孔 麗1，2 左華江2 吳春鳳1

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)，廣西 柳州 545006

慢性膽囊炎是一種膽囊慢性炎癥病變[1]，屬于慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為反復(fù)右上腹疼痛或不適、 腹脹、噯氣、厭油膩[2-3]。女性患病率高于男性[3]，且中老年群體為高發(fā)群體[1]。慢性膽囊炎屬中醫(yī)“膽脹”范疇，以右脅脹痛為主，針對(duì)該病的治療，近年來(lái)采用中醫(yī)治療，取得了較好的療效。

薄荷作為唇形科薄荷屬植物[4]，具有抗病毒、興奮中樞、抗菌[5]、保肝利膽、抑菌、抗氧化、抗炎[6]等藥理作用，在《藥性論》等多部古代醫(yī)藥典籍中，薄荷均被記載具有發(fā)汗解表作用，可用于溫病的治療。薄荷的主要成分包括揮發(fā)油、黃酮類等。揮發(fā)油中主要成分為左旋薄荷醇，其含量高達(dá)62%～87%[4，7，8]，左旋薄荷酮等。研究表明，薄荷醇和薄荷酮有明顯的利膽作用，其中薄荷醇在膽道的主要代謝產(chǎn)物中起了利膽的作用[4-5]。薄荷中的黃酮類成分中最主要的成分為蒙花苷，具有良好的抗菌作用[7]。雖然薄荷中的揮發(fā)油成分據(jù)報(bào)道已有治療慢性膽囊炎的作用[5]，但其活性成分及其相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚。因此，研究薄荷中活性成分、作用靶點(diǎn)及其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示薄荷治療慢性膽囊炎具有重要意義。

傳統(tǒng)的藥理學(xué)研究大多是基于“單因素觀察”，即證明藥物的某一方面的作用，需要通過對(duì)照試驗(yàn)、施加單一因素作用，以揭示藥物對(duì)于疾病的作用機(jī)制[9]，而中藥具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)[10]，因而傳統(tǒng)藥理學(xué)的研究方法與中藥的研究理念相悖。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)等多種學(xué)科技術(shù)發(fā)展結(jié)合的結(jié)果，其以藥物、靶點(diǎn)以及疾病之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過網(wǎng)絡(luò)分析手段，從整體性的角度出發(fā)，研究中藥的特征，觀察藥物對(duì)疾病的影響，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)用到中藥中能夠提升中藥研究的現(xiàn)代化水平[11]。程曉平等[12]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了獨(dú)活治療骨關(guān)節(jié)的作用機(jī)制；李剛等[13]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)淫羊藿抗骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制進(jìn)行了分析；王韌等[14]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從分子角度分析魚腥草治療支氣管炎的作用機(jī)制。因此本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)薄荷中的活性成分治療慢性膽囊炎的作用機(jī)制進(jìn)行探討，可以提高其治療效果，臨床試驗(yàn)的成功率以及降低其毒副作用。

1 材料和方法

1.1 薄荷中活性成分的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP)(http://tcmspw.com/)，檢索薄荷的化學(xué)成分，并根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報(bào)道，篩選出薄荷中可能有效的活性成分。

1.2 潛在治療靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索上述薄荷相關(guān)活性成分的靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入U(xiǎn)niprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，并限定物種為人類，將檢索得到的所有靶點(diǎn)校正為該靶點(diǎn)的基因名稱，用于后續(xù)其它工作的分析。通過GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“gallbladder”、“Chronic cholecystitis”為檢索關(guān)鍵詞，搜索慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)，將其與上述所得薄荷活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到交集靶點(diǎn)，即為薄荷活性成分治療慢性膽囊炎的潛在治療靶點(diǎn)。

1.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將薄荷活性成分與潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape Version3.7.0軟件，構(gòu)建薄荷活性成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將潛在治療點(diǎn)導(dǎo)入String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人，設(shè)置最低相互作用閾值為0.4，獲取蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果以TSV格式保存，保留node1、noe2、Combined score信息，將這三個(gè)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，保存分析結(jié)果，將節(jié)點(diǎn)大小和顏色設(shè)置用于反映Degree的大小，邊的粗細(xì)用于反映Combined score的大小，獲取最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。本研究基于以下參數(shù)：平均最短路徑(Average Shortest Path Length)、介數(shù)中心性(Betweenness Centrality)、中心接近度(Closeness Centrality)、聚類系數(shù)(Clustering Coefficient)、度值(Degree)，以評(píng)估節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

1.5 生物學(xué)過程與通路分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過程與通路分析，將潛在治療靶點(diǎn)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為人類進(jìn)行分析，取P<0.05，得到生物學(xué)過程與通路分析結(jié)果。

1.6 潛在治療靶點(diǎn)靶點(diǎn)類型歸屬 利用DisGeNET(http://www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，將潛在治療靶點(diǎn)依次輸入數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取靶點(diǎn)類型信息(Protein Class)。

2 結(jié)果

2.1 薄荷中活性成分的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得薄荷化學(xué)成分164個(gè)，根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報(bào)道，篩選出15個(gè)潛在的活性成分。詳見表1。

表1 薄荷活性成分信息

2.2 潛在治療靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過TCMSP數(shù)據(jù)檢索薄荷活性成分相關(guān)靶點(diǎn)，將這些靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人，進(jìn)行靶點(diǎn)基因名稱的校正，去重后共得到57個(gè)靶點(diǎn)(其中Fortunellin、Linarin無(wú)相關(guān)作用靶點(diǎn))。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，以“gallbladder”、“Chronic cholecystitis”為檢索關(guān)鍵詞，搜索得到慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)，將活性成分作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配(見圖1)，得到40個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

