尚謙慧 周瑜 曾昕 陳謙明

氯喹(chloroquine，CQ)，是1934 年由德國(guó)科學(xué)家合成的一種與天然奎寧結(jié)構(gòu)相似的抗瘧疾藥，由于當(dāng)時(shí)使用劑量過大導(dǎo)致出現(xiàn)嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)。因此，科學(xué)家在1950 年合成一種與CQ結(jié)構(gòu)類似的化合物，羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HCQ與CQ作用相似且安全性更高[1]。隨著抗CQ的瘧原蟲菌株的出現(xiàn)，CQ /HCQ在抗瘧中應(yīng)用逐漸減少，但其他潛在臨床價(jià)值逐漸被挖掘。研究發(fā)現(xiàn)CQ/HCQ可以通過升高內(nèi)吞體/溶酶體的低PH值、抑制"炎癥風(fēng)暴"發(fā)揮抗病毒的作用。尤其是在新出現(xiàn)的、無特效治療藥物的、威脅全球公共衛(wèi)生安全的病毒性疾病面前，如嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(middle-east respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)，CQ/HCQ選作為輔助藥物，均取得良好的療效。此外，CQ/HCQ還具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤作用，并已用作治療各種慢性自身免疫性疾病、非瘧疾感染和腫瘤的輔助藥物[2]。

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)，病原體為2019-nCoV, 又稱嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，人群普遍易感，主要經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播[3]。近期一項(xiàng)研究表明口腔黏膜上皮尤其是舌部可能成為SARS-CoV-2感染的潛在部位，說明口腔存在易感性[4]。病毒傳播迅速，防疫形式嚴(yán)峻，且目前尚無針對(duì)COVID-19的特效藥物。結(jié)合新冠疫情，國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》將CQ納入抗病毒藥物，并已在多個(gè)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)[3,5]，這使得CQ/HCQ的抗病毒機(jī)制及其臨床應(yīng)用備受關(guān)注。因此，本文對(duì)CQ/HCQ的抗病毒機(jī)制以及應(yīng)用研究綜合介紹，以期加深臨床醫(yī)生對(duì)應(yīng)用CQ/HCQ治療COVID-19的理論依據(jù)及應(yīng)用策略的理解。

1 CQ/HCQ抗病毒機(jī)制研究

病毒只有寄居在有易感性的活細(xì)胞內(nèi)才能完成增殖。病毒與宿主細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞后，以其自身基因組為模板復(fù)制出病毒基因組并完成蛋白質(zhì)合成，最終經(jīng)過裝配釋放出子代病毒。少數(shù)時(shí)候，病毒在復(fù)制時(shí)可整合其基因組DNA片段插入宿主染色體DNA中，并和宿主DNA相連接。這種整合對(duì)病毒依賴性的癌變至關(guān)重要，如人乳頭瘤病毒等。增殖的病毒和免疫細(xì)胞相互作用，釋放多種細(xì)胞因子，形成炎癥風(fēng)暴并造成細(xì)胞大量的死亡[6]。病毒還可以通過抗原變異、損傷免疫細(xì)胞來進(jìn)行免疫逃避[7]。CQ/HCQ可以通過抑制病毒的增殖、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌，達(dá)到抗病毒的目的。

1.1 抑制病毒的增殖

1.1.1 抑制病毒吸附和入侵 病毒吸附于易感細(xì)胞是感染的第一步。病毒通過表面的吸附蛋白與宿主細(xì)胞(包括上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等)表面特異性受體相結(jié)合，選擇通過胞吞作用形成早期內(nèi)吞體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[4,8]。繼而和來源高爾基復(fù)合體的含有酸性水解酶的運(yùn)輸小泡發(fā)生融合，在其囊膜上質(zhì)子泵的作用下，將胞質(zhì)中的H+泵入，使得胞內(nèi)的PH值降到6.0以下。此時(shí)病毒可在內(nèi)吞體/溶酶體酸性環(huán)境中脫殼釋放出核酸[9-10]。

