徐成 林召 楊愷2)? 元冰2)?

1) (蘇州大學(xué)軟凝聚態(tài)物理及交叉研究中心，蘇州 215006)2) (蘇州大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，蘇州 215006)(2020年2月1日收到; 2020年3月31日收到修改稿)

蜂毒肽等抗菌肽可通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜而直接殺滅細(xì)菌, 因此它的殺菌功能具有高效、廣譜和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn), 并被認(rèn)為有望能從根本上解決目前正嚴(yán)重威脅人類健康的抗生素耐藥性問題. 然而, 抗菌肽通過增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性來實(shí)現(xiàn)殺菌的分子機(jī)制至今尚不清楚. 本文結(jié)合單分子熒光追蹤技術(shù)和分子動(dòng)力學(xué)模擬, 從單分子運(yùn)動(dòng)的角度對(duì)蜂毒肽與二元脂質(zhì)細(xì)胞膜的界面相互作用過程進(jìn)行了研究. 結(jié)果表明, 相較于其他大多數(shù)脂分子而言、部分脂分子在膜內(nèi)的擴(kuò)散速率會(huì)由于蜂毒肽的吸附、聚集、插膜成孔等擾動(dòng)行為發(fā)生顯著降低; 而蜂毒肽傾向于作用在多組分脂膜相疇的邊界處, 干擾并降低脂膜相分離的程度, 進(jìn)而降低相邊界對(duì)脂質(zhì)分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的限制. 本工作闡明了蜂毒肽的膜作用活性對(duì)脂分子運(yùn)動(dòng)行為和脂膜相行為的影響、以及三者之間的關(guān)聯(lián). 這些結(jié)果對(duì)于從單分子運(yùn)動(dòng)行為的角度來探索抗菌肽生物活性的分子機(jī)制和開發(fā)新型抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義.

1 引 言

細(xì)胞膜是分隔細(xì)胞內(nèi)部與外界環(huán)境的界面, 更是許多重要的生物學(xué)過程發(fā)生和藥物發(fā)揮作用的主要場所. 在這些生物學(xué)過程中, 抗菌肽與細(xì)胞膜的相互作用近年來廣受關(guān)注. 抗菌肽是生物體免疫系統(tǒng)為抵抗外界細(xì)菌入侵或殺滅被感染的細(xì)胞而分泌的一類短肽, 通常包含20—60個(gè)氨基酸殘基、帶正電[1,2]. 與大多數(shù)傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)制不同, 抗菌肽通過破壞細(xì)菌內(nèi)最保守的結(jié)構(gòu)之一-細(xì)胞膜, 并進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物的泄漏來殺滅細(xì)菌[3],因此其殺菌功能具有高效、廣譜和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn). 因此, 面對(duì)目前正在嚴(yán)重威脅全球人類健康的抗生素耐藥性甚至“超級(jí)細(xì)菌”問題, 抗菌肽被認(rèn)為是一類有效而根本的解決途徑[4,5]. 然而天然抗菌肽具有工作濃度高、細(xì)胞毒性大等缺點(diǎn), 限制了其臨床應(yīng)用[1,4], 解決這些瓶頸問題的關(guān)鍵在于深入了解抗菌肽與細(xì)胞膜相互作用的分子機(jī)制.

蜂毒肽是最典型的抗菌肽種類之一, 包含26個(gè)氨基酸殘基, 帶6個(gè)正電荷. 根據(jù)目前普遍接受的觀點(diǎn)[6], 蜂毒肽與細(xì)胞膜的相互作用過程大致遵循“兩態(tài)”模型: 當(dāng)吸附到膜表面后, 蜂毒肽會(huì)由原本的無規(guī)卷曲變?yōu)閍 螺旋結(jié)構(gòu)(附錄A 中圖A1);隨后這些吸附的多肽會(huì)進(jìn)一步插入膜中, 形成跨膜孔和導(dǎo)致跨膜物質(zhì)泄漏. 蜂毒肽從表面吸附到跨膜插入的轉(zhuǎn)變是其發(fā)揮生物活性的核心, 需要克服較高的能量勢(shì)壘(22—37kBT)[7], 而多肽在膜表面的吸附和局部高濃度聚集以及由此對(duì)膜結(jié)構(gòu)和性質(zhì)造成擾動(dòng)是實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵[7]. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,蜂毒肽導(dǎo)致膜孔形成的臨界濃度約為3.0 μg/mL[8];在此臨界濃度附近, 蜂毒肽在脂膜表面的吸附會(huì)導(dǎo)致脂膜厚度變薄約3%, 面積延展約4%[7]. Mishra等[9]利用X 射線衍射技術(shù), 證明在多肽作用下、脂膜重組和負(fù)高斯曲率結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)與多肽的成孔功能密切相關(guān); Weisshaar 等則利用熒光成像等技術(shù)證明蜂毒肽對(duì)細(xì)菌膜的成孔作用是一個(gè)反復(fù)透化、愈合、再透化的動(dòng)力學(xué)過程; Huang 等[10]和Rzepiela 等[11]的模擬結(jié)果顯示, 抗菌肽在膜表面的吸附及其局部濃度的增加, 會(huì)改變膜表面的壓力分布, 導(dǎo)致磷脂尾鏈有序程度降低; 而我們之前的研究結(jié)果也證明, 聚集的多肽團(tuán)簇能夠選擇性地從脂膜上葉抽離脂質(zhì)分子, 造成脂膜兩葉間分子成分和力學(xué)狀態(tài)的不對(duì)稱性[8]. 這些多肽對(duì)膜結(jié)構(gòu)的擾動(dòng), 結(jié)合多肽自身的聚集和構(gòu)象變化 (例如U 形彎折), 能夠顯著降低蜂毒肽跨膜插入的自由能勢(shì)壘[12].然而, 這些相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果大都是從脂膜和多肽的結(jié)構(gòu)變化的角度出發(fā), 對(duì)多肽與膜相互作用過程中大量分子平均效果進(jìn)行分析和對(duì)首末狀態(tài)進(jìn)行刻畫 (例如對(duì)跨膜泄漏效果的表征和膜孔結(jié)構(gòu)的分析). 此外, 大多數(shù)研究是基于單組分脂質(zhì)膜模型[13], 并未涉及真實(shí)細(xì)胞膜體系內(nèi)不同種類脂質(zhì)分子之間的復(fù)雜相互作用對(duì)脂膜物理化學(xué)性質(zhì)及脂膜與外界物質(zhì)相互作用過程 (例如不同脂質(zhì)分子在膜平面內(nèi)的分相行為或所謂的側(cè)向不均勻性的出現(xiàn)、脂筏或小窩的形成)的影響[14].

