的效果。孫學惠等[4]通過實驗致急性實驗性心肌缺血，觀察大果木姜子揮發(fā)油(CV-3)的抗心肌缺血作用，結果表明大果木姜子中揮發(fā)油成分可降低心肌梗塞的范圍以及梗塞后血清中乳酸脫氫酶(LDH)的水平，因此對急性心肌缺血而言CV-3有較好的保護作用。錢斌等[8]對大鼠冠狀動脈結扎致急性心肌缺血狀態(tài)，并給予小鼠大果木姜子口服乳劑(CV-KF)和靜脈乳劑(CV-JM)，研究發(fā)現(xiàn)給藥后能減少梗死后肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)水平，表明CV-KF和CV-JM對急性心機缺血有良好的保護作用。但是對大果木姜子水煎液在心血管方面的研究較少，仍然需要進一步對其進行研究和開發(fā)。

異丙腎上腺素是經典的β1和β2受體激動劑，主要是氧自由基的生成和細胞內鈣離子濃度升高而致心肌損傷。連續(xù)給大鼠腹腔內注射ISO會致與人相似性的急性心肌缺血損傷模型[15]。心肌缺血時常常伴有心臟功能及血流動力學的變化，在心肌缺血時，由于缺氧所導致的代謝障礙使ATP減少，鉀離子從細胞內流失，心肌的興奮-收縮偶聯(lián)障礙以及心肌收縮力減弱。大鼠血液內CK、AST、LDH的升高作為參考指標用來診斷細胞壞死性疾病。

機體中存在的抗氧化的大分子、小分子及酶可以清除體內產生的各種活性氧，阻止活性氧誘導產生氧化應激[16]。本研究中大果木姜子高劑量、中劑量、低劑量能提高谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量，高劑量、中劑量具有顯著差異(P<0.05)，GSH分布廣泛，參與細胞的多種功能活動，具有抗氧化、解毒、保護細胞等作用；LDH 參與機體能量代謝，分布在各個組織中，當機體組織受損或壞死的時候，釋放LDH進入血液，血液中的LDH活力升高；CK與細胞內能量轉運、ATP 再生、肌肉收縮有直接關系。 本研究體內實驗發(fā)現(xiàn)大果木姜子高、中、低劑量都能不同程度的升高GSH和T-AOC，發(fā)揮抗氧化的作用，并能降低CK和 LDH 的活力。綜上所述，大果木姜子具有心肌保護作用，但是高、中、低劑量沒有呈現(xiàn)劑量依賴性，以低劑量效果最突出。其機制可能與調控氧化應激，保護細胞損傷和抗氧化系統(tǒng)相關。