CQ/HCQ一方面可以影響宿主細(xì)胞表面受體的糖基化，進(jìn)而影響病毒和細(xì)胞的結(jié)合。如減少血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2(angiotensin converting enzyme-2, ACE2)受體的末端糖基化[8]。另一方面，CQ/HCQ可以影響病毒表面的吸附蛋白而減少病毒對(duì)易感細(xì)胞的吸附。如影響人免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus, HIV-1)包膜糖蛋白gp120的糖基化[11]。此外，有研究表明破壞內(nèi)吞體酸化和脫殼過程可抑制病毒復(fù)制、阻止病毒感染。CQ/HCQ溶水后呈堿性，可通過質(zhì)子化積聚在內(nèi)吞體/溶酶體等低pH值細(xì)胞器的酸性囊泡中，通過升高內(nèi)吞體/溶酶體酸性pH值，破壞其結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而影響病毒的感染[6,12-13]。

1.1.2 抑制病毒復(fù)制 CQ可通過影響鐵離子含量和抑制細(xì)胞自噬來影響病毒遺傳物質(zhì)的復(fù)制。研究表明病毒復(fù)制時(shí)需要鐵依賴性核糖核苷酸還原酶。晚期獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS) 患者體內(nèi)有大量鐵離子積累，CQ可以有效降低巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵含量，這可能是由于它干擾轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的鐵攝取，也可能是由于它能夠抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白釋放鐵離子，降低細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量，繼而干擾病毒復(fù)制，但需進(jìn)一步證實(shí)[14]。 此外，已有研究證明細(xì)胞自噬可以促進(jìn)寨卡病毒(zika virus，ZIKV)的復(fù)制[15]。而CQ可導(dǎo)致自噬溶酶體聚集，使自噬相關(guān)蛋白降解減少，抑制細(xì)胞自噬發(fā)生，從而抑制病毒的復(fù)制[12,15]。

1.2 抑制炎癥風(fēng)暴

某些病毒(SARS-CoV，埃博拉病毒(Ebola virus，EBoV)等)在感染后期可引發(fā)炎癥風(fēng)暴(亦稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴)，促使炎性細(xì)胞因子[包括白細(xì)胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)，IL-2，IL-6，IL-10，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，干擾素-α(interferon-α，IFN-α)，IFN-β]持續(xù)大量產(chǎn)生，活化免疫細(xì)胞聚集到炎癥部位，并產(chǎn)生釋放大量一氧化氮，增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性和感染性，造成組織充血、水腫、損傷，導(dǎo)致出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征和多臟器衰竭[16]。

CQ/HCQ可通過影響細(xì)胞因子表達(dá)水平和免疫細(xì)胞活化狀態(tài)來調(diào)節(jié)免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，CQ對(duì)TNF-α、IL-1和IL-6的分泌具有抑制作用[6,17]。此外，CQ可以通過降低下游信號(hào)分子白細(xì)胞介素1受體相關(guān)蛋白激酶-4和干擾素調(diào)節(jié)因子-7表達(dá)水平以及抑制IFN-α的合成，來抑制Toll樣受體/ MyD88信號(hào)通路和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞活化[13](表 1)。

2 CQ/HCQ抗病毒的臨床應(yīng)用

2.1 HIV感染和AIDS

HIV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科的慢病毒，主要攻擊人CD4+T淋巴細(xì)胞，感染者可經(jīng)過數(shù)年、甚至長(zhǎng)達(dá)10 年或更長(zhǎng)的潛伏期后發(fā)展成AIDS而最終導(dǎo)致死亡。大量研究發(fā)現(xiàn)CQ可以通過影響gp120糖基化、內(nèi)吞體酸化來影響HIV對(duì)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的吸附和入侵，還可以通過下調(diào) IFN-α等細(xì)胞因子來抑制免疫活化[11，14]。一項(xiàng)早期隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HIV感染者服用 800 mg/d HCQ 16 周后：CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)未出現(xiàn)變化，血清IL-6水平和病毒負(fù)載量降低(P<0.05)[18]。而在另一項(xiàng)臨床雙盲隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果顯示，HIV感染者服用HCQ(400 mg/d)48 周后IL-6水平未出現(xiàn)變化，CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)下降，病毒負(fù)載量升高(P<0.05)[19]。

表 1 CQ/HCQ抗病毒機(jī)制

2.2 埃博拉出血熱(Ebola hemorrhagic fever，EHF)