近年來, 單分子追蹤及分析技術(shù)的發(fā)展使得從物理學(xué)分子運(yùn)動(dòng)規(guī)律研究的角度來了解生物過程的內(nèi)在機(jī)制成為可能[15?17]. 本文構(gòu)建了二元脂質(zhì)細(xì)胞膜模型, 結(jié)合單分子熒光追蹤技術(shù)和分子動(dòng)力學(xué)模擬方法, 研究了不同的多肽濃度下、或多肽與脂質(zhì)膜相互作用過程的不同階段中, 蜂毒肽對(duì)脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)行為的影響. 我們的結(jié)果從單分子運(yùn)動(dòng)學(xué)的角度揭示了脂膜側(cè)向不均勻性對(duì)兩者相互作用的影響, 以及蜂毒肽增大細(xì)胞膜通透性和跨膜成孔的生物活性與細(xì)胞膜內(nèi)的脂分子運(yùn)動(dòng)、以及脂膜相行為之間的重要關(guān)聯(lián).

2 實(shí)驗(yàn)方法與模型

2.1 材 料

磷脂分子1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1, 2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-PE) (分子結(jié)構(gòu)式見附錄A 中圖A2) 購于AvantiPolarLipids. 蜂毒肽和鈣黃綠素購于SigmaAldrich.

2.2 樣品制備

二元脂膜以傳統(tǒng)囊泡融合法制備.將DOPC 和DPPC 以1∶1 摩爾比混合, 加入0.1%摩爾比例的羅丹明標(biāo)記的脂質(zhì)Rh-PE 后在氯仿中充分溶解 (2.0 mg/mL), 利用氮?dú)獯蹈刹⒄婵崭稍? h 確保氯仿完全揮發(fā). 加入PBS 溶液后在200W 功率下超聲45 min 令其重新分散為囊泡(0.1 mg/mL), 保持50 ℃(DPPC 的相變溫度以上)、利用100 nm 孔徑的聚碳酸酯膜擠壓21次,使其成為尺寸均勻的小囊泡分散液, DLS 測(cè)定其尺寸為110 ± 15 nm. 將小囊泡分散液轉(zhuǎn)移至基底表面親水處理的玻璃倉中, 50 ℃下孵育2h 以上,最后使用1 mL PBS 溶液分三次緩慢沖洗, 即獲得固體基底支撐的二元脂膜. 利用蠕動(dòng)泵加入一定量蜂毒肽溶液 (濃度如正文所述)、孵育30 min 后在熒光顯微鏡下原位觀察. 需要注意的是, 在實(shí)驗(yàn)中通過預(yù)摻雜少量以羅丹明化學(xué)標(biāo)記的脂質(zhì)RhBPE 分子來自組裝制備脂膜、繼而加入多肽與之發(fā)生相互作用, 這種方法可以在一定程度上避免外加染料特異性吸附的過程對(duì)脂分子運(yùn)動(dòng)行為的影響、以及染料分子對(duì)多肽與脂膜之間相互作用的干擾.

2.3 實(shí)驗(yàn)樣品表征

樣品的觀察采用裝有全內(nèi)反射 (TIRF, 100 ×)鏡頭的熒光顯微鏡(IX71; Olympus)進(jìn)行, 使用EMCCD(Andor DU-897U)采集圖片數(shù)據(jù), 采集速率30 fps. 每個(gè)實(shí)驗(yàn)體系皆進(jìn)行至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn), 每次實(shí)驗(yàn)在不同的樣品或同一樣品的不同區(qū)域共計(jì)采集6—8 組視頻數(shù)據(jù). 視頻采集后, 采用Image J 軟件MOSAIC 插件對(duì)所記錄的每一個(gè)熒光標(biāo)記脂質(zhì)的軌跡進(jìn)行分析, 從中選取有效軌跡(連續(xù)且持續(xù)時(shí)長大于3 s), 然后根據(jù)下列式子分別計(jì)算其時(shí)間平均均方位移 (time-averaged MSD,和相應(yīng)的擴(kuò)散系數(shù):

2.4 模擬方法

分子動(dòng)力學(xué)模擬采用粗?；肿觿?dòng)力學(xué)方法,并通過Gromacs 5.1.2 運(yùn)行. 脂質(zhì)、水和多肽都采用MARTINI 粗?；鲞M(jìn)行描述. 模擬按照Verlet 算法執(zhí)行,時(shí)間步長為20 fs. 所有模擬系統(tǒng)都采用NPT 系綜, 系統(tǒng)的壓強(qiáng)設(shè)定為1 bar(1 bar=105Pa), 采用Parrinello-Rahman 方法控制; 溫度采用velocity-rescale 的方法維持在300K.粗?；Ｗ又g的Lennard-Jones 勢(shì)在0—1.1 nm之間衰減為0. 靜電相互作用計(jì)算使用reactionfield 方法, 介電常數(shù)為15. 在系統(tǒng)的三個(gè)方向都使用周期性邊界條件.