2.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將薄荷活性成分和潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖2。圖中共涉及53個(gè)節(jié)點(diǎn)(13個(gè)化合物，40個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，由于Fortunellin、Linarin無(wú)作用靶點(diǎn)，故在網(wǎng)絡(luò)中不體現(xiàn))，69條邊。不同的顏色和形狀代表薄荷活性成分和靶點(diǎn)，綠色菱形節(jié)點(diǎn)代表薄荷活性成分，藍(lán)色三角形代表潛在治療靶點(diǎn)，邊代表活性成分與潛在作用靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將上述作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人，獲取蛋白相互作用關(guān)系，以TSV格式保存其結(jié)果。保留node1、noe2、Combined score信息，將這三個(gè)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，見?。圖中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，由圖3可見，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)共涉及38個(gè)節(jié)點(diǎn)，266條邊(其中PRSS1，CHRM3與其它靶點(diǎn)無(wú)相互作用，故沒有在網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn))。節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示Degree值的大小，節(jié)點(diǎn)越大，顏色逐漸變深對(duì)應(yīng)的Degree值越大。邊的粗細(xì)表示Combine score，邊越粗Combine score越大。經(jīng)計(jì)算后可知，平均連接度約為14，平均最短路徑長(zhǎng)度約為1.71，平均介數(shù)約為0.02，平均聚類系數(shù)約為0.7。具有高度值(連接度)和介數(shù)中心的靶點(diǎn)可被認(rèn)為是中心靶點(diǎn)，在此網(wǎng)絡(luò)中，度值和介數(shù)中心均超過平均值的有10個(gè)，分別是EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG，可認(rèn)為這10個(gè)是薄荷治療慢性膽囊炎的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

表2 潛在治療靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩员?/p>

2.5 生物學(xué)過程與信號(hào)通路分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過程與信號(hào)通路通路分析，設(shè)定P<0.05，篩選靠前的生物過程，主要包括對(duì)類固醇激素的反應(yīng)(response to steroid hormone)、對(duì)酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)(response to acid chemical)、上皮細(xì)胞增殖(epithelial cell proliferation)、對(duì)銨離子的響應(yīng)(response to ammonium ion)、血液循環(huán)(blood circulation)、細(xì)胞對(duì)過氧化氫的反應(yīng)(cellular response to hydrogen peroxide)等。潛在治療靶點(diǎn)主要富集在13條信號(hào)通路，包括Pathways in cancer、prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、PI3K-Akt signaling pathway、Breast cancer、HIF-1 signaling pathway等信號(hào)通路。分析結(jié)果見圖4。

2.6 潛在治療靶點(diǎn) 靶點(diǎn)類型歸屬將40個(gè)潛在治療靶點(diǎn)依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取其對(duì)應(yīng)的類型，詳見表3。結(jié)果表明薄荷活性成分治療慢性膽囊炎過程中有信號(hào)分子、轉(zhuǎn)錄因子、受體、蛋白、酶等物質(zhì)的參與。

表3 潛在治療靶點(diǎn)的類型歸屬

3 結(jié)論與討論

薄荷具有保肝利膽的作用，是治療慢性膽囊炎的有效藥物，以其揮發(fā)油作為主要成分的藥物在治療膽囊相關(guān)疾病已有報(bào)道[5]。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)理念和技術(shù)，本研究對(duì)薄荷治療慢性膽囊炎作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，并根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報(bào)道篩選得到有效活性成分15種，獲取活性成分靶點(diǎn)，將其與慢性膽囊炎相關(guān)的靶點(diǎn)取交集，共得到40個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，將潛在治療靶點(diǎn)作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG在網(wǎng)絡(luò)的中心位置，具有較高的Degree值和介數(shù)中心性，可能為薄荷治療慢性膽囊炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)是原癌基因的一種表達(dá)產(chǎn)物，其表達(dá)部位在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜上，在慢性膽囊炎的組織中，EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率約為20%[15]；c-Myc是MYC原癌基因族中的一員，c-Myc被異常激活后，其表達(dá)明顯升高，引起細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制有關(guān)分化的基因表達(dá)，降低細(xì)胞的終末分化[16]；IL6是炎癥性細(xì)胞因子，反應(yīng)了機(jī)體對(duì)炎癥及感染時(shí)的反應(yīng)狀態(tài)，而慢性膽囊炎患者的膽汁和血清中IL6呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[17]。

潛在治療靶點(diǎn)涉及凋亡過程的負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、神經(jīng)元凋亡過程、積極調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖等生物過程；核、基底外側(cè)質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組成；類固醇結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合等分子功能。通路分析結(jié)果顯示，薄荷治療慢性膽囊炎的靶點(diǎn)主要涉及Pathwaysincancer、prostatecancer、AGE-RAGEsignalingpathwayindiabeticcomplications、PI3K-Aktsignalingpathway、Breastcancer、HIF-1signalingpathway等信號(hào)通路。

綜上所述，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究薄荷治療慢性膽囊炎的潛在作用機(jī)制，從而探明了薄荷在治療慢性膽囊炎的作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，并明確了薄荷通過多種活性成分對(duì)多種靶點(diǎn)發(fā)揮其治療慢性膽囊炎的作用機(jī)制，這為后續(xù)薄荷在慢性膽囊炎治療上的應(yīng)用提供了方向。