自1976年起中非地區(qū)曾爆發(fā)數(shù)次EHF，死亡率高達(dá)60%～80%。EBoV是一種含有包膜的絲狀病毒，可通過酸性內(nèi)吞體的低PH值來引發(fā)包膜糖蛋白對(duì)宿主細(xì)胞表面分子的結(jié)合以及引起炎癥風(fēng)暴造成組織損傷[16,20]。體外實(shí)驗(yàn)證明，CQ可通過改變細(xì)胞內(nèi)PH環(huán)境來影響EBoV進(jìn)入宿主細(xì)胞[20]。Madrid等[21]在BALB/c小鼠模型中發(fā)現(xiàn)CQ(90 mg/kg，2 次/d)可明顯提高小鼠70%～80%總體生存率(P<0.05)，但是在相同用藥劑量的荷蘭豬模型中卻未出現(xiàn)相同結(jié)果，并且在更低用藥劑量(>25 mg/kg)的荷蘭豬模型中出現(xiàn)藥物毒性。

2.3 登革熱(Dengue)和基孔肯雅病(Chikungunya)

登革熱和基孔肯雅病都是由蟲媒傳播引起的急性傳染病。登革熱病毒(dengue virus，DENV)和基孔肯雅病病毒(chikungunya virus，CHIKV)均由低PH值的內(nèi)吞體途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞[9,13]。體外實(shí)驗(yàn)表明CQ/HCQ對(duì)DENV 和CHIKV有抑制作用(P<0.05)[9,22]。一項(xiàng)雙盲隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中，CQ(第1、 2天 ：600 mg；第3 天：300 mg)雖可以縮短DENV感染者的發(fā)熱時(shí)間(P<0.05)，但不良事件發(fā)生率高于對(duì)照組(P=0.01)[23]。且在一項(xiàng)關(guān)于CHIKV急性感染的雙盲隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中，CQ未能有效減少關(guān)節(jié)疼痛和病毒血癥持續(xù)時(shí)間，且出現(xiàn)輕微不良反應(yīng)(P<0.01)[24]。

2.4 甲型流感(Influenza A)和禽流感(Avian influenza)

甲型流感和禽流感均是由甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)引起。體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CQ可通過影響IAV進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)吞體/溶酶體途徑及抑制細(xì)胞自噬來發(fā)揮有效作用[10,25]。而一項(xiàng)臨床雙盲隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明，健康人對(duì)CQ具有良好耐受，但CQ(第1周：500 mg/d；第2～12周：500 mg/周)并不能有效預(yù)防甲型(H1N1、H3N2)和乙型流感病毒感染，且不良事件發(fā)生率更高(P<0.000 1)[26]。

2.5 嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)與中東呼吸綜合征(Middle-East respiratory syndrome, MERS)

SARS于2002 年底首次出現(xiàn)在我國(guó)廣東地區(qū)，并蔓延至全球29 個(gè)國(guó)家/地區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)其病原體SARS-CoV刺突(spike，S)蛋白的S1區(qū)域可與宿主細(xì)胞表面受體ACE2結(jié)合進(jìn)入宿主上皮細(xì)胞內(nèi)，繼而通過內(nèi)吞體/溶酶體途徑脫殼釋放病毒顆粒，并在感染后期引發(fā)炎癥風(fēng)暴[6,8,13]。MERS是2012 年來由MERS-CoV引發(fā)的一類嚴(yán)重呼吸道疾病，病死率約為35%。MERS-CoV可通過內(nèi)吞體/溶酶體途徑發(fā)揮作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，CQ能夠同時(shí)抑制SARS-CoV誘導(dǎo)的Vero E6細(xì)胞系中病毒復(fù)制，半抑制濃度[IC50=(8.8±1.2) μmol/L]接近急性瘧疾治療期間所達(dá)到的CQ血漿濃度，提示CQ對(duì)該細(xì)胞系應(yīng)用的安全性[27]。此外，Vincent等[8]還發(fā)現(xiàn)Vero E6細(xì)胞暴露SARS-CoV之前和之后均用CQ處理后病毒復(fù)制均受抑制，突顯出CQ對(duì)SARS-CoV的預(yù)防和治療的優(yōu)勢(shì)。De等[28]篩選348 種FDA批準(zhǔn)化合物，確定CQ對(duì)MERS-CoV[半最大效應(yīng)濃度(EC50)=3.0 μmol/L]和SARS-CoV(EC50=4.1 μmol/L)有抑制作用。