2.5 模擬模型

根據(jù)MARTINI 力場的特點(diǎn), 為了使脂膜具有更好相分離能力, 我們?cè)谀M中采用飽和脂質(zhì)DPPC、不飽和脂質(zhì)dilinoleoylphosphatidylcholine(DUPC) 和膽固醇 (比例為2:2:1) 來構(gòu)造脂膜.Helger 和Siewert[18]的模擬表明, 這個(gè)體系能夠在有限的模擬時(shí)間尺度內(nèi)實(shí)現(xiàn)不同脂質(zhì)之間的相分離現(xiàn)象, 且所形成的相疇結(jié)構(gòu)等特征與DPPC/DOPC 體系類似. 蜂毒肽的晶體結(jié)構(gòu)可從protein data bank 網(wǎng)站獲得 (PDB 號(hào): 2MLT), 其粗?；Ｐ涂蛇M(jìn)一步通過Martinize 腳本構(gòu)造得到. 模擬系統(tǒng)中包含有12個(gè)蜂毒肽分子. 為了與實(shí)驗(yàn)保持一致, 我們?cè)谀M中使用脂質(zhì)相分離已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的脂膜來構(gòu)建初始構(gòu)型, 并將蜂毒肽分子均勻放置在脂膜表面.為了考察系統(tǒng)在較長時(shí)間內(nèi)的相互作用情況, 每一個(gè)系統(tǒng)都模擬了10 μs 以上.

2.6 數(shù)據(jù)處理

分別對(duì)三組實(shí)驗(yàn)體系下的所有有效分子軌跡進(jìn)行時(shí)間平均均方位移分析, 對(duì)其擴(kuò)散系數(shù)的頻數(shù)分布進(jìn)行多峰擬合; 利用秩和檢驗(yàn)法確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的置信度, 利用方差檢驗(yàn)確定小比例部分?jǐn)?shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)意義; 數(shù)據(jù)顯示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差的形式 (具體的數(shù)據(jù)處理細(xì)節(jié)參見附錄B).

3 結(jié)果與討論

3.1 蜂毒肽作用導(dǎo)致的脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的多樣性

脂分子的流動(dòng)性是細(xì)胞膜的重要特性, 受單個(gè)脂分子所處的局部膜環(huán)境和膜周圍介質(zhì)影響, 與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及行為密切相關(guān) (例如脂膜相形為、脂筏的形成、小窩的出現(xiàn)、配體受體識(shí)別、細(xì)胞膜的形變及細(xì)胞遷移等)[19,20,21].對(duì)于蜂毒肽與膜相互作用體系, 脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的變化可以直接反映多肽作用的影響, 脂分子的運(yùn)動(dòng)行為反過來也可能影響多肽的活性和功能. 另一方面, 濃度是影響蜂毒肽與脂膜相互作用的重要因素, 也是調(diào)控多肽與脂膜作用狀態(tài)的關(guān)鍵. 在較低濃度下, 蜂毒肽將吸附于細(xì)胞膜的表面 (可能伴隨多肽的寡聚和淺插膜行為); 當(dāng)多肽濃度超過某一臨界值, 多肽插膜和形成跨膜孔, 導(dǎo)致膜通透性增大[22,23]. 我們基于巨囊泡泄漏動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在3.0 μg/mL 的臨界濃度之上, 蜂毒肽的加入會(huì)導(dǎo)致染料分子(例如鈣黃綠素) 發(fā)生跨膜泄漏, 同時(shí)巨囊泡保持其連續(xù)和完整性, 意味著膜通透性增大和跨膜孔的形成;而在此濃度之下, 沒有泄漏現(xiàn)象發(fā)生(附錄A 中圖A3); 當(dāng)濃度高于8.0 μg/mL時(shí), 蜂毒肽的加入會(huì)導(dǎo)致部分巨囊泡發(fā)生破裂. 因此在單分子運(yùn)動(dòng)追蹤實(shí)驗(yàn)中, 我們選擇了介于臨界成孔泄漏和破膜濃度之間的5.0 μg/mL 和遠(yuǎn)低于臨界成孔濃度的0.5 μg/mL 來開展實(shí)驗(yàn): 按照相關(guān)文獻(xiàn)和我們前期的研究結(jié)果[6?8], 在5.0 μg/mL 濃度下, 蜂毒肽分子應(yīng)處于跨膜插入、形成膜孔的狀態(tài). 而在0.5 μg/mL濃度下, 多肽應(yīng)處于脂膜表面的吸附狀態(tài).此時(shí), 多肽會(huì)在膜表面發(fā)生肽鏈的聚集、構(gòu)象變化, 甚至淺插入等現(xiàn)象, 對(duì)膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生擾動(dòng)[5?8]. 因此, 這一狀態(tài)也等同于多肽在跨膜成孔之前的中間時(shí)間過程.總的來說, 在這兩個(gè)多肽濃度下脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的變化可以分別反映出多肽在膜吸附和導(dǎo)致膜通透性增大的劇烈擾動(dòng) (例如跨膜成孔) 兩個(gè)作用狀態(tài)下與脂膜的相互作用情況和特點(diǎn).

我們利用傳統(tǒng)囊泡融合法制備了玻璃基底搭載的DOPC/DPPC 二元單層脂膜, 以0.1%摩爾比例的Rh-PE 進(jìn)行熒光標(biāo)記, 熒光淬滅后恢復(fù)(FRAP) 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了脂膜具有良好的流動(dòng)性. 由于DOPC 與DPPC 在分子尾鏈結(jié)構(gòu)上的差異, 此時(shí)實(shí)驗(yàn)中的二元單層脂膜應(yīng)處于相分離狀態(tài)[24].相對(duì)于常用的單組分脂膜而言, 二元相分離脂膜更有助于理解真實(shí)細(xì)胞膜體系與外界物質(zhì)的相互作用過程. 之后, 我們將脂膜與0, 0.5 或5.0 μg/mL濃度的蜂毒肽溶液共同孵育30 min 后置于TIRF 顯微鏡下, 原位追蹤單個(gè)脂分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)軌跡. 圖1(a) 是0.5 μg/mL 多肽濃度下脂膜的顯微鏡照片, 部分脂分子的運(yùn)動(dòng)軌跡典型性地顯示于圖1 (b)中. 由圖1 (b)可以看出, 脂質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)呈現(xiàn)出高度不均勻性. 相同時(shí)間間隔內(nèi) (例如圖中軌跡時(shí)長皆為 3 s), 有些脂質(zhì)運(yùn)動(dòng)速率快, 能夠移動(dòng)較大的范圍; 而有些脂質(zhì)的運(yùn)動(dòng)則僅局限于很小的范圍之內(nèi), 甚至很難分辨出其位置的變化 (藍(lán)色箭頭標(biāo)注). 為了對(duì)其進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì), 我們計(jì)算了每個(gè)脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)軌跡對(duì)應(yīng)的時(shí)間平均均方位移(MSD; 典型曲線顯示于圖1(c)中). 與運(yùn)動(dòng)軌跡分布情況相似, MSD 的分布也呈現(xiàn)出高度的不均勻性.

為了了解不同濃度下的蜂毒肽對(duì)細(xì)胞膜內(nèi)脂分子運(yùn)動(dòng)行為的影響, 我們分別構(gòu)建了原始脂膜以及暴露于0.5 和5.0 μg/mL 濃度蜂毒肽的脂膜體系, 并分別計(jì)算了三種體系中單個(gè)脂分子運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散系數(shù)(DL)的數(shù)值及其概率密度分布(PDF). 如圖2所示, 對(duì)于原始脂膜, 脂質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)呈現(xiàn)雙峰分布, 其峰位分別位于0.008 μm2/s (圖2 (a) 中紅色峰)和1.778 μm2/s (藍(lán)色峰). 這說明體系中同時(shí)存在大量運(yùn)動(dòng)較慢和運(yùn)動(dòng)較快的脂分子, 這一現(xiàn)象與之前報(bào)道的DPPC/DOPC 二元脂膜在該摩爾比例下呈現(xiàn)的相分離狀態(tài)是一致的(室溫下DPPC應(yīng)處于運(yùn)動(dòng)緩慢的凝膠相 (gel phase), DOPC 應(yīng)處于運(yùn)動(dòng)較快的流體相(liquid phase))[25]. 在參照實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建了純DOPC 脂膜體系, 其中的脂分子運(yùn)動(dòng)基本呈現(xiàn)2.780 μm2/s 位置的單峰分布(附錄A 中圖A4). 并且, 在該系統(tǒng)中熒光脂分子Rh-PE 同時(shí)存在快慢兩種運(yùn)動(dòng)狀態(tài), 說明其分布于不同相疇區(qū)域, 這為我們研究脂膜相行為與多肽作用活性的關(guān)聯(lián)提供了可能.

圖1 蜂毒肽作用下脂質(zhì)分子在脂膜上的運(yùn)動(dòng)情況 (a) 熒光顯微鏡照片, 部分脂分子的運(yùn)動(dòng)軌跡以彩色線標(biāo)注; (b) 典型的脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)軌跡, 采集時(shí)間皆為3s, 部分移動(dòng)范圍較小的軌跡以藍(lán)色箭頭標(biāo)注; (c) 典型的脂質(zhì)分子時(shí)間平均均方位移分布. 蜂毒肽濃度為0.5 μg/mLFig. 1. Diffusion of lipids on a DOPC/DPPC membrane under the action of melittin at 0.5 μg/mL: (a) Microscopy image with some trajectories marked in colors; (b) typical lipid trajectories in 3 s; Some of the immobile ones are marked with blue arrows; (c) representative time-averaged MSD of lipids.

當(dāng)體系中加入濃度為0.5 μg/mL 的蜂毒肽后,脂質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)分布立即發(fā)生了變化. 原本的兩個(gè)峰的峰位皆發(fā)生輕微左移(例如從1.778 μm2/s 降至1.660 μm2/s), 并且, 在兩峰的中間出現(xiàn)了一個(gè)新的分布峰. 從圖2(b) 中的面積比例變化可以推斷,該峰的出現(xiàn)是由于部分快速運(yùn)動(dòng)的脂分子的運(yùn)動(dòng)速率變緩導(dǎo)致的(由1.778 μm2/s 降低至0.129μm2/s).根據(jù)我們之前的實(shí)驗(yàn)及模擬結(jié)果, 在此濃度下, 大部分蜂毒肽應(yīng)呈現(xiàn)脂膜表面吸附的狀態(tài), 偶爾伴有瞬時(shí)孔的產(chǎn)生[26]. 該結(jié)果表明多肽在膜表面的吸附會(huì)限制部分脂分子的運(yùn)動(dòng)行為, 顯著降低其擴(kuò)散系數(shù); 尤其是, 低速率新峰的出現(xiàn)暗示著其對(duì)脂膜相行為的影響. 繼而, 在濃度為5.0 μg/mL 蜂毒肽的作用下, 脂質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)發(fā)生了更為顯著的變化, 三個(gè)峰皆出現(xiàn)明顯的左移, 體系內(nèi)所有分子的平均擴(kuò)散系數(shù)由1.316 μm2/s 降低至0.661 μm2/s.同時(shí), 新峰的面積比例增加(由5.49%增大到8.02%). 考慮到在此濃度下多肽已經(jīng)能夠形成大量跨膜孔, 該現(xiàn)象表明多肽導(dǎo)致的膜通透性增大和跨膜孔的形成會(huì)顯著限制脂分子的擴(kuò)散行為, 以及對(duì)脂膜相行為帶來更強(qiáng)烈的擾動(dòng).