2.6 COVID-19

研究表明，COVID-19的病原體SARS-CoV-2與SARS-CoV具有親緣關(guān)系，且與蝙蝠冠狀病毒HKU9-1相似。并發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的S蛋白R(shí)BD區(qū)域可與人宿主細(xì)胞表面的ACE2相結(jié)合[29]。在細(xì)胞水平上，CQ[EC50=1.13 μmol/L，半細(xì)胞毒性濃度(CC50)>100 μmol/L]能夠有效抑制 SARS-CoV-2 感染[30]。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，CQ在抑制肺炎惡化、改善肺部成像結(jié)果、促進(jìn)病毒陰性轉(zhuǎn)化和縮短病程方面優(yōu)于對(duì)照組，且無嚴(yán)重不良反應(yīng)[5]。并形成《磷酸氯喹治療新型冠狀病毒肺炎的專家共識(shí)》，CQ每次 500 mg，2 次/d，療程10 d[31]。后由臨床數(shù)據(jù)的進(jìn)一步豐富，確保該藥在臨床使用中更加安全有效，強(qiáng)調(diào)CQ適用于18～65 歲的成人，并需要根據(jù)患者體重差異調(diào)整CQ的用法用量[32]。

2.7 其他

ZIKV，屬于黃病毒科，通過母嬰傳播引起胎兒嚴(yán)重的小頭畸形癥。體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CQ/HCQ可以抑制ZIKV的垂直傳播[12,15]。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)同屬黃病毒科，已造成全世界7 110 萬人感染。一項(xiàng)三盲臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明，對(duì)聚乙二醇干擾素和利巴韋林的聯(lián)合治療無反應(yīng)的HCV-1患者經(jīng)過CQ(150 mg/d)治療8 周后，HCV-RNA表達(dá)量和血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)顯著降低(P<0.05)[33]。單純皰疹(herpes simplex)是I型單純皰疹病毒(herpes simplex virus-1，HSV-1)感染所致，具有傳染性。體外實(shí)驗(yàn)表明，CQ(150 μmol/L)不能有效阻止HSV對(duì)細(xì)胞的吸附或侵入，但CQ(10 μmol/L)可以增強(qiáng)IFN(10 IU/ml)的抗病毒作用[34]。

表 2 CQ/HCQ用于抗病毒治療的臨床試驗(yàn)一覽表

3 藥物安全性

研究表明一次服用20 mg/kg CQ會(huì)出現(xiàn)藥物毒性，當(dāng)一次服用30 mg/kg則會(huì)引起死亡。不良反應(yīng)包括：頭暈、頭痛、視力模糊、注意力難以集中、輕微腸胃不適和瘙癢。少見皮膚色素脫失、毛發(fā)變白、脫發(fā)以及各種皮疹。長(zhǎng)期大劑量使用CQ(累計(jì)總量達(dá)1 g/kg或者50～100 g)可誘導(dǎo)不可逆性視網(wǎng)膜病變[35]。

因此，在使用CQ時(shí)需要謹(jǐn)慎選擇用藥劑量，以確保其安全性。CQ在我國(guó)用于治療COVID-19時(shí)，也由最初的每次500 mg、 2 次/d改為根據(jù)體重差異選擇用藥劑量，并且療程從10 d縮短為7 d。

4 小結(jié)及展望

CQ/HCQ作為經(jīng)典的抗瘧疾藥物已使用近百年。隨著近年來對(duì)其抗病毒機(jī)制的深入研究，尤其是對(duì)新出現(xiàn)的、危險(xiǎn)性高的人畜共患病毒，CQ/HCQ展現(xiàn)出巨大的使用價(jià)值。但是，眾多研究對(duì)CQ的抗病毒作用未能得到統(tǒng)一結(jié)果，這可能與CQ/HCQ開始治療時(shí)間、使用劑量、聯(lián)合用藥種類不同有關(guān)。因此，尋求CQ/HCQ的最佳治療時(shí)間、選擇有效劑量，確定適合的聯(lián)合用藥方案對(duì)CQ/HCQ發(fā)揮抗病毒作用具有巨大的臨床意義。

doi:10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2020.0019.