圖2 不同濃度蜂毒肽作用下脂分子擴(kuò)散系數(shù)的分布 (a) 脂質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)分布柱狀圖及擬合曲線; (b) 相應(yīng)的擬合峰中心位置和在 (a) 圖中所占面積比例, 顯示為擬合曲線面積比例(± 與原始柱狀圖面積比例之間的誤差). 三個(gè)體系對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)分別為657 (原始膜體系), 427 (蜂毒肽濃度0.5 μg/mL)和507 (蜂毒肽濃度5.0 μg/mL)Fig. 2. PDF distribution of lipid diffusion coefficients (DL) of membrane with different melittin concentrations: (a) Histograms andfittings of the PDF; (b) corresponding peak locations and area proportionsin (a). Sample numbers are 657 (pristine membrane), 427(with Mel at 0.5 μg/mL) and 507 (with Mel at 5.0 μg/mL), respectively.

3.2 蜂毒肽導(dǎo)致的脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的復(fù)雜性

脂質(zhì)分子在膜內(nèi)的運(yùn)動(dòng)非常復(fù)雜. 由于所處局部膜環(huán)境不同, 不同的脂質(zhì)分子側(cè)向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)能力也有所不同.我們基于小波變換方法分別分析了單個(gè)分子的運(yùn)動(dòng)軌跡 (附錄A 中圖A5—圖A7 及相應(yīng)方法闡述), 以獲得單個(gè)脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng) (或MSD)隨時(shí)間變化的情況. 結(jié)果顯示, 脂質(zhì)分子在膜內(nèi)的運(yùn)動(dòng)大致分為三種模式: 某些脂質(zhì)分子在整個(gè)觀察時(shí)間段內(nèi)持續(xù)受到移動(dòng)限制, 運(yùn)動(dòng)速率緩慢.這表明此類脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)強(qiáng)烈受限或者受到外界物質(zhì)的阻礙; 與之相對(duì), 有些脂質(zhì)分子在觀察時(shí)間段內(nèi)所受到的限制或阻礙很小, 能夠保持快速運(yùn)動(dòng); 此外, 也有脂質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)模式會(huì)隨著時(shí)間發(fā)生變化, 快、慢運(yùn)動(dòng)間隔發(fā)生, 說明這些脂質(zhì)分子在不同的時(shí)間階段或位置所受到的限制程度不同.相應(yīng)地, 我們將脂質(zhì)分子的這三種運(yùn)動(dòng)模式分別稱為Slow 型、Fast 型和Mixed 型 (更多細(xì)節(jié)參見附錄B). 總的來說, 這些脂質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)模式或模式的變化都是由其所處局部環(huán)境的變化導(dǎo)致的, 是脂質(zhì)分子與脂質(zhì)分子、溶劑或外界其他物質(zhì)(如多肽等) 之間復(fù)雜相互作用的直接體現(xiàn).

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) (圖3), 對(duì)于原始脂膜體系, 約69%的脂質(zhì)分子呈Mixed 型運(yùn)動(dòng)模式, 這說明大部分脂分子呈現(xiàn)快、慢交替的運(yùn)動(dòng)方式, 這一現(xiàn)象體現(xiàn)了脂分子運(yùn)動(dòng)過程中所遭受到的環(huán)境不均勻性 (例如跨越相邊界). 然而, 隨著蜂毒肽的加入和濃度的提高, Slow 型的脂質(zhì)比例逐步增加. 這說明蜂毒肽在膜表面的吸附會(huì)限制部分脂分子的運(yùn)動(dòng).而高濃度多肽對(duì)膜的劇烈擾動(dòng)會(huì)增強(qiáng)這一限制效果, 使得更多的脂分子體現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)受限的特性.這與前面的結(jié)果是一致的. 事實(shí)上, 與原始脂膜相比, 蜂毒肽的加入導(dǎo)致了Mixed 型脂分子所占比例大幅下降(由69%降至36%), 降低的該部分脂分子分別呈現(xiàn)了Slow 和Fast 型運(yùn)動(dòng)模式, 這暗示著蜂毒肽的吸附和插膜等作用傾向于發(fā)生在Mixed 型運(yùn)動(dòng)的脂分子區(qū)域, 降低了該部分脂分子運(yùn)動(dòng)過程中所遭受到的環(huán)境不均勻性, 這應(yīng)是多肽對(duì)脂膜相分離行為的干擾導(dǎo)致的.

3.3 蜂毒肽對(duì)脂膜相邊界的干擾

圖3 脂質(zhì)分子的三類運(yùn)動(dòng)模式及其在不同體系中的比例分布. 右圖為典型的三類運(yùn)動(dòng)模式的分子軌跡, 藍(lán)色和紅色分別對(duì)應(yīng)緩慢和快速運(yùn)動(dòng)階段Fig. 3. Three different types of lipid diffusion modes and their PDFs in three conditions of membrane without or with melittin exposure. Representative trajectories are shown on the right.

圖4 蜂毒肽對(duì)脂膜相分離行為的干擾 (a) 蜂毒肽與相分離脂膜相互作用過程的分子動(dòng)力學(xué)模擬截圖.上圖是俯視圖, 下圖是側(cè)視圖. 紅色對(duì)應(yīng)蜂毒肽, 藍(lán)色代表DPPC 脂分子頭基, 綠色為DUPC 脂分子頭基. 側(cè)視圖中脂質(zhì)尾鏈未顯示; (b) 吸附或插膜狀態(tài)下多肽與周圍脂質(zhì)分子的相互作用細(xì)節(jié). 顏色同 (a). 此外, 多肽周圍的部分脂分子尾鏈以黃色棒表示, 遠(yuǎn)離多肽的脂質(zhì)分子僅顯示頭部 (灰色); (c)相邊界長度(L) 在蜂毒肽加入前后隨時(shí)間的變化. 圖(a) 中的時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)標(biāo)記于圖(c) 中. 插圖為多肽作用下單個(gè)脂分子擴(kuò)散MSD 的等值分布圖, 其中以紅色圓圈標(biāo)出多肽位置 P/L = 12/512Fig. 4. Interaction between melittin and a phase-separated bilayer: (a) Snapshots showing the melittin-inducedporeformation process. Top: top view, bottom: side view. Red: melittin, blue: DPPC headgroup, green: DUPC headgroup. For clarity, lipid tails are not shown; (b) interaction details between Mel (red) and the surrounding lipids. Color codes are the same as in (a), with tails of the surrounding lipids in yellow, and heads of lipids away from the peptides in grey; (c) time evolution of phase boundary length (L) before and after the addition of melittin at P/L = 12/512. The time points of (a) are marked correspondingly in (c).

為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的推斷, 我們采用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法追蹤了蜂毒肽與多組分脂質(zhì)膜相互作用和成孔的過程. 如圖4 所示, 原始脂膜呈現(xiàn)清晰的兩相分離狀態(tài); 蜂毒肽的加入(多肽與脂分子之間的摩爾比為P/L=12/512) 會(huì)導(dǎo)致膜孔的形成.多肽與脂膜的相互作用具有兩個(gè)顯著的特點(diǎn).其一, 多肽在膜表面會(huì)逐步聚集形成團(tuán)簇, 并且, 無論多肽是處于表面吸附還是跨膜插入狀態(tài), 它都會(huì)對(duì)其周圍的脂質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸引作用 (圖4 (b)),從而顯著限制吸附區(qū)域脂質(zhì)的運(yùn)動(dòng), 使脂分子的運(yùn)動(dòng)變緩(附錄A 中圖A8). 這與實(shí)驗(yàn)中觀察到的脂質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)下降以及快速運(yùn)動(dòng)脂分子比例降低的結(jié)果(圖2) 是一致的. 其次, 模擬結(jié)果顯示, 多肽對(duì)膜的作用顯著傾向于發(fā)生在脂膜兩相邊界附近區(qū)域, 這可能是由于相邊界區(qū)域脂膜呈現(xiàn)相對(duì)較多的結(jié)構(gòu)缺陷供多肽實(shí)現(xiàn)插膜成孔功能.基于單個(gè)脂分子短時(shí)均方位移變化, 我們定量分析了由于多肽作用導(dǎo)致的脂膜不同區(qū)域的脂分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)變化,如圖4(c)插圖所示, 由圖可以發(fā)現(xiàn), 多肽在相邊界區(qū)域的作用能起到模糊相分離的效果, 并對(duì)多肽吸附區(qū)域及周邊脂分子的運(yùn)動(dòng)行為產(chǎn)生了明顯的擾動(dòng).為了分析蜂毒肽對(duì)脂膜相分離行為的影響, 我們定量統(tǒng)計(jì)了整個(gè)相互作用過程中相邊界的長度值(L) 隨時(shí)間的變化, 結(jié)果顯示, 在蜂毒肽的吸附和成孔過程中, 脂膜兩相的邊界長度出現(xiàn)波動(dòng)并顯著增大(圖4 (c)). 由于在加入多肽之前脂質(zhì)體系的相分離已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài), 因此, 此時(shí)相邊界長度的變化清楚地表明了蜂毒肽對(duì)脂膜相行為的干擾和破壞性, 令兩相分離程度降低.相分離行為被模糊化的現(xiàn)象降低了該區(qū)域脂分子環(huán)境的不均勻性, 由此降低了相邊界對(duì)附近區(qū)域脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的限制, 改變了脂質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)行為規(guī)律 (例如從Mixed 模式轉(zhuǎn)變?yōu)镕ast 模式或Slow 模式). 這些模擬結(jié)果很好地解釋了實(shí)驗(yàn)中觀察到的由于蜂毒肽所導(dǎo)致的脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)行為的變化趨勢(shì)(如脂質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)新的分布峰出現(xiàn)和Fast/Slow 模式脂質(zhì)的增加等), 并證明了蜂毒肽生物活性與脂分子運(yùn)動(dòng)模式以及細(xì)胞膜相行為之間的關(guān)聯(lián).

4 結(jié) 論

在本工作中, 我們結(jié)合單分子熒光追蹤技術(shù)和計(jì)算機(jī)分子動(dòng)力學(xué)模擬方法, 從單分子運(yùn)動(dòng)行為分析的角度, 研究了蜂毒肽與二元脂膜的界面相互作用動(dòng)力學(xué)過程, 尤其是該過程中, 處于不同作用狀態(tài)的多肽(吸附于膜表面的階段以及導(dǎo)致膜通透性增大和跨膜成孔的階段) 對(duì)脂分子在膜內(nèi)運(yùn)動(dòng)行為的影響, 以及二者之間的關(guān)聯(lián). 實(shí)驗(yàn)及模擬結(jié)果顯示, 脂分子在二元脂膜內(nèi)的運(yùn)動(dòng)呈現(xiàn)快、慢兩種狀態(tài); 蜂毒肽的表面吸附會(huì)顯著降低部分快速運(yùn)動(dòng)的脂質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速率, 而多肽對(duì)膜的進(jìn)一步擾動(dòng)和成孔會(huì)進(jìn)一步加劇這一影響; 同時(shí), 會(huì)令所有脂分子的運(yùn)動(dòng)速率發(fā)生不同程度的減慢. 并且, 蜂毒肽傾向作用于多元脂膜相分離的邊界區(qū)域, 擾動(dòng)并降低脂膜相分離的程度, 進(jìn)而降低該區(qū)域單個(gè)脂分子運(yùn)動(dòng)過程中所遭受到的環(huán)境不均勻性, 降低相邊界對(duì)脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的限制. 本文從描述單分子運(yùn)動(dòng)行為的角度對(duì)蜂毒肽跨膜成孔實(shí)現(xiàn)殺菌功能的過程進(jìn)行了研究, 從一個(gè)新的角度來闡述兩者的相互作用分子機(jī)制. 此外, 對(duì)于今后的實(shí)驗(yàn), 一個(gè)重點(diǎn)可以放在雙色單分子成像實(shí)驗(yàn)上, 通過同時(shí)對(duì)多肽和脂質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)對(duì)不同組分分子的運(yùn)動(dòng)情況的追蹤和刻畫, 這將有助于全面準(zhǔn)確地理解多肽作用和脂質(zhì)運(yùn)動(dòng)之間的關(guān)聯(lián). 總的來說, 本工作表明抗菌肽的膜活性與脂膜的相行為密切相關(guān),證明了細(xì)胞膜的相疇邊界是抗菌肽發(fā)揮生物活性的重要作用點(diǎn). 哺乳動(dòng)物細(xì)胞與細(xì)菌在膜組分和結(jié)構(gòu)上有明顯區(qū)別, 相應(yīng)的相疇結(jié)構(gòu)和相邊界組分也有所不同. 因此, 本文的結(jié)果表明針對(duì)這些差異來調(diào)節(jié)蜂毒肽與不同細(xì)胞膜相疇的作用方式可能是實(shí)現(xiàn)抗菌肽靶向選擇性的有效途徑之一. 這對(duì)開發(fā)新型抗菌藥物具有一定的參考意義.

附錄A 利用小波變換處理脂質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)軌跡

小波變換可以將一條軌跡中不同的運(yùn)動(dòng)模式區(qū)別開來.以圖A5 (a) 所示的軌跡 (X坐標(biāo)隨時(shí)間的變化) 為例. 這條軌跡可以基于Haar 小波分別做第2—64 階的變換, 其中每一階的變換系數(shù)由下式計(jì)算得到:

圖A5 (b) 顯示了這條軌跡相應(yīng)的小波變換系數(shù). 對(duì)于不同階的變換, 系數(shù)所包含的信息也有所不同, 圖A6 (a)—圖A6(c)分別是第2 階、32 階和64 階對(duì)應(yīng)的系數(shù). 因此選擇適當(dāng)?shù)南禂?shù)有助于區(qū)分軌跡中所包含的不同信息. 這里, 根據(jù)相對(duì)的變化程度, 我們選擇第32 階系數(shù)作為研究對(duì)象, 通過計(jì)算閾值δ來區(qū)分軌跡中不同的運(yùn)動(dòng)模式. 閾值δ的計(jì)算可通過低階變換系數(shù) (如第2 階) 計(jì)算得到:

圖A6 (d) 顯示了此軌跡經(jīng)小波變換得到的第32 階系數(shù)以及相應(yīng)的閾值紅線 (±δ). 紅線所包含的陰影部分是軌跡中運(yùn)動(dòng)較慢的部分, 而在閾值以外的部分即可認(rèn)為是軌跡中運(yùn)動(dòng)變化較快的部分. 圖A7 (a)顯示了經(jīng)過區(qū)分后的軌跡, 紅色和藍(lán)色分別表示了軌跡中運(yùn)動(dòng)較快和較慢的部分.為了驗(yàn)證此方法的效果, 我們分別計(jì)算了軌跡中紅色和藍(lán)色部分所對(duì)應(yīng)的均方位移. 如圖A6 (b)所示, 兩個(gè)部分的擴(kuò)散方式的確有明顯的區(qū)別.

圖A1 蜂毒肽的 (a) 氨基酸序列和 (b) 吸附在膜表面后的a 螺旋結(jié)構(gòu)Fig. A1. The sequence and a-helical structure of melittin.

圖A2 DOPC, DPPC, Rh-PE 分子的結(jié)構(gòu)式Fig. A2. A2. Molecular structure of DOPC, DPPC and Rh-PE.

脂分子運(yùn)動(dòng)模式的定量區(qū)分: Slow 型、Fast 型和Mixed 型.

我們對(duì)每一條脂質(zhì)分子的軌跡進(jìn)行了小波變換處理,其中紅色部分即為fast 部分, 藍(lán)色部分為slow部分, 相應(yīng)地, 我們計(jì)算了這兩部分軌跡的均方位移, 從中發(fā)現(xiàn)紅色部分的斜率均大于2 (長距離擴(kuò)散), 而藍(lán)色部分的斜率均小于0.1 (短距離徘徊).

附錄B 數(shù)據(jù)處理

1 數(shù)據(jù)采集及樣本數(shù)

我們的實(shí)驗(yàn)包含三個(gè)體系, 即原始膜、加入0.5 μg/mL濃度蜂毒肽、加入5.0 μg/mL 濃度蜂毒肽體系; 每個(gè)體系分別進(jìn)行了至少三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn), 每次實(shí)驗(yàn)在不同的樣品或同一樣品的不同區(qū)域采集共計(jì)6—8個(gè)視頻片段. 一般來說, 視頻視野中熒光分子信號(hào)總數(shù)約為200—500個(gè), 其中經(jīng)篩選后得到的有效軌跡約占總數(shù)的25%左右 (篩選標(biāo)準(zhǔn)為軌跡必須連續(xù)且持續(xù)時(shí)長大于3 s). 每一個(gè)體系所采集到的有效軌跡的數(shù)量 (即PDF 的實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)) 如表B1所列.

圖A3 包裹鈣黃綠素的巨單層囊泡在濃度為 (a) 0.5 和 (b) 5.0 μg/mL 蜂毒肽溶液中的熒光共聚焦顯微照片, 包括綠色 (鈣黃綠素) 通道、紅色 (脂分子) 通道和復(fù)合通道. 右圖為對(duì)應(yīng)的蜂毒肽作用方式的卡通圖, 包括膜表面吸附和跨膜插入Fig. A3. Confocal images of calcein-encapsulated GUVs exposed to melittin at 0.5 or 5.0 μg/mL. The images were taken in the green (calcein), red (lipid) and overlaid channels. Cartoons on the right refer to the corresponding action states of peptides, including surface adsorption and transmembrane insertion.

圖A4 純DOPC 脂膜中的脂分子擴(kuò)散系數(shù)分布. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來自3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn), 樣本數(shù)為404, 擬合曲線的峰位位置2.780 μm2/sFig. A4. PDF of lipids in a pure DOPC bilayer. The data were obtained from three times of independently repeated tests, with a sample number of 404. Peak of the fitted curve locates at 2.780 μm2/s.

2 實(shí)驗(yàn)置信度分析

我們繼而使用秩和檢驗(yàn)(Gibbons J D, Chakraborti S 2011Nonparametric Statistical Inference(5th Ed.) (Boca Raton: Chapman & Hall/CRC Press); Hollander M,Wolfe D A 1999Nonparametric Statistical Methods(Hoboken: John Wiley & Sons, Inc.)) 法對(duì)三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行了分析. 選擇秩和檢驗(yàn)的原因是它不依賴于總體分布的具體形式, 而t檢驗(yàn)等一般要求數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布.

圖A5 小波變換法處理脂分子運(yùn)動(dòng)模式舉例 (a) 原始軌跡中X 坐標(biāo)隨時(shí)間變化曲線; (b) 從第2 階到第64 階的連續(xù)小波變換系數(shù)Fig. A5. Example of lipid trajectories handled by wavelet:(a) X-coordinate profile of the original trajectory;(b) wavelet coefficients from the 2 nd to the 64 th.

圖A6 第2 階 (a)、32 階 (b) 和64 階 (c) 對(duì)應(yīng)的小波變換系數(shù); (d) 此軌跡經(jīng)小波變換得到的第32 階系數(shù)以及相應(yīng)的閾值紅線Fig. A6. The wavelet coefficients of the 2 nd, 32 th and 64 th scale; (d) the 32 th wavelet coefficient and the corresponding red line of threshold value.

圖A7 (a) 第32階系數(shù)小波變換區(qū)分后的軌跡曲線, 紅色和藍(lán)色分別對(duì)應(yīng)軌跡中運(yùn)動(dòng)較快和較慢的階段;(b) 與圖 (a) 中紅色、藍(lán)色階段相對(duì)應(yīng)的MSD 分布Fig. A7. (a) Trajectory discriminated by wavelet using the 32 th scale coefficient, whose red part refers to the “fast” motion type and blue part refers to the “slow” motion type;(b)the corresponding MSD distributions of the red and blue parts.

選擇置信區(qū)間為95% (a= 0.05),p為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總體一致的概率,h為檢驗(yàn)結(jié)果. 由表B2 中三組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析, 擴(kuò)散系數(shù)的分布大致相當(dāng),h為0, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信.

3 脂分子擴(kuò)散系數(shù)PDF 分布 (正文圖2) 的統(tǒng)計(jì)價(jià)值討論

針對(duì)這個(gè)問題我們計(jì)算了每一個(gè)體系所有擴(kuò)散系數(shù)的均值和方差 (標(biāo)準(zhǔn)差), 如表B3 所更. 由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出,方差 (標(biāo)準(zhǔn)差) 相對(duì)于均值顯然是不可忽略的. 使用均值這一指標(biāo)雖然可以反應(yīng)體系的一些變化, 但是掩蓋了體系中的一些關(guān)鍵的信息. 而如此之大的方差也意味著那些占比較小的部分不可忽略、具備統(tǒng)計(jì)價(jià)值.

表B1 實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)Table B1. Number of samples in different experimental conditions.

圖A8 模擬體系中蜂毒肽加入前后脂質(zhì)分子對(duì)應(yīng)的MSD 分布. 蜂毒肽加入后, 脂質(zhì)運(yùn)動(dòng)明顯變慢Fig. A8. Changes in MSD distributions of lipids before and after the addition of Mel in the simulations.

表B2 基于三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的秩和檢驗(yàn)置信度分析Table B2. Confidence analysis using rank sum test based on three independently repeated experiments.

表B3 脂分子擴(kuò)散系數(shù)PDF 分布的方差分析Table B3. Variance analysis of the DL distribution in different conditions.